本文介绍了一种基于柠檬酸铁铵的快速C2C12成肌细胞铁过载模型，该模型可诱导铁蓄积、铁死亡相关分子改变以及早期对铁死亡抑制蛋白敏感的细胞活力下降。
本文内容
摘要
摘要
铁死亡是一种依赖铁的程序性细胞死亡形式，与衰老和退行性疾病相关。我们先前发现，衰老的肌肉干细胞在激活后会积累细胞内铁并发生铁死亡。本文描述了一种简单的体外模型，使用柠檬酸铁铵诱导小鼠C2C12成肌细胞发生铁过载。柠檬酸铁铵处理增加了细胞内铁负荷，表现为铁蛋白重链和轻链转录水平升高、铁蛋白蛋白表达增加，以及活细胞不稳定铁池染料信号增强。柠檬酸铁铵（FAC）处理还引起与铁死亡相关的分子变化，包括Slc40a1和Hmox1 表达上调以及谷胱甘肽过氧化物酶4蛋白水平下降。FAC引起的谷胱甘肽过氧化物酶4减少可被去铁胺部分逆转。在处理12小时后，具有细胞毒性的柠檬酸铁铵降低了细胞活力，而铁死亡抑制剂-1可挽救该效应，表明细胞死亡中存在对铁死亡敏感的组分。在更晚的时间点，由于数据变异性增加及检测动态范围降低，细胞活力测定结果的可解释性受限。因此，本实验方案提供了一种快速且可扩展的柠檬酸铁铵介导的铁负荷模型，可用于研究肌肉细胞中铁死亡相关反应，并测试针对铁代谢或铁死亡的干预措施。
引言
铁死亡（ferroptosis）是一种调控性细胞死亡（RCD）形式，在分子机制上与其他类型的RCD截然不同。它最初是通过使用erastin（一种对RAS（大鼠肉瘤病毒）具有选择性致死作用的小分子化合物）发现的，该化合物可诱导非凋亡性细胞死亡1。在开创性研究中，Dixon等人首次描述了其铁依赖性的死亡机制，因此提出了“铁死亡”这一术语，意为“铁之亡”1。从分子层面来看，铁死亡表现为铁的过度积累、脂质过氧化增强以及活性氧物种的积聚，最终导致细胞死亡2。铁死亡与其他形式的RCD及氧化应激显著不同之处在于：它不依赖于半胱天冬酶（caspase）的激活——这是细胞凋亡的标志性特征；也不出现受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）的磷酸化和混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）的表达，后两者仅存在于坏死性凋亡（necroptosis）中3。此外，铁死亡可通过脂质抗氧化剂ferrostatin-1和liproxstatin-1，以及铁螯合剂去铁胺（deferoxamine）得到缓解4。尽管铁死亡与其他类型的RCD一样，最终均导致细胞死亡，但其表型特征使其在作用机制上区别于其他RCD形式。
过去十年中，铁死亡（ferroptosis）的研究逐渐受到关注，这主要得益于该领域持续不断的努力，旨在识别新的标志性特征，并开发新工具以研究其潜在机制及其在人类疾病中的作用5。最近大量证据表明，铁过载和铁死亡是与年龄相关的虚弱和肌肉减少症中被低估的致病因素6,7,8。我们近期研究发现，衰老的肌肉干细胞（MuSCs）由于慢性炎症通过表观遗传沉默抑制了抗氧化基因程序，因而对铁死亡具有独特的易感性9。我们发现，衰老的MuSCs细胞内元素铁异常积聚，其水平约为成年对应细胞的30倍。尽管铁死亡已被证实与多个器官和组织的疾病相关——尤其是与衰老相关的疾病——但其生理功能仍不明确，有待进一步研究。
尽管我们之前的研究表明，衰老的肌肉干细胞（MuSCs）在激活后对铁死亡更为敏感，但铁蓄积对这一表型的具体贡献仍有待阐明。在此，我们建立了经柠檬酸铁铵（FAC）处理的C2C12成肌细胞铁过载模型，并探究过量铁是否足以引发与铁死亡相关的分子改变以及铁抑素敏感性的活力丧失。C2C12细胞是一种易于维护、可扩展且 readily available 的小鼠肌肉前体细胞体系10。我们预期该方法将为研究肌肉细胞中铁驱动的应激反应以及测试可调节铁死亡相关表型的干预手段提供一个实用的平台。
方案
1. 准备C2C12细胞
- 解冻细胞
注意：所有细胞培养步骤均应在无菌生物安全柜中进行。- 准备一个锥形管，其中含有9 mL预热的完全培养基（高糖和丙酮酸盐的杜尔贝科改良伊格尔培养基 + 10% 胎牛血清 + 1% 青霉素/链霉素）。
- 向一支冻存的C2C12细胞（约100万个）冻存管中加入800 µL预热的完全培养基，使其解冻。缓慢吹打混匀。
- 当加入冻存管中的培养基变冷后，将其移除并加入锥形管中，再用等体积的温热培养基替换。持续吹打并更换培养基，直至冻存细胞完全重悬。
- 将冻存管中的内容物转移至含培养基的锥形管中，轻轻颠倒混匀，然后将混合液加入一个10 cm细胞培养处理皿中。在37 °C孵育4小时。
- 在显微镜下检查细胞，确认其已贴壁。贴壁细胞呈细长形，而未贴壁的漂浮细胞呈圆形，且在移动培养皿时会移动。
注意：假设接种的细胞状态良好，大多数细胞应已贴壁。 - 吸除培养基以去除死细胞和碎片，更换为10 mL温热的完全培养基，并放回培养箱。继续孵育过夜，或直至培养皿达到80%汇合度。
- 接种C2C12细胞用于铁处理
- 当达到所需汇合度时，吸除细胞培养基。逐滴加入2 mL磷酸盐缓冲液（PBS），确保整个培养皿表面被覆盖，随后吸除。
- 向细胞中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶。在37 °C孵育5–10分钟，或直至细胞脱落。细胞脱落后在显微镜下呈圆形，胰蛋白酶与细胞悬液变得浑浊且黏稠。
