整合代谢组学、转录组学、单细胞及功能分析发现，SHMT2 是肺腺癌中丝氨酸-甘氨酸-一碳（SGOC）代谢重编程、侵袭性行为以及预测免疫治疗反应性降低的生物标志物。
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整合代谢组学、转录组学、单细胞及功能分析发现，SHMT2 是肺腺癌中丝氨酸-甘氨酸-一碳（SGOC）代谢重编程、侵袭性行为以及预测免疫治疗反应性降低的生物标志物。
丝氨酸/甘氨酸-一碳（SGOC）代谢在肺腺癌（LUAD）中经常发生改变，但其与肿瘤行为及预测的免疫治疗反应性之间的关系尚未完全明确。采用内部萃取电喷雾电离质谱法对23对LUAD及相邻正常肺组织进行了代谢组学分析。分析了癌症基因组图谱LUAD队列（TCGA-LUAD）中的转录组和临床数据，以评估SHMT2的表达、预后、差异表达基因以及免疫相关特征。使用肿瘤免疫功能障碍与排除（TIDE）和癌症免疫组谱图（TCIA）评估对免疫检查点阻断的预测反应性，并利用oncoPredict推断药物敏感性。单细胞RNA测序数据用于分析SHMT2的细胞分布。实验验证包括定量逆转录PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹、人类蛋白质图谱（HPA）免疫组织化学分析，以及通过短发夹RNA（shRNA）介导的SHMT2敲低后进行增殖、伤口愈合和克隆形成实验。代谢组学分析发现甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢是LUAD中显著改变的通路。SHMT2在LUAD中上调，并与较差的总生存期及不良的临床病理特征相关。SHMT2高表达的肿瘤表现出细胞周期和SGOC相关转录程序的富集、较低的免疫和基质评分，以及降低的免疫治疗反应性预测值。单细胞分析显示SHMT2在B细胞群体中相对富集。体外实验表明，SHMT2在LUAD细胞中过表达，其敲低可抑制细胞增殖、迁移和克隆形成能力。综上所述，SHMT2与LUAD中的SGOC代谢重编程、侵袭性肿瘤表型以及免疫劣势状态相关，提示其作为生物标志物的潜在价值；而针对SHMT2的治疗靶向性尚需进一步的药理学和体内验证。
肺腺癌（LUAD）仍是全球癌症相关死亡的主要原因，其特征是显著的分子异质性、早期易发生转移以及现有治疗策略疗效持续时间有限1,2。尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）已重塑了肺腺癌的治疗格局，但持续的临床获益仅限于部分患者，且常观察到原发性与获得性耐药现象3,4。这种显著的患者间差异凸显了迫切需求：阐明塑造肿瘤免疫微环境并调控免疫治疗应答的生物学决定因素，同时识别可靶向的脆弱环节，以改进患者分层和治疗结局。
代谢重编程是恶性肿瘤进展的核心特征之一5。在各类代谢程序中，丝氨酸-甘氨酸-一碳（SGOC）代谢将糖酵解输入与氨基酸代谢及核苷酸合成相连接，为嘌呤/嘧啶的生成和甲基供体的产生提供一碳单位6。除了支持生物大分子合成外，SGOC代谢还参与氧化还原稳态的维持，并与甲硫氨酸循环相互作用，影响DNA、RNA和组蛋白的甲基化，使其处于细胞增殖与表观遗传调控的交汇点7,8。丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT2）是丝氨酸羟甲基转移酶的线粒体同工型，可将丝氨酸转化为甘氨酸，同时生成5,10-亚甲基四氢叶酸，是SGOC网络中线粒体一碳单位供应的主要入口之一9。SHMT2在多种恶性肿瘤中异常上调，与增强的增殖、侵袭、治疗耐药性以及氧化应激适应密切相关10,11,12,13。SHMT2还通过BRISC复合物与炎症信号通路相互作用，但SHMT2驱动的免疫机制在肺腺癌（LUAD）中的直接作用仍有待证实14,15。因此，SHMT2是否标志着LUAD中具有临床意义的代谢表型，以及其与肿瘤免疫微环境特征和预测性免疫治疗反应之间的关系，亟需进行系统性综合评估。
肿瘤代谢与抗肿瘤免疫之间的双向相互作用是当代癌症生物学的核心问题16。肿瘤细胞可通过竞争性消耗营养物质、积累免疫调节性代谢物以及代谢-表观遗传耦联等方式，干扰免疫细胞的功能，从而重编程免疫细胞的分化和效应功能7,16,17。增强的一碳代谢可能影响T细胞中依赖甲基化的生物学程序及其代谢适应性，但这些效应的方向和程度取决于细胞类型和营养环境17。适应性免疫调控不仅限于T细胞：B细胞、抗体应答、抗原呈递以及三级淋巴结构（TLS）均已被证实与免疫治疗疗效相关18。这些发现促使人们开展多层次分析，以在整体肿瘤、单细胞及功能层面综合评估代谢相关候选分子的作用，而不应仅凭跨平台结果的一致性就推断其因果关系。
