本方案描述了一种通过将多西环素诱导型转基因整合到AAVS1安全港位点，从而由人诱导性多能干细胞生成GABA能神经元的方法。这种稳定且均一的转基因表达可高效地实现向GABA能神经元的直接分化，同时减少转基因沉默现象，而转基因沉默是慢病毒方法中常见的问题。
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方法文章
利用多西环素诱导型ASCL1/DLX2在AAVS1位点的表达由人诱导性多能干细胞生成GABA能神经元
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
人类诱导多能干细胞（hiPSCs）为建立人类神经系统疾病模型提供了前所未有的机遇 体外 可靠地生成特定的神经元群体（例如γ-氨基丁酸能（GABA能）神经元）对于这些研究至关重要。本方案详细描述了一种利用多西环素诱导系统将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为GABA能神经元的稳健方法。该方法依赖于将编码转录因子的转基因稳定整合到基因组中 ASCL1 和 DLX2 安全港腺相关病毒整合位点1（AAVS1通过CRISPR/Cas9介导的敲入技术将目的序列靶向整合至AAVS1位点。这种靶向整合可避免随机慢病毒整合常导致的转基因沉默现象。本方案涵盖hiPSCs的培养、核转染介导的转基因整合、嘌呤霉素筛选以富集成功编辑的细胞，以及逐步分化操作的具体流程。在诱导表达多西环素后，经基因工程改造的hiPSCs可在21天内快速退出细胞周期，呈现神经元形态，并表达GABA能谱系标志物。关键步骤包括利用特定生长因子进行神经诱导及后续成熟阶段，以及在成熟过程中增强细胞黏附的潜在优化策略。该标准化方法可获得富集的表达GABA能谱系标志物的诱导神经元，为神经科学研究和细胞模型构建提供了有力工具。
引言
人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）为在体外模拟人类神经系统疾病以及研究驱动发育与退变的复杂分子机制提供了独特的平台。in vitro。该技术能够生成患者特异性的细胞模型，用于研究多种疾病，范围从综合征型纤毛病中的早期神经发育异常2到散发性阿尔茨海默病中观察到的细微表观基因组改变3。因此，hiPSCs的定向分化已成为现代分子神经科学的核心技术之一1。
为了有效捕捉人类神经系统过程的细微特征，生成高度特异且纯度高的神经元亚型至关重要。例如，需要明确的神经元群体来阐明蛋白质（如MECP2）在人类神经元中的特定转录作用4，或评估外周感觉神经元对病毒感染（如SARS-CoV-2）的特异性易损性5。此外，构建复杂且具有生理相关性的微环境（例如将功能性小胶质细胞整合到三维脑类器官中），从根本上依赖于不同神经和胶质谱系的稳定且可预测的生成6。在这些亚型中，GABA能神经元因其在中枢神经系统中的关键抑制性作用以及与多种神经和精神疾病的相关性而备受关注7。本方法的总体目标是提供一种可靠、高效且可重复的方案，用于将人诱导性多能干细胞（hiPSCs）....
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方案
警告：人类hiPSC培养物应按照机构生物安全规程，作为潜在的生物危害材料进行处理。所有人类hiPSC培养操作均须在经认证的II级生物安全柜中，采用无菌技术进行。含有人类细胞的废弃物、接触过人类细胞的培养基以及CRISPR/Cas9质粒材料，在丢弃前应根据当地生物安全指南进行去污处理。多西环素、嘌呤霉素、DMSO及其他化学试剂应佩戴手套，并采取适当的眼部和皮肤防护措施进行操作，废弃物应根据机构的化学废弃物处理规程进行处置。基底膜提取物（BME）应采用无菌技术操作，并在使用前置于冰上保存，以防止提前聚合。液氮储存和冻存管操作时应佩戴适当的低温手套，采取面部防护，并谨慎操作，避免在解冻过程中发生冻伤或冻存管爆炸。
注意：在进行 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑和神经元分化之前，人诱导多能干细胞（hiPSC）培养物应满足预定义的质量控制标准。细胞必须经确认无支原体污染，具有正常核型或可接受的基因组完整性特征，并持续稳定表达多能性标志物，包括 OCT4、SOX2、NANOG、TRA-1-60 和/或 SSEA4。培养物应呈现典型致密的 hiPSC 克隆形态，具有较高的核质比、清晰的克隆边界以及极少的自发分化现象。应仅使用处于推荐传代范围内的活跃增殖培养物，且细胞传代次数不得超过实验室规定的最大传代数（通常低于第 40 代），除非另有验证。凡出现异常形态、过度自发分化、生长不良、确认污染或基因....