- 通过加入8 mL温热的完全DMEM中和胰蛋白酶。使用血清移液管充分混匀溶液并冲洗培养皿。将细胞悬液转移至锥形管中。
- 轻轻颠倒混匀管子3–5次。取适量体积，使用常用方法（细胞计数仪、血球计数板等）进行细胞计数。
- 制备足够数量的细胞悬液，用于每种条件n = 3的接种：10 cm培养皿（用于Western blot）：每皿100,000个细胞；6孔板（用于qPCR）：每孔50,000个细胞；96孔板（用于不稳定铁和发光染色）：每孔1,000个细胞。将细胞在37 °C孵育过夜。
- 对已接种细胞施加铁处理
- 在处理当天，在无菌条件下将柠檬酸铁铵（FAC；分子式 = C₆H₁₁FeNO₇⁺3；分子量 = 265 g/mol）加入完全DMEM培养基中，浓度如下：重度处理：180 µM（0.0477 mg/mL），细胞毒性处理：1,800 µM（0.477 mg/mL）。
注意：建议同时设置对照组，包括但不限于溶剂对照、重度处理 + 150 µM去铁胺（铁螯合剂）、溶剂 + 150 µM去铁胺，和/或溶剂 + RSL3（铁死亡诱导剂；阳性对照）。 此外需注意，DMEM基础培养基可能已含有少量硝酸铁九水合物（三价铁来源）。上述推荐的FAC浓度应理解为在基础培养基已含三价铁的基础上额外添加的浓度。 - 颠倒混匀直至FAC在完全培养基中完全溶解。
注意：由于FAC可溶于水，无需使用DMSO或其他溶剂。 添加FAC可能改变溶液pH值，因此若观察到培养基颜色发生显著变化，建议测量pH值，以确保处理后的培养基对细胞活性无不良影响。 - 吸除细胞上的原有培养基。向处理组加入等体积的含铁完全培养基，向对照组（溶剂组）培养孔/皿中加入等体积的未处理完全培养基。在37 °C孵育指定时间后进行后续检测：不稳定铁检测：FAC处理2小时；qPCR和Western blot：FAC处理12–24小时；发光检测：FAC处理12小时。
- 在处理当天，在无菌条件下将柠檬酸铁铵（FAC；分子式 = C₆H₁₁FeNO₇⁺3；分子量 = 265 g/mol）加入完全DMEM培养基中，浓度如下：重度处理：180 µM（0.0477 mg/mL），细胞毒性处理：1,800 µM（0.477 mg/mL）。
2. qPCR
- 用于qPCR的mRNA提取
警告：RNA提取试剂和氯仿具有呼吸道危害。仅可在通风橱内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、耐化学腐蚀的一次性手套和眼部防护装置）。- 在实验台上吸除细胞培养基。用无菌PBS洗涤细胞2次，并彻底吸除残留液体。
- 在通风橱内，按以下体积向细胞中加入RNA提取试剂：6孔板：每孔250 µL，10 cm培养皿：每皿1 mL。
- 在通风橱内的冰上操作，使用细胞刮轻轻刮下裂解的细胞。注意彻底刮取培养板的所有区域，以最大化RNA得率。
- 将裂解液转移至无菌、预冷、无RNA酶的微量离心管中。室温静置5分钟。
- 每毫升提取试剂中加入200 µL氯仿，必须在通风橱内进行。剧烈振荡样品至少30秒，使提取试剂与氯仿充分混合。室温静置5分钟。
注意：静置后将发生相分离，上层为含有RNA的透明水相。 - 在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟。同时标记新的灭菌离心管，并在冰上向每管（每毫升提取试剂对应）加入500 µL异丙醇。
- 仅将水相转移至对应的离心管中。轻柔颠倒混匀，室温静置10分钟。若预期得率较低，可加入2 µL GlycoBlue以帮助观察沉淀。
- 在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟。
注意：沉淀的RNA可能在管底可见。 - 小心倾去多余的异丙醇至指定废液杯中。向管中逐滴加入1 mL分子级100%乙醇，注意不要使沉淀脱落。在4 °C条件下以7,500 × g离心5分钟。
- 倒去乙醇。将离心管倒置，管盖打开置于纸巾上。让沉淀干燥至无液滴（约15–30分钟）。
注意：若未添加GlycoBlue，沉淀可能变为半透明。 - 将沉淀重悬于25 µL无菌、无RNA酶的水中。通过紫外-可见分光光度法测定RNA浓度。将各样本RNA浓度归一化，确保每个样本最多含1 µg RNA，总体积为16 µL。
- 用于qPCR的cDNA合成
注意：所有步骤均需在冰上完成，以最大化RNA/cDNA得率。- 解冻样本。用RNA酶清除剂清洗工作区域。
- 将每个样本的1 µg RNA加入对应的PCR条形管中。
- 向每管中加入4 µL cDNA合成混合液。如需，加入无菌水使总体积达到20 µL。在以下热循环仪程序下运行：25 °C 5分钟，42 °C 30分钟，85 °C 5分钟，4 °C无限保持。
- 进行qPCR
- 在进行后续反应前，用无菌水将cDNA稀释1:10。
注意：cDNA可在-20 °C冷冻保存1个月，或在-80 °C保存6个月。 - 用无菌水将引物稀释至10 µM浓度。包括适当的对照和/或内参基因（例如 B2M、TBP1）。
- 为每个内参基因和目标基因配制主混合液，确保有足够的反应混合液用于每个DNA样本的三重复实验。每反应主混合液配方如下：2× PCR混合液：10 µL，正向引物（10 µM）：1 µL，反向引物（10 µM）：1 µL，无菌水：8 µL。
