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方法文章

负载3BDO的可溶性微针贴片的制备与表征及其在C57BL/6小鼠中的生发研究

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DOI：

10.3791/71814

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2026年8月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Stomatology, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了负载3BDO的可溶性微针贴片的制备、表征及其在小鼠毛发再生模型中用于经皮药物递送的应用。

摘要

雄激素性脱发（AGA）的传统治疗方法存在局限性，促使人们探索替代的递送方式。本实验方案描述了负载3BDO的透明质酸/壳聚糖（HA/CS）可溶性微针（MN）贴片在C57BL/6小鼠毛发再生模型中的制备、表征与应用。该方法采用两步模塑法，在聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中将3BDO富集于微针尖端，同时形成不含药物的HA/CS背衬层。通过扫描电子显微镜（SEM）成像、力学测试、皮肤插入与溶解测试、体外释放实验、抗菌实验、细胞毒性测试以及体内毛发再生评估对微针贴片进行表征。微针插入皮肤后，针尖溶解并实现3BDO的局部释放。体内评估结果显示，与皮下注射组和对照组相比，负载3BDO的微针组表现出更均匀的毛发再生。本方案还支持对贴片形态、插入性能及局部生物相容性的评估。该方法为评估微针介导的3BDO递送用于毛发再生应用提供了临床前工作流程。

引言

雄激素性脱发（AGA）是最常见的临床脱发疾病之一，主要表现为头皮毛发进行性变细和脱落。该病在男性中的终生患病率持续处于较高水平，已成为亟待解决的重要健康问题1,2。目前，AGA 的临床治疗主要分为药物干预和外科移植两大类，但二者均存在显著局限性。一线治疗药物如非那雄胺和米诺地尔虽具有一定的疗效，但可引发性功能障碍、头皮瘙痒和头皮干燥等明确的不良反应1,3。尽管毛发移植可实现局部毛发再生，但受限于治疗费用高、供体区域毛发数量不足以及移植存活率不稳定等因素，难以在临床实践中广泛推广1。鉴于上述局限，亟需开发兼具有效性、安全性和良好患者依从性的新型治疗策略。

3BDO 是一种与雷帕霉素竞争的小分子 mTOR 激活剂4。它已被广泛用作多种系统中的自噬抑制剂5,6,7。例如，长期使用 3BDO 可通过减少自噬体数量来改善记忆功能8。此外，越来越多的证据表明，3BDO 可能独立于 mTOR 活性发挥 mTOR 激活作用。例如，3BDO 能够在小鼠中抑制内皮细胞死亡和动脉粥样硬化的发展，且该作用独立于 mTOR 活性9。然而，其在毛囊生长中的潜在作用尚未见报道。值得注意的是，在我们的初步研究中发现，3BDO 能够促进毛发再生。然而，传统的局部给药方法存在明显局限性。皮肤角质层限制了药物的透皮效率，使得药物难以递送至真皮层中的毛囊靶部位。尽管透皮凝胶可延长药物滞留时间，但可能留下不理想的残留物。上述两种治疗策略的临床疗效仍不理想10,11。

微针（Microneedles, MNs）是一种新型的无痛药物递送技术，其核心优势在于能够轻松穿透角质层，并将药物精准递送至表皮与真皮交界处的毛囊周围微环境。此外，微针具有使用便捷、微创性小和成本合理等特点12,13,14。为解决外用3BDO透皮递送的瓶颈问题，本研究采用透明质酸（hyaluronic acid, HA）作为基质，壳聚糖（chitosan, CS）作为功能组分，开发了一种微针贴片。引入CS旨在赋予该系统潜在的抗菌功能。此外，透明质酸应用于脱发小鼠皮肤可显著促进毛囊发育15。因此，本实验方案描述了一种负载3BDO的可溶性微针系统的制备与表征方法，并将其应用于脱毛C57BL/6小鼠毛发生长模型。该模型可用于评估脱毛后毛发再生的反应，但其本身并不能确立该疗法对雄激素性脱发（AGA）的临床疗效。