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结果
成功应用本方案可获得具有GABA能分子特征的诱导神经元富集群体。该策略基于将多西环素诱导型表达元件靶向插入 ASCL1-P2A-DLX2 将cassette插入 AAVS1 位点（图1A）。在筛选出经基因改造的hiPSCs后，按照所示时间线，使用多西环素诱导以促进GABA能神经元的分化，如图所示 图1B转染后经嘌呤霉素筛选，研究人员应观察到整合型荧光报告基因近乎均一的表达例如， mCherry）在hiPSC集落中广泛表达，表明工程化细胞成功富集。在分化阶段，添加多西环素可诱导hiPSCs发生快速的形态学转变图1C）。阳性结果的特征是在第3天细胞分裂停止，随后出现神经突生长。图1C）。到第20天，通过相差显微镜可清晰观察到广泛的轴突网络，从而确认分化成功（图1D，并通过表达.......
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讨论
GABA能神经元的成功生成在很大程度上依赖于本方案中的多个关键步骤。维持高质量且未分化的hiPSCs至关重要；在核转染之前若发生自发分化，将显著降低基因整合效率以及后续神经元的纯度8。此外，准确确定嘌呤霉素杀灭曲线对于彻底清除未整合的细胞、同时避免对正确编辑的克隆造成过度损伤至关重要。在分化阶段，需对培养物进行细致而轻柔的操作，特别是将培养基沿孔壁逐滴加入，以防止脆弱的神经网络脱落。
研究人员可能会遇到多种挑战，需要有针对性地进行故障排除。如果核转染后细胞存活率异常偏低，可缩短细胞在核转染溶液中的暴露时间，并严格在冰上控制温度，从而显著提高细胞存活率。如果在成熟过程中仍存在未分化的干细胞，可在早期成熟阶段加入多能干细胞存活抑制剂（如步骤5.5所述），以有效选择性清除污染性的未分化干细胞。故障排除应基于明确的阈值和特定步骤的纠正措施。核转染后存活率低（定义为24小时时活细胞比例低于30–40%）通常由过度解离应激或核转染毒性引起。可通过缩短细胞在P3缓冲液中的停留时间、核转染前将细胞保持在冰上、使用健康且近期传代的人诱导多能干细胞（hi.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究得到了加拿大干细胞网络青年研究员启动计划（Canadian Stem Cell Network Jump Start ECR Program）以及蒙特利尔大学基金会儿童癫痫想象研究所-圣心医院合作项目基金（Fonds UdeM pour le partenariat CHU Sainte-Justine -Institut Imagine en épilepsie de l’enfant）的支持。Théo Rabin 得到了 Odisé 网络的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4D-Nucleofector™ 核心单元 | Lonza | AAF-1002B | 用于 hiPSC 的电穿孔/核转染。 |
| 6孔培养板 | Sarstedt | 83.3920300 | 用于hiPSC维持与分化的组织培养处理板 |
| BDNF（脑源性神经营养因子） | STEMCELL Technologies | 78005 | 重组人源神经元成熟蛋白；按制造商说明书配制，使用终浓度为10 ng/mL。 |
| 细胞计数仪（Countess） | 赛默飞世尔科技 | C10283 | 用于细胞计数。 |
| 离心 | VWR | 76468-134 | 用于细胞沉淀。 |
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | Heracell VIOS 160i 或同等型号 | 维持37℃的细胞培养箱 °C，加湿环境，5% CO₂2. |
| 冻存管 | 赛默飞世尔科技 | 5000-0020 | 用于冻存hiPSC的无菌冻存管；等效外螺纹1.8–可使用 2.0 mL 冻存管。 |
| Cultrex UltiMatrix 低生长因子基底膜提取物 | Bio-Techne | BME001-05 | 本方案中使用的标准BME包被基质。根据Bio-Techne分析证书中的批号特异性原液浓度，用DMEM/F-12稀释至80 µg/mL 工作浓度 |
| DMEM/F-12 | Wisent | 319-090-CL | 用于稀释BME的基礎培養基。 |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma-Aldrich | D2650 | 用于冷冻培养基制备的冷冻保护剂。 |