- 将qPCR反应板置于96孔冰冻金属块中。向每个样本孔中加入5 µL稀释后的cDNA，再向每孔加入20 µL反应主混合液。检查每孔确保加入体积一致，用封板膜封板，并用平边工具排除气泡。
- 在4 °C条件下以1,000 × g离心1分钟。将反应板放入qPCR仪中，确保正确方向加载。
- 在qPCR软件中为每个孔指定样本和目标基因的身份。若计划使用相同设置运行多个重复，建议创建模板。
- 运行如表1所示的qPCR程序（时长约1小时36分钟）。
- 将结果导出为.CSV或.XLSX文件。若所用qPCR仪器允许用户选择导出参数，请确认导出文件中包含CT值。
- 使用每个条件和目标基因的平均CT值，与对应条件下内参基因的CT值进行比较，计算各基因的倍数变化。将溶剂对照组的倍数变化归一化为1.0。
- 在进行后续反应前，用无菌水将cDNA稀释1:10。
3. 蛋白质印迹
- 用于 Western 印迹的蛋白质提取
注意：所有步骤均需在冰上操作，以最大程度提高蛋白质得率。- 在生物安全柜中，吸除培养基。加入足量预冷的 PBS 缓冲液以覆盖培养皿底部，清洗细胞。吸除 PBS，重复一次。
- 加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物的 RIPA 裂解缓冲液，以防止蛋白质降解。对于 6 孔板培养的细胞，使用 75 µL RIPA 溶液；对于 10 cm 培养皿，则使用 200 µL RIPA 溶液。
- 在冰上操作，使用细胞刮轻轻将裂解后的细胞从培养皿表面刮下。特别注意刮取培养皿各区域（包括边缘）的细胞。溶液将呈现透明且略带黏稠的状态。
- 用移液器将 RIPA-细胞悬液转移至预冷的微量离心管中。在 4 °C 条件下以最大转速离心 10 分钟。将上清液（即蛋白质裂解物）转移至预冷的离心管中，弃去沉淀。
- 通过 Bradford 或 BCA 法测定蛋白质浓度。将样品用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的预冷纯水调整至 1 µg/µL 的浓度。
- 用 Laemmli 缓冲液稀释裂解物，确保各样品间最终蛋白质浓度一致。在 95 °C 下煮沸 10 分钟以使蛋白质变性。为获得最佳结果，建议制备后立即用于 Western 印迹实验。若需保存，可短期（≤ 1 个月）存放于 -20 °C，或长期存放于 -80 °C。
- 制备 SDS-PAGE 用丙烯酰胺凝胶
警告：丙烯酰胺为神经毒素，操作时必须穿戴适当的个人防护装备（实验服、耐化学腐蚀手套和眼部防护装置）。- 通过查阅所用抗体的公司网站，确定目标蛋白及其分子量大小。根据目标蛋白的预测分子量，决定凝胶所需的丙烯酰胺百分比。
注意：对于大多数分子量范围，10%–15% 的丙烯酰胺凝胶效果良好。 - 按照制造商说明组装凝胶制备架和模具。
- 配制分离胶时，根据 表 2（列出两块凝胶所需组分）中指定的体积，将丙烯酰胺、无菌水、1.5 M Tris/HCl pH 8.8 缓冲液和 10% 十二烷基硫酸钠按所需比例加入锥形管中，用于制备特定数量和浓度的凝胶。通过倒置混匀。
- 向混合液中加入 10% 过硫酸铵溶液和 TEMED，再次倒置混匀。
- 立即倒入凝胶模具中，加样至液面略低于插入梳子时可到达的底部位置。
- 立即在正在凝固的凝胶表面滴加 100–200 µL 纯乙醇。若需解冻和/或变性蛋白裂解物，可在该孵育期间完成。将蛋白质置于冰上解冻。
注意：此步骤可使凝胶表面平整，防止不均匀凝固。 - 待凝胶完全凝固后，倒掉乙醇。配制浓缩胶时，根据 表 2（列出两块凝胶所需组分）中指定的体积，将丙烯酰胺、无菌水、0.5 M Tris/HCl pH 6.8 缓冲液和 10% 十二烷基硫酸钠加入锥形管中。通过倒置混匀。
- 向浓缩胶混合液中加入 10% 过硫酸铵溶液和 TEMED，倒置混匀。
- 立即向凝胶模具中加入浓缩胶溶液至顶部满溢。倒入后立即插入梳子。静置约 1 小时，或直至轻轻晃动凝胶制备架时加样孔形状保持不变。
- 通过查阅所用抗体的公司网站，确定目标蛋白及其分子量大小。根据目标蛋白的预测分子量，决定凝胶所需的丙烯酰胺百分比。
- 上样
- 向电泳槽中加入运行缓冲液，液面达到对应所运行凝胶数量的适当刻度线。
- 将仍插有梳子的凝胶模具转移至电泳槽中。向两块凝胶之间的空隙继续添加运行缓冲液直至充满。轻轻拔出浸没在缓冲液中的梳子。
- 向每块凝胶的一个加样孔中加入 5–10 µL 蛋白质分子量标记物。
- 向每个加样孔中加入 5–20 µL 提取的蛋白质与 Laemmli 缓冲液混合样品。向任何空的加样孔中加入 5–10 µL 的 1× Laemmli 缓冲液。
注意：所加体积可能需要根据目标蛋白的丰度和/或抗体的检测效率进行优化。
- 进行 SDS-PAGE 电泳
- 将电泳槽连接至电源装置。设定电压为 150 V，运行 45 分钟。
注意：根据具体实验设置，可能需要更长时间或更高电压以完成完全迁移，请根据实际情况调整。 - 当蛋白质迁移至凝胶末端（即凝胶模具与凝胶框在装置底部交汇处）时，停止电泳并关闭电源。
- 将电泳槽连接至电源装置。设定电压为 150 V，运行 45 分钟。