与仅进行代谢组学研究的设计（该设计可识别出变化的代谢物，但无法确定其细胞来源或表型相关性）不同，也与仅进行整体转录组学研究的设计（该设计可能推断通路活性，却未直接观察代谢物的变化）不同，本实验流程整合了配对组织代谢组学、整体转录组学和单细胞转录组学，以及 体外 功能分析。这些层面之间的一致性有助于候选基因的优先排序，并减少对单一分析平台的依赖；然而，除非在免疫共培养实验中得到验证，否则所得证据仍仅限于与免疫调控相关的关联性证据。 体内 系统
通过配对组织代谢组学分析肺腺癌及相邻正常肺组织，首次鉴定出与甘氨酸相关的代谢紊乱。随后整合TCGA转录组及临床数据，评估SHMT2（一种线粒体丝氨酸-甘氨酸-一碳代谢通路酶），其重要性由通路相关性、肿瘤中表达上调、预后关联性及实验可操作性共同支持。进一步开展免疫微环境特征分析、单细胞图谱绘制及 体外 功能验证随后建立了一个多层次、可生成假设的框架，涵盖代谢改变、酶调控异常、细胞分布及肿瘤细胞表型。从实际应用角度而言，该工作流程需要新鲜冷冻的配对组织样本。通过质谱法进行的代谢物鉴定为半定量性质，候选代谢物应通过独立实验加以验证。免疫治疗预测（TIDE/TCIA）和药物敏感性推断（oncoPredict）均为基于转录组的计算估计值，不能替代在真实世界接受免疫检查点抑制剂治疗队列中的临床验证，应将其解读为用于生成假设的工具。
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本研究经南昌大学第二附属医院机构审查委员会批准（CDEFYYLK 3-05）。在样本采集前，所有患者均按照《赫尔辛基宣言》的规定签署知情同意书。原始数据通过材料表中所列的软件和网络资源进行导出与分析。
临床组织采集
收集了2024年1月至6月期间接受手术切除、并经病理学确诊为浸润性肺腺癌的患者的配对肿瘤组织及相应的远端正常肺组织。标本由手术医生切除后，在切除后5分钟内进行处理，立即在液氮中速冻，并储存至后续分析。去标识化的临床病理学特征见补充表1。
利用内部萃取电喷雾电离质谱法（iEESI-MS）区分肺腺癌与正常肺组织
采用混合线性离子阱-静电轨道阱质谱仪在正离子模式下，通过iEESI-MS分析组织样本（1 mm3）。甲醇提取溶剂（100%）以3.0 µL/min流速输送，并施加+5 kV电压。iEESI-MS1的扫描范围为m/z 50–2,000。iEESI-MS2采用碰撞诱导解离，归一化碰撞能量为25–35%，隔离窗口为m/z 2.0，动态排除时间为30 s。每日依据仪器标准程序进行外部校准，使质荷比误差保持在<5 ppm。经中位数归一化、log₂转换和自动缩放后，进行OPLS-DA分析并执行200次置换检验。代谢物注释采用HMDB数据库，通路富集分析则基于KEGG注释完成。
质谱数据处理与代谢物鉴定
原始质谱数据经中位数归一化处理，随后进行log₂转换和自动缩放（均值中心化并除以各变量的标准差）。采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）识别具有区分性的质荷比（m/z）特征。当变量重要性投影（VIP）> 1.0、|log₂(FC)| > 0.58 且 p < 0.05 时，判定为差异特征。对差异特征进行MS2分析，并利用人类代谢组数据库（Human Metabolome Database）进行注释。随后基于KEGG通路富集分析，识别发生改变的代谢通路，并筛选与通路相关的关键酶。注释的差异代谢物详见补充表2。
基于TCGA的SHMT2表达、生存及临床病理学关联分析