| 供体质粒：可诱导型 ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 靶向表达盒 | 定制质粒 | Addgene 登记号待定 | 定制AAVS1供体质粒，包含多西环素诱导型ASCL1-P2A-DLX2表达盒及筛选/报告元件。质粒图谱和完整序列作为补充文件提供或应要求提供。 |
| 盐酸多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 | 用于诱导 ASCL1-P2A-DLX2 表达。制备无菌储存液，分装，避光保存于冷冻条件，使用时稀释至 1 µg/mL 终浓度 |
| 乙醇（70%） | Commercial Alcohols / Greenfield Global | P016EAAN | 在生物安全柜内进行消毒时，使用机构批准的70%乙醇或等效试剂。 |
| 荧光显微镜 | ECHO | Revolve R4 | 用于观察报告基因表达和神经元形态的相差及荧光成像的显微镜。 |
| GDNF（胶质细胞源性神经营养因子） | STEMCELL Technologies | 78058 | 重组人源神经元成熟蛋白；按制造商说明书配制，使用终浓度为10 ng/mL。 |
| hiPSC 细胞系 PGP1 | EditCo Bio | PGP1 人诱导多能干细胞系 | 本方案中使用的商业化开放知情同意的人类iPSC细胞系；在进行基因编辑和分化前，需记录传代次数和质量控制状态。 |
| 图像分析软件 | ImageJ/Fiji | 开源；应报告所使用的版本 | 用于荧光定量和代表性图像处理。 |
| 敲除™ 血清替代物（KOSR） | 赛默飞世尔科技 | 10828028 | 用于冷冻保存液的配制。 |
| 层粘连蛋白-521 | STEMCELL Technologies | 200-0117 | 可选的故障排除试剂。不属于标准包被方案的一部分；若神经元持续脱落，可作为替代包被基质或二次包被基质使用。 |
| 液氮杜瓦瓶 | 赛默飞世尔科技 | Locator 6 Plus 或同等产品 | 根据机构的低温安全规程，将冷冻的hiPSCs长期储存在液氮气相或液氮中。 |
| 弗罗斯特先生™ 冻存容器 | 赛默飞世尔科技 | 5100-0001 | 用于细胞在 -80 ℃ 条件下的程序降温冻存 °C. |
| mTeSR™ 加 | STEMCELL Technologies | 100-0276 | 无饲养层维持培养基（用于hiPSCs） |
| 神经诱导培养基 | STEMCELL Technologies | 08582 | 用于早期神经元诱导的商用神经诱导培养基。 |
| 神经元成熟基础培养基（BrainPhys™ 神经元培养基 | STEMCELL Technologies | 05790 | 用于神经元成熟的基礎培養基；根據方案描述，添加 BDNF、GDNF、NT-3、doxycycline 和 PluriSln-1。 |
| NT-3（神经营养因子3） | STEMCELL Technologies | 78074 | 重组人蛋白，用于神经元成熟；按制造商说明书配制，使用终浓度为10 ng/mL。 |
| P3 原代细胞 4D-电转染仪™ X试剂盒 | Lonza | V4XP-3024 | 包含Solution P3溶液和小电穿孔杯的hiPSC核转染试剂盒 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | 可选抗生素，用于降低细菌污染风险。 |
| Plasmocin™ 预防性的 | InvivoGen | ant-mpp | 可选抗生素，用于预防支原体污染。 |
| PluriSIn-1 | STEMCELL Technologies | 72822 | 多能细胞存活抑制剂，用于清除未分化的hiPSCs；按照生产商说明书配制储存液，并以20倍稀释使用 µM 终浓度 |
| 嘌呤霉素二盐酸盐 | 赛默飞世尔科技 | A1113803 | 用于筛选的抗生素；制备无菌储存液，分装，冻存，并通过杀灭曲线确定最终工作浓度，通常为 0.4–0.6 µg/mL |
| pX330-U6-嵌合型_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA 质粒 | Addgene | 85802 | 用于AAVS1位点靶向的CRISPR/Cas9质粒；应在质粒图谱或补充信息中包含AAVS1 gRNA序列。 |
| qPCR分析软件 | 应用生物系统公司 / 赛默飞世尔科技 | QuantStudio 设计 & 分析软件或同等产品 | 用于 Ct 值提取和 RT-qPCR 分析；报告所用软件版本。 |