- 完成蛋白质转膜
注意：本节内容基于快速蛋白质转膜装置的操作流程。- 将转膜缓冲液倒入凝胶托盘中。依次加入一层转膜滤纸、硝酸纤维素膜和另一层转膜滤纸，形成以膜为中心的“三明治”结构。确保整个“三明治”结构完全浸没于转膜缓冲液中。
- 开启快速蛋白质转膜装置，并根据凝胶数量和目标蛋白大小选择合适的转膜程序。
注意：1.3 A、25 V、10 分钟的条件通常效果良好，但可能需要优化。 - 用镊子移除上层转膜滤纸，让多余液体流回凝胶托盘。将滤纸转移至蛋白质转膜装置中，尽量平直放置；使用滚轮或锥形管压平任何褶皱。对膜重复相同操作。
- 使用钝头工具轻轻分离制胶模具的上下两部分。将凝胶转移至转膜装置中的膜上。
- 用镊子从凝胶托盘中取出剩余的转膜滤纸，沥干多余液体后覆盖在膜和另一层滤纸上。关闭转膜盒并运行程序。
- 封闭与抗体孵育
- 打开转膜盒，用镊子移除上层滤纸，然后取下凝胶。确认膜上可见分子量标记物的条带。根据需要裁剪膜，仅保留目标分子量范围。
- 将膜转移至洁净的印迹盒中。加入 5 mL 封闭缓冲液，或足量覆盖膜的体积。在室温下振荡封闭 1 小时。
- 同时，按每张膜在 5 mL 洗涤缓冲液中含 2% 牛血清白蛋白（BSA）的比例，加入推荐浓度的一抗进行抗体孵育。同时应孵育内参蛋白（如 GAPDH、β-actin）。
- 停止振荡，倒掉封闭缓冲液，加入 5 mL 一抗溶液。在 4 °C 条件下避光振荡孵育过夜（约 12–16 小时）。
注意：后续所有步骤均应在避光条件下进行。 - 用洗涤缓冲液在室温下振荡洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
- 将推荐浓度的二抗加入含 5% BSA 的洗涤缓冲液中。每张膜准备 5 mL 溶液。
- 倒掉多余的洗涤缓冲液，向每张膜中加入 5 mL 二抗溶液。在室温下避光振荡孵育 1 小时。
- 用洗涤缓冲液在室温下振荡洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。立即进行成像。
- 目标蛋白的检测与分析
- 使用合适的成像平台对蛋白条带进行成像。
- 使用 ImageJ 或其他分析软件对各目标条带的强度进行定量分析。
4. 不稳定铁染料检测法
- 不稳定铁染料染色
- 完成第1部分的全部操作，将细胞接种于96孔板中，并用铁处理2小时。每种铁处理条件至少设置三个复孔，同时设立阴性对照（溶剂对照；培养基 + 150 µM 铁螯合剂去铁胺）和阳性对照（培养基 + 180 µM FAC + 活性铁染料共处理）。
- 在无血清培养基中配制足够的1 mM活性铁染料储备液1:200稀释液，每孔样品需200 µL。
- 吸除培养基，用 PBS 洗涤 2 次。
- 向每个孔中加入染色液，在37 °C下孵育1小时。
- 用 PBS 洗涤一次。更换为 PBS。
- 使用荧光显微镜的远红光通道（646/662 nm）对细胞进行成像。将图像保存并导出为 .TIF 文件。
- 染色分析
- 在 ImageJ 中打开图像。
- 打开 测量 通过按下窗口 m. 在 测量 窗下 结果 | 设置测量参数，选择 面积, 积分密度，以及 平均灰度值选择 好的.
- 使用 多边形工具 在图像中围绕每个细胞进行勾画。按下 m 在每个细胞后添加测量值至测量窗口。
- 当图像中所有细胞均完成定量后，将所有数值复制并粘贴到电子表格中。使用 圆形工具 在无细胞占据的区域至少进行三次背景测量。
- 使用以下公式计算每个细胞的校正总细胞荧光（CTCF）：
CTCF = 积分密度 – （所选细胞面积 × 背景灰度平均值） - 将铁处理组细胞的CTCF值与对照组细胞的CTCF值进行比较。CTCF值升高表明游离铁水平升高。
5. 细胞发光检测
- 进行发光检测的细胞处理
- 完成第1步，确保每个需要包含的条件对应的孔数为 n = 3。至少添加三个无细胞（仅完全培养基）的对照孔。每孔总共加入 100 µL 的细胞与培养基混合液。
- 将未处理的细胞过夜培养后，按需施加处理因素和对照条件。务必包括溶剂对照（未处理）组、仅含 FAC 的组、细胞毒性药物 + 10 µM ferrostatin-1（一种抗铁死亡试剂）、溶剂 + 1 µM RSL3，和/或溶剂 + 10 µM ferrostatin-1 + 1 µM RSL3 组。孵育所需时间（建议 12–24 小时，以最大化处理效应并防止过度细胞死亡）。
- 完成发光检测
- 细胞处理完成后，将发光检测试剂缓冲液组分解冻至室温。按要求混合所需组分，并避光保存直至使用。具体储存温度要求请参见试剂盒说明书。
- 细胞完成处理后，按照试剂盒说明对细胞进行操作。
注意：此过程通常包括在室温下平衡，随后加入发光缓冲液，并进行最后短暂的室温孵育。加入发光缓冲液后，所有操作均需在避光条件下进行。 - 使用酶标仪或类似仪器完成并记录发光值。
注意：本实验方案中采用的积分时间为 0.3 秒。 - 将实验孔的发光值相对于无细胞对照孔的平均发光值进行归一化处理。
注意：较高的发光值表明存活细胞数量较多。
结果
基于我们及他人先前的研究，我们提出假设：增加细胞外铁含量会导致小鼠肌细胞内铁过载，从而允许我们监测下游与铁死亡相关的反应。因此，我们建立了如图1所示的C2C12实验流程，其中细胞暴露于特定浓度的柠檬酸铁铵中，处理时间为2–24小时，具体时长取决于后续检测方法。