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方案

本研究经山东第一医科大学动物伦理委员会批准 & 山东省医学科学院（W202112030345）。所有方法均依照相关指南和法规进行。

1. 3BDO@MN 贴片的制备

  1. CS/HA 配方的制备
    1. 称取 1 g CS 粉末（脱乙酰度 ≥ 95%），加入 20 mL 蒸馏水中，室温（RT）下搅拌 10 分钟。
    2. 继续加入 0.4 mL 的 2%（v/v）乙酸溶液（分子量 60.05），持续搅拌 2 小时。
      警告：浓乙酸具有腐蚀性。稀释和操作时应在通风橱中进行，并佩戴一次性手套和护目镜，避免接触皮肤和黏膜。
    3. 继续加入 2 g HA 粉末，然后将混合配方在 1,207 × g（约 3,000 rpm）条件下离心 5 分钟，以确保完全溶解。
      ​注意：CS/HA 配方应新鲜配制，可在 4 °C 冰箱中保存不超过 24 小时。
  2. 载 3BDO 的 CS/HA 配方的制备
    1. 将预先溶解的 3BDO 溶液（2 mg/mL）加入二甲基亚砜（DMSO）中。
      警告：DMSO 可穿透皮肤。操作时应佩戴手套，避免直接皮肤接触，并将其加入 CS/HA 配方中。混合以确保完全溶解。
    2. 将混合配方在 1,207 × g 条件下离心 5 分钟，以去除任何夹带的气泡。
      ​注意：若离心后仍有气泡残留，可让配方静置 5 分钟，再进行一次离心。
  3. 3BDO@MN 贴片的制备
    1. 使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微针模具，其具有 20 × 20 排列的圆锥形针尖，高度为 600 µm，底面直径为 250 µm，间距为 550 µm。
    2. 使用等离子清洗机处理 PDMS 模具表面，使其完全亲水。
    3. 向 PDMS 微针模具中加入 1 mL 的 3BDO@CS/HA 配方。将模具置于真空室中，抽真空 10 分钟，以促进黏稠配方渗入微孔中。
    4. 在室温（RT）下以 134 × g 离心 5 分钟，确保配方填满所有孔腔。使用无菌金属刮刀小心刮除模具表面多余的配方，留下完全平整的表面。
    5. 将不含 3BDO 的 CS/HA 基质混合物涂布于模具表面。在室温下以 134 × g 离心 5 分钟，形成均匀的背衬层。
    6. 将模具置于 36 °C、37% 湿度的烘箱中，干燥过夜（约 12–16 小时）。
    7. 待模具冷却至室温后，从模具上剥离完全干燥的微针贴片。
      注意：制备好的 3BDO@MN 贴片应保存在 4 °C 冰箱中，直至使用。

