索拉非尼联合吉西他滨对 HepG2 细胞增殖具有初步的相加性抑制作用，并可引起 p-ERK 和 VEGF 表达的相应变化，同时抑制 NOD/SCID 小鼠肝肿瘤的生长。
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研究文章
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索拉非尼联合吉西他滨对 HepG2 细胞增殖具有初步的相加性抑制作用，并可引起 p-ERK 和 VEGF 表达的相应变化，同时抑制 NOD/SCID 小鼠肝肿瘤的生长。
由于药物耐药性和治疗选择有限，肝癌仍然是导致癌症相关死亡的主要原因。迫切需要探索新的治疗策略以改善患者预后。本初步研究提出了一项评估索拉非尼与吉西他滨联合用药在肝癌中潜在作用及其作用机制的实验方案。采用肝癌细胞系 HepG2，并建立非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠异种移植模型。文中演示了关键实验步骤，包括：（1）HepG2 细胞培养及药物处理；（2）MTT 实验的设置、孵育与吸光度读数；（3）ERK 和 p-ERK 蛋白的提取、SDS-PAGE 电泳、转膜及免疫印迹分析；（4）在 NOD/SCID 小鼠中建立皮下异种移植瘤；（5）肿瘤测量与体积计算；以及（6）对肿瘤组织切片进行 VEGF 免疫组化染色。同时提供了关键操作要点、故障排除建议和仪器参数说明。在 72 小时条件下，索拉非尼（3 µmol/L）与吉西他滨（10 µmol/L）联合用药的抑制率达到 71.23% ± 6.76%，q 值为 1.35，提示在此特定剂量组合和实验条件下具有 协同效应 。与对照组相比，联合治疗组表现出 p-ERK 表达降低、肿瘤体积减小以及 VEGF 免疫染色强度在定性上更低。这些数据表明 p-ERK 表达下调与观察到的抗增殖效应之间存在相关性，但尚未确立因果关系。在 HepG2 细胞及 NOD/SCID 小鼠异种移植模型中，索拉非尼与吉西他滨联用显示出初步的抗增殖潜力，并伴随 VEGF 表达下降；然而，由于未进行微血管密度或功能性血管分析，该结果尚不能构成抗血管生成活性的直接证据。本可重复的实验方案为在肝细胞癌（HCC）模型中评估药物组合提供了实用框架，也可适用于其他靶向治疗与化疗方案的组合研究，但在得出任何临床意义之前，仍需进一步开展机制研究和剂量验证实验。
肝癌是最常见且致死率最高的癌症之一，也是增长速度最快的恶性肿瘤之一1,2尽管肝癌的发病率已呈下降趋势，但其总体疾病负担仍在持续增加。2022年全球流行病学数据显示，根据全球癌症观察站（GLOBOCAN）2022年在线数据库，肝癌的年龄标化发病率为每10万人15.0例，而年龄标化死亡率为每10万人26.7例，使其成为癌症相关死亡的第二大原因3目前，由于肝癌缺乏有效的治疗方法，且其发病隐匿，大多数患者在确诊后一年内死亡。索拉非尼是首个获批用于临床的多靶点激酶抑制剂，其靶点包括受体酪氨酸激酶，如表皮生长因子受体（EGFR）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）以及丝氨酸/苏氨酸激酶。4,5索拉非尼是一种口服多激酶抑制剂，通过靶向多种生长因子通路，在肝癌中发挥抗增殖和抗血管生成作用。历史上，索拉非尼是首个被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于晚期或不可切除肝癌患者的首选用全身治疗药物。6. 然而，目前晚期肝细胞癌（HCC）的一线治疗格局已显著扩展。当前推荐的治疗方案包括免疫检查点抑制剂联合疗法阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗、仑伐替尼，以及双重免疫治疗组合度伐利尤单抗联合曲美木单抗等。尽管如此，索拉非尼仍是一种重要的一线治疗选择，尤其是在免疫治疗组合不易获得或存在禁忌证的地区。