验证我们模型的第一步是确认柠檬酸铁铵（FAC）能够进入细胞。使用表3中描述的已验证引物，我们对铁蛋白的重链和轻链进行了qPCR检测，结果表明，随着铁输入的增加，铁蛋白mRNA水平也随之升高(图2A,B)。在蛋白质水平上，随着FAC浓度的增加，铁蛋白水平也呈现出类似的上升趋势，但该变化似乎不具有剂量依赖性(图2C)。同样，对活的、经FAC处理的C2C12细胞进行染色显示，接受细胞毒性剂量铁处理的细胞——以及同时接受高剂量铁和不稳定铁池染色作为阳性对照的细胞——在视觉上和定量上均表现出比未处理细胞以及仅暴露于铁螯合剂去铁胺（DFO）的细胞更高的铁储存量（图2D）。总体而言，这些结果表明，通过FAC引入细胞培养基中的铁确实进入了细胞内部。
在确认FAC增加了细胞内铁负荷后，我们接下来试图确定铁过载是否伴随与铁死亡相关的分子和功能变化。FAC上调了Slc40a1（铁输出蛋白）的表达（图3A），并升高了Hmox1的水平（图3B）。FAC还降低了GPX4蛋白水平，而该降低效应可被去铁胺部分逆转（图3C）。使用RSL3处理也导致GPX4水平相似程度的下降，表明FAC的反应处于更广泛的铁死亡相关分子背景之中。在功能上，细胞毒性浓度的FAC在12小时时显著降低了基于发光法的细胞活力，而这一早期活力下降可被铁死亡抑制剂-1（ferrostatin-1）所挽救（图3D）。相比之下，在24小时时，不同处理组之间的差异变得不那么明显且变异性增加（图3E）。尽管经铁死亡抑制剂-1处理的样本仍高于单独使用细胞毒性FAC的组别，但在此较晚时间点，整体检测的动态范围已减小。综上所述，这些数据表明，FAC处理可在C2C12细胞中引起铁过载、与铁死亡相关的分子改变，以及时间依赖性的、可被铁死亡抑制剂-1缓解的细胞活力下降。
图1： 铁过载模型的图解摘要。 在该模型中，C2C12细胞接种后过夜孵育，随后用不同生理相关剂量的含铁培养基处理，并进行直接分子分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：添加柠檬酸铁铵后，不稳定铁储存和铁蛋白合成增加。 （A）铁蛋白重链和（B）铁蛋白轻链的 mRNA 水平随着柠檬酸铁铵加入体系而升高。（C）向体系中添加三价铁后，FTH1 蛋白水平升高。（D）与对照组（溶剂 + 去铁胺）相比，在染色前及染色同时用三价铁处理的 C2C12 细胞中，不稳定铁水平升高。共处理条件指用培养基 + 180 µM FAC + 不稳定铁染料同时处理。误差线为±标准差（SD）。缩写：FTH1 = 铁蛋白重链；FTL1 = 铁蛋白轻链；DFO = 去铁胺。请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 添加FAC后与铁死亡相关的分子变化及细胞活力随时间下降。FAC处理后，（A）铁转运蛋白（Slc40a1）和（B）Hmox1 的mRNA水平升高。（C）GPX4蛋白在FAC处理后以及在阳性对照RSL3存在下减少；去铁胺部分逆转了FAC引起的GPX4下降。（D）C2C12细胞经FAC、RSL3和/或铁死亡抑制剂-1处理12小时后的发光强度，已归一化至无细胞（仅培养基）孔。（E）C2C12细胞经FAC、RSL3和/或铁死亡抑制剂-1处理24小时后的归一化发光强度。误差条为±标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 保持阶段 | ||||
| 1 | 以 1.6 °C/s 的速率升至 50 °C，保持 2 分钟 | |||
| 2 | 以 1.6 °C/s 的速率升至 95 °C，保持 10 分钟 | |||
| PCR 阶段（运行 40 个循环） | ||||
| 1 | 在 95 °C 下保持 15 秒 | |||
| 2 | 以 1.6 °C/s 的速率降至 60 °C，保持 1 分钟 | |||
| 熔解曲线阶段 | ||||
| 1 | 以 1.6 °C/s 的速率升至 95 °C，保持 15 秒 | |||
| 2 | 以 1.6 °C/s 的速率降至 60 °C，保持 1 分钟 | |||
| 3 | 以 0.15 °C/s 的速率升至 95 °C，保持 1 秒 | |||
表1： 第2步实验方案中的qPCR程序（持续时间：约1小时36分钟）。
| 分离胶 | 浓缩胶 | |||
| 组分 | 10% | 12.50% | 15% | |
| 丙烯酰胺 (mL) | 5.6 | 6.9 | 8.3 | 0.65 |
| 无菌水 (mL) | 6.9 | 5.3 | 3.9 | 3.05 |
| Tris/HCl, 1.5 M pH 8.8 (mL) | 4.2 | - | ||
| Tris/HCl, 0.5 M pH 6.8 (mL) | - | 1.25 | ||
| 10% 十二烷基硫酸钠 (µL) | 166 | 50 | ||
| 0.1 g/mL 过硫酸铵 (µL) | 80 | 25 | ||
| TEMED | 8.3 | 5 | ||