于2025年12月18日从基因组数据共享平台（Genomic Data Commons）下载了TCGA-LUAD的RNA-seq表达谱及其相应的临床注释数据，包括肿瘤样本（n = 542）和正常样本（n = 59）。将每百万映射读段中每千碱基转录本的片段数（FPKM）值转换为log2(FPKM + 1)。预后分析仅纳入具有完整生存信息的样本。采用Wilcoxon秩和检验比较肿瘤与正常组织中SHMT2的表达水平。根据SHMT2中位表达值将患者分为SHMT2高表达组和低表达组。通过Kaplan-Meier法评估总生存期，并采用log-rank检验进行比较。根据数据类型选择卡方检验或Wilcoxon检验，评估SHMT2表达与肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期、年龄和性别之间的关联。绘制1年、3年和5年生存期的时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线。所有统计学检验均为双侧检验。
差异表达分析与功能富集（GO/KEGG）
通过错误发现率 < 0.05 且 |log₂(FC)| ≥ 1 的标准，鉴定出 SHMT2 高表达组与 SHMT2 低表达组之间的差异表达基因（DEGs）。结果以火山图和前 40 个差异表达基因的热图展示，热图采用行方向 z-score 标准化。基因本体（GO）和 KEGG 富集分析采用校正后 p < 0.05 作为阈值。人类基因注释信息来源于 2025 年 12 月的 Ensembl 数据库。
免疫细胞浸润、免疫治疗反应预测及药物敏感性推断
使用 ESTIMATE 计算肿瘤微环境评分，包括免疫评分（ImmuneScore）、基质评分（StromalScore）和 ESTIMATE 评分（ESTIMATEScore）。采用 CIBERSORT 结合 LM22 参考基因集（2025 年 12 月 5 日下载）、1,000 次置换检验，并保留去卷积 p < 0.05 的样本，推断免疫细胞组成。在 SHMT2 高表达与 SHMT2 低表达肿瘤之间进行组间比较。SHMT2 与免疫检查点相关基因之间的 Spearman 相关性以相关性矩阵形式展示。免疫表型评分（Immunophenoscores）来自 TCIA，TIDE 用于免疫治疗反应性的互补预测。使用基于 2023 年 12 月 GDSC 版本训练的 oncoPredict 模型推断药物敏感性，以估算 IC50 值。组间差异采用 Wilcoxon 检验，连续变量间的关联性采用 Spearman 相关分析。
肺腺癌的单细胞RNA测序分析
单细胞转录组数据19 于2025年12月20日从基因表达综合数据库下载并进行分析。筛选检测到200–6,000个特征的细胞，并 < 保留了10%的线粒体转录本。使用LogNormalize方法对计数进行标准化，标准化因子为10,000；筛选前2,000个高变基因，并对所有基因进行缩放。主成分分析采用前20个主成分，UMAP降维使用第1至第20个维度，聚类分析的分辨率为0.5。细胞类型注释参考Human Primary Cell Atlas数据库。比较肿瘤与正常样本间的细胞类型比例，并生成Spearman相关性矩阵。分析SHMT2在已注释细胞类型中的分布情况。使用cyclone推断细胞周期状态，并通过山脊图进行可视化展示。
细胞培养
BEAS-2B、H1299 和 A549 细胞在 37 °C、5% CO2 和相对湿度约为 95% 的湿化培养箱中培养，培养基及添加物详见 材料表。
定量实时反转录 PCR（RT-qPCR）
采用基于苯酚的RNA提取试剂提取总RNA。使用逆转录预混液将提取的RNA逆转录为cDNA。逆转录反应在20 µL体系中进行，反应条件包括：42 °C去除基因组DNA 2 min，50 °C逆转录15 min，85 °C终止反应5 s。使用基于DNA结合染料的qPCR预混液，在实时荧光定量PCR系统上进行定量PCR扩增，反应程序为：95 °C预变性3 min，随后进行40个循环（95 °C变性10 s，60 °C退火延伸30 s），最后进行熔解曲线分析（95 °C 15 s，60 °C 60 s，95 °C 15 s）。所有反应均设置三个重复。以GAPDH作为内参基因，采用2−ΔΔCt 法计算相对表达量。引物储备液用双蒸水配制成10 µM浓度，避光保存于-20 °C。引物序列见补充表3。
蛋白质印迹