鉴于索拉非尼在肝癌治疗中的广泛应用，药物相关不良事件一直受到关注7在2006年至2023年美国食品药品监督管理局不良事件报告系统（FAERS）数据库分析中，索拉非尼的不良事件主要涉及消化系统、皮肤和皮下组织，以及感染和损伤等非特异性身体不适7. 尽管部分晚期肝癌患者可能从索拉非尼治疗中获益，但大多数患者最终会产生耐药性或治疗失败，导致预后不良8,9,10. 尽管索拉非尼已被用于治疗，但仅有约30%的肝细胞癌患者从中获益；此外，多数应答者常在6个月内产生耐药性。11参与索拉非尼耐药的分子通路包括细胞外信号调节激酶（ERK）/磷酸化ERK（p-ERK）、蛋白激酶B（Akt）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/雷帕霉素哺乳动物靶蛋白（mTOR）、缺氧诱导因子1α （HIF-1α)/HIF-2α以及自噬相关通路，其中ERK/p-ERK在本研究中被特别强调并选为研究对象11吉西他滨是一种胞苷类似物，进入体内后可生成二氟胞苷二磷酸和二氟胞苷三磷酸，二者对DNA合成具有不同的抑制作用12在肝胆系统恶性肿瘤中，吉西他滨已被评估作为联合化疗方案的组成部分。然而，临床报道显示吉西他滨也更容易产生耐药性，从而限制了其治疗效果12,13. 因此，有效且高效地确定最佳药物治疗方案极具挑战性。最近的研究表明，基于一种新型肿瘤干性生物标志物预测，吉西他滨联合索拉非尼可能具有增强的治疗效果。14然而，据我们所知，尚无研究采用 HepG2 细胞及非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠肝细胞癌异种移植模型，专门探讨该组合在肝癌中的作用。因此，尚缺乏直接验证索拉非尼与吉西他滨在肝癌中具有协同效应的实验依据。
本文所述实验方法虽被广泛使用，但极少以适合初入科研领域的研究人员进行重复操作的详细可视化逐步形式呈现。我们假设索拉非尼与吉西他滨联用可协同抑制肝癌细胞增殖及肿瘤生长，且该效应与ERK/p-ERK通路的下调以及血管内皮生长因子（VEGF）介导的血管生成减少相关。本研究旨在初步探讨索拉非尼联合吉西他滨对HepG2肝癌细胞系增殖的抑制作用 体外 和 体内 及其机制（补充图1本研究的新颖性体现在三个方面：（1）首次在肝癌中使用广泛采用的 HepG2 细胞系及相应的 NOD/SCID 小鼠模型，专门测试索拉非尼与吉西他滨的联合疗效；（2）探究了目前研究尚少的 ERK/p-ERK 通路作为潜在作用机制；（3）为该联合方案在肝癌中的相加效应提供了直接的实验依据，而非计算预测结果。这些特点使本研究区别于以往在其他肿瘤类型或采用不同实验模型（尤其是基于索拉非尼的治疗方案）所开展的联合疗法研究。
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本研究获得浙江大学实验动物福利与伦理审查委员会的伦理批准（批准号：ZJU20250049）。
动物与分组
共购买了40只4至5周龄、体重为18–20 g的雌性NOD/SCID小鼠，购自持有许可证的商业供应商（许可证号：SCXK（上海）2013-0006），并饲养在特定病原体阴性（SPF）级别的动物房中。所有动物实验方案均遵循标准指南。实验期间，动物可自由进食和饮水，以每笼5只进行群养，饲养环境为温湿度和光照严格控制的SPF动物房，室温维持在22 ± 2 °C，相对湿度为50%–60%，光照/黑暗循环为12/12小时。动物可自由摄取食物和水，每2周监测一次体重。当小鼠出现持续性疼痛、恶病质、肿瘤溃烂、肿瘤尺寸达到最大直径2 cm，或其他不可逆的健康问题时，根据动物伦理委员会批准的人道终点标准，实施安乐死：腹腔注射≥150 mg/kg体重的0.45%戊巴比妥钠，随后通过呼吸和心跳停止、角膜反射消失等指标确认死亡；必要时辅以二次物理方法。样本量（每组n = 10）基于功效分析确定，假设效应量为1.2（来自预实验数据），α = 0.05，β = 0.20（80%功效），并额外预留20%的损耗率。肿瘤接种操作在分组给药前进行（异种移植建立详见下文）。