表2：用于成功配制Western印迹分离胶和浓缩胶所需组分及体积的汇总。 所提供的体积适用于两块凝胶，可根据需要按比例放大。百分比表示混合物中丙烯酰胺的含量。注意：过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）应在准备灌胶时最后加入，因为它们会启动凝胶的聚合反应。
| 基因靶点 | 基因符号 | 功能 | 物种 | 正向序列 | 反向序列 |
| β-2-微球蛋白 | B2m | 管家基因 | 小鼠 | TCACACTGAA TTCACCCCCA | TCACATGTCT CGATCCCAGT |
| TATA盒结合蛋白 | Tbp | 管家基因 | 小鼠 | CAGATGTGC GTCAGGCGTT | CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC |
| 铁蛋白重链 | Fth1 | 铁储存蛋白铁蛋白的一个亚基 | 小鼠 | TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA | TCATCACGGTC TGGTTTCTTTA |
| 铁蛋白轻链 | Ftl1 | 铁储存蛋白铁蛋白的一个亚基 | 小鼠 | AATGGGGTAAA ACCCAGGAGG | AGGAAGTCACA GAGATGAGGGT |
| 血红素加氧酶1 | Hmox1 | 在血红素、CO2和铁存在下将胆绿素转化为胆红素；在铁死亡过程中表达水平升高 | 小鼠 | CTAGCCTGGT GCAAGATACTG | TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC |
| 铁转运蛋白1 | Slc40a1 | 将过量铁从细胞中转运出去 | 小鼠 | GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG | TGGAGTTCTG CACACCATTGA |
表3：铁转运和铁死亡相关基因的已验证qPCR引物列表。由于这些引物用于来源于C2C12细胞的mRNA，因此具有小鼠特异性。
讨论
本研究的目的是建立一种实用的方法 体外 铁过载小鼠肌肉前体细胞模型的建立，以及铁死亡相关反应可靠检测条件的确定。利用该实验流程，我们证明了柠檬酸铁铵处理可导致细胞内铁的显著积累，伴随铁蛋白表达增加和游离铁信号升高。铁过载还与一系列符合铁死亡相关应激的分子变化相关，包括升高 Slc40a1 和 Hmox1 表达下调及GPX4蛋白减少。功能上，细胞暴露于细胞毒性FAC后，活力下降，而在早期时间点可被ferrostatin-1挽救，表明所观察到的细胞死亡中存在对铁死亡敏感的组分。
铁剂剂量和处理时间是直接影响该系统可解释性的关键参数。在我们的实验中，早期时间点（约12小时）能够在不同条件下提供最清晰的区分效果，使ferrostatin-1能够以可重复的方式挽救FAC诱导的细胞毒性。而在较晚的时间点（例如24小时），总体细胞活力下降，且各条件间的变异性增加，导致检测的动态范围减小。这一现象与持续的细胞丢失以及存活细胞群体的适应性变化一致，例如抗氧化能力增强或铁代谢改变。
使用三价铁（Fe3+）而非二价铁（Fe2+），以及所用铁的浓度和处理时间，也是该实验方案中的关键因素。使用三价铁至关重要，因为转铁蛋白可高效摄取三价铁，而转铁蛋白是介导三价铁内流的主要转运蛋白11。尽管二价铁可通过其他转运体（尤其是二价金属转运体DMT1）被细胞摄取，但在本实验背景下，三价铁的整合效率明显高于二价铁12。本方案中选用的柠檬酸铁铵（FAC）浓度，是基于其生理相关性以及既往类似模型中的使用情况而确定的13,14。铁处理持续时间为24小时，也是参考了我们团队及其他研究者的类似模型。然而，在某些实验中（特别是不稳定铁池染色和细胞发光检测），24小时的处理时间过长，导致细胞死亡过于严重，无法获得有效结论。例如，RSL3是一种极为强效的脂质过氧化诱导剂，仅需12小时处理即可诱导脂质过氧化，同时还能清晰观察到铁过载的效应(图3C-E)。此外，在使用不稳定铁探针染色时，经过尝试在2、4和24小时铁处理后染色，最终确定仅在染色前用FAC处理2小时，以捕捉细胞对铁过载的初始反应，避免因细胞过度破坏而影响结果(图2D)。总体而言，基因和蛋白水平的变化在铁处理12–24小时后检测效果最佳，可能是因为这些变化需要更长时间才能在细胞中充分显现；而染色实验则更适合在较短处理时间后进行。
其他研究者已开发出类似模型。一个研究团队构建了经三价铁处理的C2C12模型，用于研究p53-Slc7a11轴在铁死亡中的作用。他们发现，经三价铁处理48小时后，脂质过氧化水平升高，Slc7a11表达水平下降，表明发生了铁死亡13。另一个类似模型则使用硫酸亚铁处理的C2C12细胞，研究Akt-FoxO3-E3泛素连接酶通路与铁死亡之间的关系，该模型采用铁处理4小时14。这些模型的共同点在于，均是对已分化为肌管细胞的C2C12细胞进行铁处理，而非保持其更接近干细胞状态的成肌细胞形态。这使得我们的体系与先前观察到的肌肉干细胞（MuSCs）中铁积累现象具有特别的相关性。
尽管这是一种研究铁过载对肌肉影响的简单方法 体外该方法的局限性在于目前仅在C2C12细胞体系中得到应用。既往研究表明，肌肉干细胞在衰老过程中易发生铁过载，提示类似方法在此背景下也可能适用。9.