在冰上使用放射免疫沉淀分析缓冲液裂解细胞30分钟以提取总细胞蛋白，随后在4 °C条件下以12,000 × g 离心15分钟。蛋白样品通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至0.22 µm聚偏氟乙烯膜。膜在含5%（w/v）脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（含0.1% Tween 20，TBST）中室温封闭2小时，随后在4 °C下与抗SHMT2抗体（1:1,000）和抗GAPDH抗体（1:2,000）一抗孵育过夜，一抗使用5%脱脂奶粉-TBST稀释。用TBST（20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% Tween-20）洗涤膜三次，每次8分钟，然后室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5,000）孵育1小时。通过将等体积的溶液A和溶液B混合制备增强型化学发光底物，与膜在室温避光条件下孵育2分钟后，使用化学发光成像系统检测信号。
HPA 免疫组织化学验证
使用人类蛋白质图谱（HPA）评估了正常肺组织和肺腺癌（LUAD）中SHMT2蛋白的表达模式。在HPA中检索“SHMT2”，下载具有代表性的免疫组织化学（IHC）图像及相关病理注释进行比较。为尽量减少因抗体特异性带来的偏差，优先选择HPA中验证水平较高的抗体。在数据可用的情况下，对多个抗体的IHC结果进行交叉验证（HPA020543和HPA020549）。
在LUAD细胞中敲低SHMT2
为研究SHMT2在肺腺癌（LUAD）中对肿瘤细胞的内在作用，使用shRNA在H1299和A549细胞中进行SHMT2基因敲低。shRNA由H1启动子驱动、嘌呤霉素筛选的慢病毒载体携带；在病毒制备过程中共转染包装质粒。sh-SHMT2靶向人SHMT2编码区，而sh-NC为随机序列的阴性对照。制备的病毒原液滴度≥ 1 × 108 转导单位/mL，并保存于-80 °C。细胞感染按照材料表中所述制备的sh-SHMT2或sh-NC慢病毒颗粒。感染48小时后，通过RT-qPCR和蛋白质印迹法检测基因敲低效率。仅使用经确认实现SHMT2沉默的细胞进行增殖、迁移和克隆形成实验。
细胞增殖实验
采用CCK-8法检测细胞增殖。将转染后的H1299和A549细胞以每孔5 × 103个细胞的密度接种于96孔板中，每组设六个复孔。在第1、2、3、4和5天，向每孔加入10 µL CCK-8试剂（占培养基体积的10%），于37 °C孵育2小时。在450 nm波长下测定吸光度，并将其作为细胞活力的检测指标。
伤口愈合实验
采用划痕愈合实验评估细胞迁移能力。将转染的 H1299 和 A549 细胞接种至 6 孔板中，培养至细胞融合度达到 90–95%。使用无菌 200 µL 枪头产生线性划痕，并用磷酸盐缓冲液轻柔洗涤以去除脱落细胞。随后将细胞维持在无血清或低血清培养基中，在倒置显微镜下分别于 0 h 和 24 h 拍摄划痕区域图像。根据材料表中所列的图像分析软件，对划痕闭合程度进行定量分析，并以相对于初始划痕面积的百分比减少值表示。
集落形成实验
进行集落形成分析时，将转染的 H1299 和 A549 细胞以每孔 800 个细胞的密度接种至 6 孔板中，培养约 10–14 天，直至形成可见的细胞集落，并在培养期间进行显微镜下监测。集落于室温下用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟，再于室温下用 0.1% 结晶紫染色 15 分钟。在光学显微镜下计数包含超过 50 个细胞的集落。
统计分析用于 体外 实验
全部 体外 实验均独立重复至少三次。数据以均值表示 ± 标准差。两组比较采用学生t检验， p < 0.05 被视为具有统计学显著性。
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组织代谢组学揭示肺腺癌中广泛的代谢重塑，其中甘氨酸相关通路显著富集
通过直接iEESI-MS对23例LUAD患者的配对肿瘤组织及相邻正常肺组织进行了代谢谱分析；患者特征及差异代谢物注释详见补充表1和补充表2。经log2归一化后，OPLS-DA模型显示肿瘤与正常组织的代谢谱之间存在明显分离（R2X = 0.824，R2Y = 0.968，Q2 = 0.757）（图1A）。模型可靠性进一步通过200次置换检验得到验证，R2和Q2的截距分别为0.789和−0.451（图1B）。根据预设筛选标准——投影变量重要性（VIP）> 1，|log2(FC)| > 0.58，且p < 0.05，共鉴定出45个差异...