在肿瘤接种并确认成瘤后，采用随机数字表法将小鼠随机分为4组：对照组、索拉非尼组、吉西他滨组以及索拉非尼联合吉西他滨组，每组10只小鼠（每笼5只），用于构建NOD/SCID小鼠移植瘤模型。由于建模过程中肿瘤组织可能导致NOD/SCID小鼠一般状况不佳甚至死亡，且考虑到统计分析通常需要足够的有效样本量，因此每组至少纳入10只小鼠。随机分组由独立的技术人员完成，并对笼具进行标记；在给药和肿瘤测量过程中未实施盲法，这是本研究的一个重要局限性。其余组织取样、生化检测及病理学评估均由经设盲的实验人员完成。统计分析也由仅能访问编码文件的统计学家在设盲状态下进行，直至统计完成并解盲数据。所有动物均被纳入最终分析。两种药物均选择腹腔注射途径，以确保全身吸收和稳定的生物利用度；每日一次给药方案基于既往药代动力学研究结果，表明该方案可维持持续的血浆药物浓度。对照组小鼠腹腔注射0.2 mL无菌生理盐水。索拉非尼组小鼠腹腔注射0.2 mL含40 mg/kg索拉非尼的溶液。吉西他滨组小鼠腹腔注射0.2 mL含100 mg/kg吉西他滨的溶液。联合治疗组小鼠腹腔注射0.2 mL含40 mg/kg索拉非尼和0.2 mL含100 mg/kg吉西他滨的溶液。各组均每日给药一次，连续给药20天。所有动物均被纳入最终分析，无小鼠被排除出研究。在20天的治疗期间，各组均未观察到死亡情况。给药方案和剂量的选择依据已发表的肝胆系统肿瘤模型研究。需注意的是，每日腹腔注射吉西他滨可能引起毒性反应。每日测量移植瘤的长径和短径，并计算移植瘤体积。20天后，在深度麻醉下通过颈椎脱位处死动物，移植瘤组织用甲醛固定。在整个实验期间，每2天测量一次体重。每日观察小鼠的毒性临床表现，包括竖毛、蜷缩姿势、活动减少、腹泻和嗜睡。然而，未进行血清生化检测（如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和肌酐）以及主要器官的组织病理学检查。因此，不能排除亚临床毒性的存在。
药物与试剂
索拉非尼溶于10%二甲基亚砜（DMSO）中，储存于-20 °C。使用前将溶液解冻并稀释，使DMSO终浓度低于0.5%，该浓度对细胞生长无影响。吉西他滨购自商业来源。放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液、噻唑蓝、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、ERK、p-ERK和VEGF的一抗、二抗、高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）、胎牛血清及 HepG2 细胞系均购自商业来源。
索拉非尼和吉西他滨是细胞毒性药物。所有药物的配制和操作步骤均应在指定的生物安全柜中进行，同时穿戴适当的个人防护装备（实验服、腈类手套和护目镜）。本实验方案中使用的二甲基亚砜、甲醇、二甲苯及其他有机溶剂均具有危害性，应在通风橱中操作以避免吸入或皮肤接触。使用所有试剂前应查阅其材料安全数据表（MSDS）。
细胞培养
复苏 HepG2 细胞系并接种至细胞培养瓶中，培养瓶内含 10 mL 高糖 DMEM 培养基（添加 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素-链霉素和 4 mmol/L 谷氨酰胺）。细胞置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中培养。每 2 天更换一次培养基，每 4 天传代一次，以维持细胞的对数生长。HepG2 细胞系购自商业来源；但本研究未进行独立的细胞系鉴定（如短串联重复序列分析）及支原体检测。
检测增殖抑制率的MTT方法