| qPCR预混液 | 赛默飞世尔科技 | PowerUp SYBR Green Master Mix, A25742 | 用于神经元和GABA能标志物的RT-qPCR定量分析。 |
| qPCR 引物：DLX1 | 定制寡核苷酸 | 评论中提供的序列 | 上游引物：5' ATGCACTGTTTACACTCGGC 3'；下游引物：5' GACTGCACCGAACTGATGTAG 3'。用于评估第21天GABA能谱系诱导情况。 |
| qPCR 引物：GAD2 | 定制寡核苷酸 | 评论中提供的序列 | 正向：5' TGGCGTTTCTGCAAGATGTTA 3'；反向：5' TTGGTCTGCCAATTCCCAATTAT 3'。GABA能神经元标记物。 |
| qPCR 引物：GAD67 | 定制寡核苷酸 | 评论中提供的序列 | 上游引物：5' GCTTCCGGCTAAGAACGGT 3'；下游引物：5' TTGCGGACATAGTTGAGGAGT 3'。GABA能神经元标记物。 |
| qPCR 引物：RPLP0 | 定制寡核苷酸 | 待提供序列 | 参考基因引物用于 ΔΔCt 值归一化。引物序列应列于表格或补充信息中。上游：5' AGCCCAGAACACTGGTCTC 3'；下游：5' ACTCAGGATTTCAATGGTGCC 3'。 |
| qPCR 引物：SLC17A6 | 定制寡核苷酸 | 评论中提供的序列 | 正向：5' GGGAGACAATCGAGCTGACG 3'；反向：5' TGCAGCGGATACCGAAGGA 3'。谷氨酸能神经元标记物。 |
| qPCR 引物：SLC17A7 | 定制寡核苷酸 | 评论中提供的序列 | 正向：5' CAGAGTTTTCGGCTTTGCTATTG 3'；反向：5' GCGACTCCGTTCTAAGGGTG 3'。谷氨酸能神经元标记物。 |
| ReLeSR™ | STEMCELL Technologies | 100-0484 | 无需酶的试剂，用于hiPSC的解离与传代 |
| 逆转录试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | SuperScript IV VILO Master Mix，11756050 | 用于RT-qPCR前的cDNA合成。 |
| RNA提取试剂盒 | QIAGEN | RNeasy 试剂盒 (74104) | 用于RT-qPCR前总RNA提取的试剂盒。在最终的材料表中记录所用RNeasy试剂盒的具体型号和货号。 |
| 统计软件 | GraphPad Software | GraphPad Prism，版本 11 | 用于RT-qPCR数据的绘图与统计分析。 |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | 赛默飞世尔科技 | 15250061 | 用于细胞计数过程中评估细胞活力的活体染料。 |
| Y-27632（ROCK抑制剂） | STEMCELL Technologies | 72302 | 使用浓度为10 µM终浓度，以在传代和核转染过程中提高细胞存活率。 |
参考文献
- Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.
- Barabino A, Flamier A, Hanna R, Héon E, Freedman BS, Bernier G. Deregulation of Neuro-Developmental Genes and Primary Cilium Cytoskeleton Anomalies in iPSC Retinal Sheets from Human Syndromic Ciliopathies. Stem Cell Reports. 2020 Mar 10;14(3):357-73.
- Katbe A, Hanna R, Flamier A, Serhani D, Hamam R, Barabino A, et al. Epigenomic alterations and neural development anomalies in induced pluripotent stem cells from sporadic Alzheimer’s disease. Development. 2026 Jan 1;153(1):dev2049....
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