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本研究采用了一种顺序研究框架，包括代谢组学发现、酶的优先排序、转录组学解读、免疫微环境评估、单细胞定位以及肿瘤细胞功能验证。分析结果揭示了肺腺癌（LUAD）中与甘氨酸相关及一碳代谢（SGOC）的代谢重塑，并将SHMT2与不良预后及较低的计算预测免疫治疗获益相关联。该优先排序策略优于仅依赖单一组学层面的方法，但并未确立其免疫因果机制。
SHMT2 是丝氨酸转化为甘氨酸并生成一碳单位的主要线粒体入口。TCGA-LUAD 分析显示，肿瘤相关性 SHMT2 表达上调，并将高表达水平与较差的生存率及不利的临床病理特征相关联。这些发现与多项研究结果一致，后者表明 SHMT2 与癌细胞的存活、增殖、侵袭以及治疗耐药性相关20,21,22,23。其他研究还揭示了 SHMT2 在表观遗传调控中的作用，并推动了选择性一碳代谢酶抑制剂的研发
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作者声明无竞争利益。
作者感谢参与本研究的患者及其家属。作者同时感谢癌症基因组图谱（TCGA）、基因表达综合数据库（GEO）和人类蛋白质图谱（HPA）数据库的贡献者公开共享其数据。本研究由江西省重点研发计划（项目编号：20223BBG71009）和国家自然科学基金（项目编号：81860379 和 82160410）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A549 细胞 | CCL-185 | ATCC | |
| 抗 GAPDH 抗体 | M1310-2 | Huaan Biotechnology | |
| 抗 SHMT2 抗体 | D197021 | Sangon Biotech | |
| BEAS-2B 细胞 | CRL-9609 | ATCC | |
| 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | K1018 | APExBIO | |
| 数据库：TCGA / GDC | 访问日期 2025-12-18 | 美国国家癌症研究所（NCI） | |
| 数据库：GEO | 访问日期 2025-12-20 | NCBI | |
| 数据库：HMDB | 访问日期 2025-12-12 | 人类代谢组数据库（Human Metabolome Database） | |
| 数据库：KEGG | 访问日期 2025-12-11 | Kanehisa 实验室 | |
| 数据库：人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas） | Protein Atlas | ||
| 数据库：GDSC | 2023-12 版本 | 桑格研究所（Sanger Institute） | |
| 数据库：Ensembl | 2025-12 | EMBL-EBI | |
| 数据库：TCIA | 访问日期 2025-12-10 | 癌症免疫组图谱（The Cancer Immunome Atlas） | |
| H1299 细胞（NCI-H1299） | CRL-5803 | ATCC | |
| HRP 标记二抗 | D110087 | Sangon Biotech | |
| HiScript II Q Select RT 超级混合液 | KR116 | Tiangen Biotech | |
| LightCycler 480 系统 | 5015278001 | Roche | |
| 脱脂牛奶 | 常见实验试剂 | BD（或实际使用品牌） | |
| PVDF 膜，0.22 µm | GVHP00010（或常见实验试剂） | MilliporeSigma（或实际使用品牌） | |
| R 软件包：pRoloc | 1.40.0 | Bioconductor | |
| R 软件包：TCGAbiolinks | 2.26.0 | Bioconductor | |
| R 软件包：survival | 3.4-0 | CRAN | |
| R 软件包：survminer | 0.4.9 | CRAN | |
| R 软件包：timeROC | 1.0.4 | CRAN | |
| R 软件包：DESeq2 | 1.38.1 | Bioconductor | |
| R 软件包：ggplot2 | 3.4.4 | CRAN | |
| R 软件包：pheatmap | 1.0.12 | CRAN | |
| R 软件包：clusterProfiler | 4.6.2 | Bioconductor | |
| R 软件包：org.Hs.eg.db | 3.16.0 | Bioconductor | |
| R 软件包：estimate | 1.0.13 | Bioconductor / GitHub | |
| R 软件包：CIBERSORT | 1 | （独立 R 脚本） | |
| R 软件包：corrplot | 0.92 | CRAN | |
| R 软件包：TIDE | 0.3.0 | R 软件包 | |
| R 软件包：oncoPredict | 1.1.1 | CRAN / GitHub | |
| R 软件包：GEOquery | 2.66.0 | Bioconductor | |
| R 软件包：Seurat | 4.3.0 | CRAN | |
| R 软件包：SingleR | 1.10.0 | Bioconductor | |
| R 软件包：scran | 1.26.0 | Bioconductor | |
| SYBR Green qPCR 通用主混合液 | HY-K0501A | MedChemExpress (MCE) | |
| TRIzol 通用试剂 | DP424 | Tiangen Biotech |
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