采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定索拉非尼与吉西他滨对HepG2细胞系的增殖抑制率。取对数生长期细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化2 min，按等体积加入完全培养基终止消化，1000 ×g离心 × g 孵育10分钟后，将细胞重悬于完全培养基中。调整细胞密度至1 × 105 细胞/毫升，以及 200 µL 将细胞悬液接种至96孔板的每个孔中。该接种密度是基于初步优化实验确定的，实验中测试的细胞密度范围为5 × 103 至 5 × 104 细胞/孔被测试。2 的密度 × 104 每孔细胞数确保在96小时内吸光度呈线性增长，且在实验终点时汇合度保持在80%以下，经倒置显微镜目视观察确认。为确保MTT检测值处于线性范围内，各时间点均进行了预实验，使用溶剂处理的对照孔进行测定。每48小时更换一次培养基，以防止营养耗竭及代谢副产物积累。每日使用倒置显微镜监测细胞汇合度。96小时时，对照孔细胞汇合度约为75%–80%，未见明显营养耗竭迹象。细胞贴壁后，弃去原培养基，加入含药物的培养基；未处理对照组则加入不含药物的培养基（溶剂对照） 体内 实验分为未处理对照组、索拉非尼组、吉西他滨组和联合治疗组。索拉非尼的剂量为 1.5 µmol/L, 3 µmol/L, 4.5 µmol/L，以及 6 µmol/L，吉西他滨的剂量为 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/L，以及 20 µmol/L索拉非尼与吉西他滨联合使用的剂量为 1.5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4.5 µmol/L + 15 µmol/L，以及 6 µmol/L + 20 µmol/L各组细胞分别培养 24 h、48 h、72 h 和 96 h。培养结束后 20 µL 每孔加入5 mg/mL的MTT溶液，细胞在细胞培养箱中孵育4小时。小心弃去上清液，然后 150 µL 加入DMSO至每孔，酶标板置于摇床上振荡10分钟，以充分溶解甲臜结晶，随后使用多功能酶标仪在490 nm波长下测定各孔的光密度（OD）值。实验重复三次，每组设五个复孔。数据以均值表示 ± 三个生物学重复的标准差。细胞生长抑制率（%）=（1 - OD 实验组 /OD 未处理组）× 100%。两种药物之间的相互作用通过以下方式判断： q-值，由以下公式计算得出： q = EAB / (EA + EB - EA × EB）。此处，EA 和 EB 分别表示药物 A 和药物 B 单独使用时的抑制率，EAB 表示两种药物联合使用时的抑制率。当 q 大于1.15表明两种药物之间具有协同作用；0.85–1.15表明为相加作用；而 q 小于 0.85 表示具有拮抗作用。 q-值法是一种简单的筛选工具，不能替代更严格的协同作用分析。仅测试了少数几个固定比例的剂量组合，这限制了协同作用结论的稳健性。因此，该术语 "协同作用" 本研究中指的是 q > 1.15 在特定的剂量组合和时间点，而非在整个剂量-反应矩阵中经过验证的相加相互作用。
ERK 和 p-ERK 蛋白表达的 Western 印迹分析
细胞培养和实验分组按上述方法进行。在通过蛋白质印迹法检测ERK和p-ERK时，索拉非尼的剂量为3 µmol/L；吉西他滨的剂量为10 µmol/L；联合用药剂量为3 µmol/L + 10 µmol/L。处理72小时后，使用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，并从各实验组提取总蛋白。采用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。每孔上样等量蛋白（30 µg），在120 V电压下进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳时间为90分钟。随后在4 °C、300 mA条件下，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（孔径0.45 µm），转膜时间为90分钟。用含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）配制5%脱脂牛奶，在室温下封闭膜1小时后，将膜置于4 °C、轻度振荡条件下与一抗孵育过夜。用TBST洗涤三次，每次10分钟，然后在室温下与二抗孵育1小时。使用增强型化学发光（ECL）底物显色，并通过数字凝胶成像系统获取图像。针对每种抗体优化曝光时间，以避免信号饱和。使用ImageJ软件中的凝胶分析工具进行密度定量。所有目标蛋白条带的强度均以GAPDH作为上样对照进行归一化，p-ERK的表达量进一步以总ERK表达量进行归一化。除5%脱脂牛奶封闭外，未进行其他额外封闭步骤。定量结果以相对于对照组的倍数变化表示，对照组设为1.0。每个实验均独立重复三次。图中显示为代表性免疫印迹结果。