综上所述，该模型表明，铁过载足以在C2C12细胞中诱导出一组可重复的与铁死亡相关的分子变化，并导致对铁死亡抑制剂敏感的细胞活力下降。尽管在特定情况下可结合其他正交实验进一步明确细胞死亡的分类，但此处观察到的分子与药理学反应共同支持与铁死亡相关的细胞应激。我们预计，该方法将有助于研究铁代谢失调在肌肉衰老和疾病中的分子机制。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R00AG071736-04项目、威斯康星大学医学院与公共卫生学院以及威斯康星大学卡本癌症中心资助。作者谨向这些资助机构致以诚挚感谢，若无这些支持，本项目将无法实现。我们还要感谢威斯康星大学F. Jeffrey Dilworth实验室在C2C12细胞培养方面提供的宝贵见解。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 kb 蛋白质分子量标准，500 µL 规格 | Bio-Rad | 1610374 | 在 -20 °C 下保存。在冰上解冻。 |
| 15 mL 离心管 CS500 | Avantor/VWR | 89039-664 | |
| 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，29:1，500 mL 规格 | Bio-Rad | 1610156 | 为神经毒素。仅可在穿戴适当个人防护装备（实验服、手套、护目镜）时操作。 |
| 5425 / 5425 R 微型离心机 | Eppendorf | 05-414-052 | |
| 5910 Ri 离心机 | Eppendorf | 05-414-459PM2 | |
| 96 孔黑底/透明底板，TC 表面 | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| 过硫酸铵，10 g | Bio-Rad | 1610700 | 作为丙烯酰胺凝胶浇铸的聚合剂，以 10% 质量/体积浓度溶于无菌水中。粉末在室温下稳定，但溶液应长期保存于 -20 °C，短期保存于 4 °C。 |
| 抗-GAPDH 小鼠抗体，100 µg 规格 | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 在 2% BSA + 洗涤缓冲液中以 1:2000 浓度使用。在 37 kDa 处迁移。 |
| BCA 蛋白检测试剂盒（含无需稀释的 BSA 蛋白标准品） | Thermo Fisher Scientific | A55865 | 按照制造商使用说明操作。首次使用后，标准品必须在 4 °C 保存。 |
| β-肌动蛋白内参单克隆抗体 (BA3R)，DyLight 800 4X PEG | Thermo Fisher Scientific | MA515739D800 | 在 2% BSA + 洗涤缓冲液中以 1:1000 浓度使用。在 42 kDa 处迁移。 |
| BioLite 6 孔多孔板，细胞培养处理表面 | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 黑色印迹盒，9×6.5 cm，5 个/包 | Fisher Scientific | 501870983 | |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | B0126 | 用于 Laemmli 缓冲液的配制。 |
| BSA，固体，100 g | Fisher Scientific | BP9703100 | 在 4 °C 下保存。 |
| C2C12 细胞 | ATCC | CRL-1772 | 保存于液氮的气相中。 |
| cDNA Supermix QScript，500 次反应 | Avantor/VWR | 101414-108 | 在 -20 °C 下保存。在冰上解冻。 |
| 细胞刮刀，100 个/包 | Fisher Scientific | 8100240 | 由于尺寸较大，适用于从 10 cm 及更大培养皿中提取细胞。 |
| 细胞刮铲，10 英寸手柄，100 个/包 | Fisher Scientific | 08-100-241 | 由于头部较小，最适合用于从多孔板中去除细胞。 |
| CellTiter-Glo 发光细胞活力检测试剂盒，10 mL | Promega | G7570 | |
| 氯仿，99.9% | Thermo Fisher Scientific | 610281000 | 仅可在通风橱中使用，并将废液置于单独容器中处理。 |
| 不含 EDTA 的 COMPLETE 蛋白酶抑制剂片剂 | Sigma-Aldrich | 4693132001 | 将 1 片溶于 500 µL 无菌水中，制成 100× 溶液。 |
| CO2 100-120 V 培养箱 | Binder | 9640-0002 | 型号 CBS 170-120 V。用于细胞培养。 |
| 甲磺酸去铁胺，50 mg | Fisher Scientific | 5764/50 | DFO 是一种铁螯合剂，因此添加至细胞中可降低铁含量。溶于水中，配制成 1 M 储存液。 |
| 二甲基亚砜，100 mL | Fisher Scientific | D5879-100ML | 用于不稳定铁染色和再溶解。 |
| DMEM，高糖，含丙酮酸，500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dylight 680 标记山羊抗兔 IgG (H&L) | Thermo Fisher Scientific | 35568 | 以 1:5000 比例加入含 5% BSA 的洗涤缓冲液中。 |
| DyLight 800 4× PEG 标记山羊抗小鼠 IgG (H&L) 二抗 | Thermo Fisher Scientific | SA535521 | 以 1:5000 比例加入含 5% BSA 的洗涤缓冲液中。 |
| Easypet 3 单通道移液器辅助器 | Eppendorf | 4430000018 | |
| 远红不稳定 Fe²⁺ 染料 | Sigma-Aldrich | SCT037 | 通过向室温分装的样品中加入 50 µL DMSO 配制储存液。对光敏感。储存浓度：1 mM |
| 柠檬酸铁铵，500 g | MP Biomedicals | 158040 | |
| 铁死亡抑制剂 Ferrostatin，10 mg | Fisher Scientific | 502259214 | 通过螯合脂质过氧化副产物抑制体外铁死亡。溶于 DMSO 中，配制成 10 mM 储存液。 |
| 胎牛血清，Premium Plus，500 mL 瓶装 | Thermo Fisher Scientific | A5669701 | 用于补充 C2C12 细胞培养的 DMEM。按 10% 体积比添加。 |
| Flex-Tube 1.5 mL PCR 清洁无色管，500 个 | Eppendorf | 22364120 | |
| FTH1 (D1D4) 兔单克隆抗体，100 µL | Cell Signaling Technology | 4393 | 在 2% BSA + 洗涤缓冲液中以 1:1000 浓度使用。在约 20 kDa 处迁移。 |
| 甘油，超纯 | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | 用于 6x Laemmli 缓冲液的配制。 |
| GlycoBlue 共沉淀剂 (15 mg/mL)，300 μL | Thermo Fisher Scientific | AM9515 | 用于 RNA 纯化过程中可视化沉淀。 |
| Image-iT 脂质过氧化检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10445 | 即用型。对光敏感。储存浓度：10 mM |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | N/A | 用于定量 Western 印迹条带强度及显微图像的校正总细胞荧光。 |