2. 3BDO@MN 贴片的表征

  1. 使用双面导电碳胶带将制备好的 3BDO@MN 贴片固定在样品台上。
    1. 对固定好的样品进行溅射镀金（或铂）处理，形成一层薄金属层，以增强导电性。
    2. 将样品台装入场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）的真空腔室中。
    3. 调节加速电压和工作距离，以获得高分辨率图像。观察微针阵列的整体形貌及单根微针的表面精细结构。
    4. 获取具有代表性的扫描电镜图像，并测量微针的长度和针尖直径。
  2. 机械强度测试
    1. 将微针贴片平整地放置在质构分析仪的样品测试台上，确保基底完全平整，针尖垂直向上。
    2. 将一个直径为 25 mm 的平面圆柱形探头牢固地安装在仪器的载荷传感器上。
    3. 垂直下移探头，使其位于微针针尖正上方，但在测试开始前避免探头与针尖发生任何物理接触。
    4. 在软件中设置特定的测试参数：下压速度设为 0.05 mm/s，目标位移距离设为 0.7 mm。
  3. 溶解性测试
    1. 将大鼠背部皮肤平铺在解剖板上，并用吸水纸轻轻吸干皮肤表面，保持皮肤平整无皱褶。
    2. 将干燥的微针贴片针尖朝下放置于皮肤表面，并施加均匀的垂直压力，确保微针插入皮肤。
    3. 在预设的时间点（5、10、30 和 60 秒）将贴片从皮肤上取下，并干燥 5 分钟。
    4. 在相同的成像条件下，通过扫描电镜观察残留微针的形貌。
  4. 体外药物释放实验
    1. 向 6 孔板的每个孔中加入 500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS），并将载有 3BDO 的微针放入各孔中，使其与 PBS 接触。
    2. 在室温下孵育。在每个时间点，收集 500 µL PBS 用于测定 3BDO 的浓度。
    3. 立即向每个孔中补充 500 µL 新鲜 PBS，以维持漏槽条件。
    4. 根据微针中初始载药总量，计算 3BDO 累积释放百分比。
  5. 抗菌实验
    1. 从 -80 °C 保存条件下取出细菌菌种（E. coli 和 Staphylococcus aureus），分别取 10 µL 菌液接种至 5 mL LB 培养基中。
    2. 将接种后的培养基置于 37 °C、250 rpm 摇床中孵育约 16 小时（过夜）。
    3. 用 LB 培养基将细菌培养液稀释至初始 OD620 为 0.01。
    4. 用无菌水稀释壳聚糖（CS）储备液，配制六种浓度的 CS 溶液（1、5、10、50、100 和 500 mg/mL），每种浓度设三个重复。
    5. 将样品分为三组：空白组、对照组和 CS 组。空白组加入 200 µL LB 培养基；对照组加入 180 µL 菌液和 20 µL 无菌水；CS 组加入 180 µL 菌液和 20 µL 对应浓度的 CS 溶液。
    6. 在 37 °C 下孵育 20 小时。
    7. 使用酶标仪在 0 小时和 20 小时分别测定 96 孔板各孔的 OD620 值，并记录结果。
  6. 细胞毒性评价
    1. 向 96 孔板中每孔接种 100 µL 表皮或真皮细胞悬液（每孔含 2 × 103 个细胞）。
    2. 向指定孔中加入 10 µL 相应处理液，设立四组：对照组（培养基）、3BDO 组（终浓度为 1 µM）、微针提取物组和 3BDO+微针提取物组，每组设三个重复。
    3. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。
    4. 每孔加入 10 µL Cell Counting Kit-8（CCK-8）工作液。
      注意：加样时避免产生气泡，以免影响吸光度读数。
    5. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续孵育 2 小时。
    6. 使用酶标仪在 450 nm 波长下测定所有孔的吸光度。
    7. 分析数据并计算细胞存活率。

3. 动物实验

  1. 实验动物准备与处理
    1. 使用异氟烷麻醉7周龄雄性C57BL/6小鼠，并在麻醉期间提供体温调节。
      警告：异氟烷为挥发性麻醉剂，应在通风良好的环境中操作，避免吸入过量。
    2. 为小鼠眼部涂抹眼用润滑剂，防止角膜干燥。
    3. 使用电动剃毛器剃除小鼠背部毛发，剃毛区域约为2 × 2 cm2。
    4. 涂抹脱毛膏，等待5–10秒后擦除。用生理盐水棉签擦拭皮肤，以清除残留的脱毛膏和毛发。
    5. 修剪微针贴片并备用。
    6. 将剃毛后的小鼠随机分为五组（每组n = 5），并按以下方式处理：
      1. 未处理对照组：仅剃除毛发，不进行任何处理。
      2. 空白微针贴片组：使用不含3BDO的微针贴片处理剃毛皮肤，处理频率与3BDO@MN组相同。
      3. 3BDO@MN贴片组：于第1、3、5、7、9、11和13天使用3BDO@MN贴片处理剃毛皮肤。
      4. PBS皮下注射组：每日向小鼠背部剃毛区域皮下注射PBS溶液。
      5. 3BDO皮下注射组：每日向小鼠背部剃毛区域皮下注射3BDO溶液。
    7. 将3BDO@MN贴片贴附于剃毛皮肤上，并施加均匀的垂直压力，以确保微针插入皮肤。使用弹性绷带固定3BDO@MN贴片，并用直夹钳固定绷带。
      ​注：不同给药方案的选择依据各策略不同的递送特性：3BDO@MN贴片实现局部持续释放，而皮下注射则以推注方式递送3BDO。
    8. 在整个实验过程中观察小鼠，确保其从麻醉中完全恢复。
  2. 样本采集与毛发生长评估
    1. 每日拍摄小鼠背部皮肤照片，记录毛发生长情况。
    2. 于第15天通过测量毛干直径、毛发覆盖面积和毛发密度来评估毛发再生情况。使用ImageJ软件量化处理区域的毛发覆盖百分比。