在NOD/SCID小鼠中HepG2异种移植瘤VEGF表达的免疫组织化学检测
用于异种移植模型建立：将处于对数生长期的 HepG2 细胞通过胰蛋白酶消化收集，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，然后重悬于无血清 DMEM 培养基中。使用 1 mL 注射器将 2 × 106 个细胞悬浮于 0.2 mL 无血清 DMEM（不含 Matrigel）中，皮下注射至每只 NOD/SCID 小鼠的右侧腋部区域（血供丰富的区域），以建立 HepG2 皮下异种移植模型。每 2 天监测一次成瘤情况。每两天测量一次肿瘤大小，当肿瘤直径达到 0.3–0.5 cm（约为注射后 7–10 天，定义为治疗起始点）时，将小鼠随机分为 4 组进行实验。使用数显卡尺每天测量皮下移植瘤的长度（L）和宽度（W），并根据公式 V = (L × W2) / 2 计算肿瘤体积。所有测量均由对分组情况设盲的研究人员完成。20 天后，在深度麻醉下通过颈椎脱位处死动物，异种移植组织在室温下用 10% 中性缓冲福尔马林固定 24 小时，随后进行石蜡包埋。使用旋转式切片机切取 5 µm 厚的组织切片，并将其贴附于多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。免疫组织化学染色时，切片经二甲苯脱蜡（更换三次，每次 5 分钟），并通过梯度乙醇（100%、95%、70%、50%；每次 3 分钟）逐级水化。抗原修复采用微波加热法，在 10 mM 枸橼酸钠缓冲液中加热 15 分钟，随后于室温冷却 20 分钟。室温下用含 3% 过氧化氢的甲醇溶液孵育 10 分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。室温下用含 5% 正常山羊血清的 PBS 溶液封闭 1 小时以阻断非特异性结合。然后切片在湿盒中与抗 VEGF 一抗（稀释比例 1 : 200）于 4 °C 过夜孵育。用 PBS 洗涤（三次，每次 5 分钟）后，室温下加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（稀释比例 1 : 500）孵育 1 小时。使用 3,3′-二氨基联苯胺（DAB）底物显色。切片用苏木精复染 30 秒，脱水、透明并用中性树胶封片。使用倒置荧光显微镜在明场模式下以 ×100 放大倍数进行成像。展示的代表性图像仅用于定性说明。
所有受污染的枪头、试管和细胞培养废弃物均作为生物危害性废物收集，并在处理前进行高压灭菌。化学废物（包括含药物溶液、DMSO、二甲苯和甲醇）须收集于分开的、贴有标签的废物容器中，并按照当地机构关于危险化学废物的规定进行处置。
统计学分析
采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析。实验数据以均值表示 ± 三次独立生物学重复的均方差 体外 实验，以及平均值 ± 每组 n = 10 只小鼠的标准差（SD） 体内 实验中，两组之间的比较采用双尾非配对 t 检验；多组之间的比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。 p < 0.05, p < 0.01，以及 p < 0.001 被报道。
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索拉非尼和吉西他滨对 HepG2 细胞增殖的抑制作用