| 倒置光学显微镜 | Zeiss | 415510-1100-000 | 用于细胞培养应用。 |
| 异丙醇，99.5%，1 L 瓶装 | Thermo Fisher Scientific | 327270010 | |
| MicroAmp 光学 96 孔反应板，10 套/箱 | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | 用于 qPCR。 |
| MicroAmp 光学粘性封膜 | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳系统 | Bio-Rad | 1658007FC | 包含凝胶浇铸架、凝胶浇铸框、电泳槽和电极。 |
| 分子级乙醇，200 proof，1 L 规格 | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 用于 RNA 纯化，以及 SDS-PAGE 凝胶制备过程中调节分离胶的水平。 |
| Nanodrop One 分光光度计 | Fisher Scientific | 134005181P4 | |
| 巴斯德移液管，1000 支 | Fisher Scientific | 22183632 | |
| PBS，pH 7.4，500 mL 瓶装 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| PCR 管及圆顶盖，8 连管，0.2 mL 容量 | Avantor/VWR | 53509-304 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 用于补充 C2C12 细胞培养的 DMEM。按 1% 体积比添加。 |
| PHOSSTOP 磷酸酶抑制剂，20 片 | Sigma-Aldrich | 4906837001 | 将 1 片溶于 1 mL 无菌水中，制成 10× 溶液。 |
| 移液管灭菌罐 | Fisher Scientific | 50-212-141 | 用于对巴斯德移液管进行高压灭菌，以用于无菌操作。 |
| 移液器吸头，滤芯，1000µL，960 支装 | Avantor/VWR | 76322-154 | |
| 移液器通用吸头，滤芯，200µL，960 支装 | Avantor/VWR | 76322-150 | |
| 移液器通用吸头，滤芯，20µL，960 支装 | Avantor/VWR | 76322-134 | |
| 移液器超细吸头，滤芯，0.5-10µL，960 支装 | Avantor/VWR | 76322-132 | |
| 酶标仪或发光检测仪 | N/A | N/A | 用于记录细胞活力检测的发光信号；本方案中使用 0.3 秒的积分时间。 |
| 丽春红染色液 | Sigma-Aldrich | P7170-1L | 即用型。用于可视化蛋白质含量。建议在预实验印迹膜上使用，因其可能干扰后续的封闭和抗体染色。 |
| Power SYBR Green 主混合液，5 mL | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | 储存液浓度为 2x。用于 qPCR。 |
| PowerPac HC 电源 | Bio-Rad | 1645052 | |
| QuantStudio 3 实时 PCR 仪（96 孔 0.2 mL 模块） | Applied Biosystems | A28132 | 用于 qPCR。 |
| Quick Start Bradford 蛋白检测试剂盒 | Bio-Rad | 5000202 | 按照制造商使用说明操作。 |
| 抗谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 兔单克隆抗体，100 µL | Abcam | AB125066 | 在 2% BSA + 洗涤缓冲液中以 1:1000 浓度使用。在约 19 kDa 处迁移。 |
| Research Plus 4 支装移液器（选项 2） | Eppendorf | 2231001168 | |
| PAGE 分离胶缓冲液 - 1 L，1-5 M Tris-HCl，pH 8.8 | Bio-Rad | 1610798 | 用于分离胶的配制。 |
| Revolve R4 荧光显微镜 | Echo | 8816455212 | 用于脂质过氧化和不稳定铁染料成像。 |
| RIPA 细胞裂解缓冲液 | Fisher Scientific | 895347 | |
| RNase Zap 清洁喷雾，250 mL | Fisher Scientific | SIGMA R2020250ML | |
| RSL3，25 mg | Fisher Scientific | 502259412 | 为 GPX4 抑制剂。由于 GPX4 可防止与铁死亡相关的过度脂质过氧化，向细胞中添加 RSL3 可诱导铁死亡。以 DMSO 配制储存液，并在 -80 °C 下冷冻保存，最长可达 1 年。初始储存浓度：10 mM。 |
| 血清学移液管，10 mL，纸/塑料 | Avantor/VWR | 75816-100 | |
| 血清学移液管，5 mL，纸/塑料 | Avantor/VWR | 76201-710 | |
| 亚硫酸氢钠，超纯，固体，500 g | Sigma-Aldrich | 243973-500G | 用于 Western 印迹运行缓冲液。 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S9888 | 用于 Western 印迹洗涤缓冲液。 |
| 十二烷基硫酸钠 (SDS)，500 g | Thermo Fisher Scientific | J18220-36 | 用于 Laemmli 缓冲液、Western 印迹运行缓冲液的配制，以及丙烯酰胺凝胶的组装。用于凝胶组装时，以 10% 质量/体积浓度溶于无菌水中。 |
| PAGE 浓缩胶缓冲液 - 1 L，0-5 M Tris-HCl，pH 6.8 | Bio-Rad | 1610799 | 用于浓缩胶的配制。 |
| SuperBlock T20 TBS 封闭缓冲液，1 L | Thermo Fisher Scientific | 37536 | |
| T100 热循环仪 | Bio-Rad | 1861096 | |
| TEMED - 5 mL | Bio-Rad | 1610800 | 丙烯酰胺凝胶浇铸的聚合剂。 |
| 组织培养 100 mm 培养皿 CS300 | Avantor/VWR | 10062-880 | |
| Trans-Blot Turbo 5x 转膜缓冲液，1 L | Bio-Rad | 10026938 | 按照制造商说明，用乙醇和无菌水配制 1× 溶液。储存液和 1× 溶液均在 4 °C 下保存。 |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi 0.2 µm 硝酸纤维素转膜试剂盒，40 次转膜 | Bio-Rad | 1704271 | 包含转膜夹心、硝酸纤维素膜、梳子、凝胶托盘、刮铲和转膜装置。 |
| 三羟甲基氨基甲烷，超纯，固体，25 g | Sigma-Aldrich | T0377-25G | 用于 Western 印迹洗涤和运行缓冲液。 |
| Tris，超纯，固体，1 kg | Fisher Scientific | BP152-1 | 用于 Western 印迹洗涤和运行缓冲液。 |
| TRIzol 试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | 仅可在通风橱中使用，并将废液置于单独容器中处理。 |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 用于 Western 印迹洗涤缓冲液。 |
| 超纯无 DNase/RNase 蒸馏水，500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Western 印迹滚轮 | Fisher Scientific | PI84747 |