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结果

本方案介绍了3BDO@MN贴片的制备与表征方法。图1 展示了3BDO@MN贴片的制备流程示意图。将3BDO混入CS/HA配方中，得到的基质混合物被加入PDMS微针模具中，并通过离心填充至针尖。随后，将不含3BDO的CS/HA基质混合物涂布于模具表面，并通过离心填充背衬层。完全干燥后，将贴片剥离，获得3BDO@MN贴片。如图2A所示，采用扫描电镜（SEM）对微针的形貌进行表征。

圆锥形微针在15 × 15 mm的贴片上以20 × 20阵列均匀排列，每根微针底部宽度为 250 µm 高度为 600 µm. MN针尖可承受1.2 N的力，足以穿透皮肤，这由苏木精-伊红（H&E）染色后观察到的清晰插入针孔所证实&E）染色（图2B，C）。随后采用小鼠背部皮肤测试3BDO@MN贴片的应用效果。将贴片按压至小鼠皮肤上以测定其溶解时间，微针尖端在...

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讨论

目前，雄激素性脱发（AGA）的临床治疗主要分为药物干预和外科移植两类。本研究中，载有3BDO的微针（MNs）在C57BL/6小鼠模型中促进了毛发再生。然而，传统的药物递送方法存在诸如药物分布不均等局限性。本研究的关键实验方案是一种两步法制备载3BDO微针的方法。透明质酸（HA）和壳聚糖（CS）是微针的主要组成成分。为确保微针质量，需重点关注若干关键步骤。

首先，为了避免聚合物溶液中产生气泡，采用预冷的模具以减缓离心过程中溶剂的挥发。其次，干燥条件直接影响针尖的脆性和背衬层的完整性。在 36 °C 通过控制湿度，确保了笔尖具有足够的机械强度，同时保持了背衬层的柔韧性，避免过度干燥。第三，速度为134 × g 5分钟可有效将3BDO富集于尖端区域，但更高的转速或更长的时间可能导致药物在模具底部析出，从而降低递送效率。对于 体内 实验中采用C57BL/6小鼠作为毛发再生模型。C57BL/6小鼠的毛囊具有明显且高度同步的毛发生长周期，便于实验操作，因此成为研究皮肤疾病最常用的模型之一16。约7周龄时，C57BL/6小鼠的毛囊自然进入休...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（82273554）、山东省医药卫生科技发展计划项目（No.202304030716）、中国国家大学生创新创业训练计划（No. 202410439001）和泰安市科技创新发展计划项目（No. 2023NS232）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3BDOYuanye Bio-Technology Co., Shanghai, China890405-51-3制备载3BDO的壳聚糖/透明质酸（CS/HA）制剂
6孔板Corning Incorporated, USAREF 3516抗菌实验和体外药物释放实验
75%乙醇山东利康医疗科技有限公司1202050004消毒
96孔板Corning Incorporated, USAREF3599细胞毒性评价和抗菌实验
C57BL/6小鼠Charles River Laboratories7周动物实验
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）Dojindo, 日本CK04细胞毒性评价
离心机Thermo Fisher Scientific75007204制剂离心
壳聚糖（CS） 上海麦克林生化科技有限公司9012-76-4制备CS/HA制剂
脱毛膏Veet3059944023307脱毛
二甲基亚砜（DMSO）上海麦克林生化科技有限公司67-68-5制备载3BDO的CS/HA制剂
电子天平RadwagAS 220.R2粉末称量
大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）ATCC/抗菌实验
透明质酸（HA）粉末华熙生物科技股份有限公司，中国9067-32-7制备CS/HA制剂
ImageJ软件美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）/统计分析
恒温振荡培养箱Thermo Scientific  50163013细菌培养
异氟烷麻醉机Gene&IAMS动物麻醉
LB培养基Sigma Life ScienceL3022抗菌实验
磁力搅拌器杭州米欧仪器有限公司SP-16制剂搅拌
Multiskan SkyHigh酶标仪Thermo Fisher Scientific/OD值测定
烘箱上海惠泰仪器制造有限公司DHG-9260A微针干燥
Parafilm封口膜M型Amcor PM-996微针密封
磷酸盐缓冲液（PBS）BiosharpBL302A体外药物释放实验
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）ATCC/抗菌实验
Universal TA质构分析仪上海腾拔仪器科技有限公司/机械强度测试
真空干燥箱上海惠泰仪器制造有限公司DZF-6050真空干燥

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