索拉非尼和吉西他滨以剂量依赖性方式抑制 HepG2 细胞增殖，结果如表 1所示。与单药治疗相比，联合治疗在所有时间点的抑制率均显著更高。MTT 法检测的是细胞代谢活性，其结果与细胞数量相关，但并不直接测量细胞增殖或细胞毒性。因此，“增殖抑制”这一术语应理解为 MTT 转化能力的降低。值得注意的是，3 µmol/L 索拉非尼与 10 µmol/L 吉西他滨联合使用时表现出最显著的抑制效应，凸显其作为肝癌有效治疗方案的潜力。进一步研究显示索拉非尼与吉西他滨对 HepG2 细胞具有相加作用。表 2 列出了 q 值，该值提示两种药物之间可能存在协同作用。值得注意的是，3 µmol/L 索拉非尼联合 10 µmol/L 吉西他滨在多个时间点的 q 值均超过 1.15，提示 p-ERK 表达降低与观察到的抗增殖效应之间存在关联，但这些数据并未证明因果关系。这些结果表明，在得出有关治疗潜力的结论之前，有必要...
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由于起病隐匿、进展迅速且有效治疗手段有限，肝癌的死亡率很高3,15。晚期肝癌常表现出对化疗和放疗的耐受性，目前包括手术切除和肝移植在内的治疗方案仍不充分15,16。联合使用两种或多种作用机制不同的化疗药物已有较成熟的发展，被认为可显著提高疗效，可能是治疗肝癌的一种替代策略15,16。肝癌研究中的靶向药物包括单克隆抗体（抗VEGF和抗EGFR）、酪氨酸激酶抑制剂以及mTOR抑制剂，而关键挑战在于如何优化现有药物的联合应用，以改善总体生存率和生活质量17。若能探索出高效且低毒的药物组合，可能有助于克服当前肝癌治疗的局限性。近期一项针对吉西他滨耐药的细胞模型研究表明，该模型可能被重新敏化于吉西他滨/索拉非尼（EGFR抑制剂）治疗
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作者无任何利益冲突需要披露。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 数字凝胶成像系统 | Bio-Rad Laboratories, Inc., USA | 1708280 | |
| DMEM高糖培养基 | HyClone, USA | SH30243.01 | |
| ERK兔单克隆抗体 | Santa Cruz, USA | sc-94 | |
| 胎牛血清 | 浙江天杭生物科技股份有限公司，中国 | 11011-8611/11011-8615 | |
| 荧光倒置显微镜 | Olympus, Japan | IX73 | |
| GAPDH兔多克隆抗体 | Santa Cruz, USA | sc-25778 | |
| 吉西他滨 | Eli Lilly and Company | 95058-81-4 | |
| 山羊抗兔二抗 | 上海生工生物工程有限公司，中国 | D111018 | |
| ImageJ软件 | 美国国立卫生研究院（NIH），贝塞斯达，马里兰州，美国 | Version 1.8.0_112 | |
| 酶标仪 | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | MK3 | |
| p-ERK兔单克隆抗体 | Santa Cruz, USA | 9106 | |
| 冷冻离心机 | 长沙湘仪离心机有限公司 | DL-5M | |
| RIPA裂解缓冲液 | 碧云天生物技术研究所，中国 | P0013B | |
| 轮转式切片机 | Leica, Germany | CM3050 | |
| 索拉非尼 | Bayer Company, Germany | 284461-73-0 | |
| 噻唑蓝（MTT） | Sigma, USA | M5655 | |
| 三气培养箱 | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | 51026402 | |
| VEGF兔单克隆抗体 | BioLegend, USA | B199116 |
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