用于评估PTDSS1和PTDSS2作为预后及免疫生物标志物的多组学泛癌生物信息学工作流程

摘要

本研究利用多个公共数据库进行了全面的生物信息学分析，以评估PTDSS1和PTDSS2在多种癌症中的基因表达模式、临床相关性、生存预后、肿瘤干性评分及免疫相关特征。研究结果表明，这些基因可能作为癌症诊断、预后评估和免疫治疗的潜在生物标志物。

摘要

磷脂丝氨酸合成酶 PTDSS1 和 PTDSS2 在细胞过程中发挥重要作用，包括膜组成和信号转导。这些酶的异常表达与乳腺癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润及较差的生存预后相关。然而，它们在不同癌症类型中的综合作用仍不明确。在本研究中，我们进行了泛癌分析，以评估 PTDSS1 和 PTDSS2 在诊断、预后、免疫浸润及免疫治疗中的相关性。我们利用多个公共数据库，分析了多种癌症中基因表达模式、临床相关性、生存结果、肿瘤干性评分及免疫相关特征。结果显示，PTDSS1 和 PTDSS2 在人体组织中广泛表达，并且在大多数肿瘤组织中的表达水平显著高于正常组织。PTDSS1 或 PTDSS2 的高表达与多种癌症类型的总体生存期（OS）较差相关，并且与临床分期和肿瘤干性评分具有显著相关性。此外，功能分析表明，这些基因可能参与肿瘤发生、免疫调控及化疗耐药过程。总体而言，研究结果强调了 PTDSS1 和 PTDSS2 在多种癌症中的预后意义，并提示它们可能作为癌症诊断与预后的潜在生物标志物，以及免疫治疗的潜在靶点。

引言

尽管在过去几个世纪中肿瘤学已取得重大进展，癌症仍然是全球主要的死亡原因和疾病负担之一^1,2。目前的临床管理日益依赖多模式治疗策略，通过结合不同的治疗方法以最大化疗效，同时提高患者的生存率和整体健康状况²。在这一背景下，癌症免疫治疗已迅速发展成为现代肿瘤学的核心支柱之一。其优势包括靶向选择性强、治疗效果持久、适用于多种肿瘤类型、能够减轻耐药性以及与其他疗法具有良好的兼容性，这些优势推动了该领域的广泛关注。然而，其临床应用仍受到多种因素的限制，包括患者应答的个体差异、免疫相关毒性、获得性耐药、高昂的经济负担以及治疗监测方面的局限性。这些挑战凸显了该领域持续优化与创新的必要性。与此同时，代谢重编程已被确认为癌症的重要特征之一，其中脂质代谢正受到越来越多的关注。脂质获取、合成和利用的改变为肿瘤细胞的生长和存活提供了必要的支持，也可能在治疗耐药性的形成中发挥重要作用^3,4。重编程的脂质摄取与利用可支持癌细胞的增殖，并可能促进治疗耐药性的产生⁵。此外，脂质相关生物标志物已被发现与患者的预后及治疗反应相关^6,7。尽管关注度日益增加，但脂质代谢在癌症中的作用机制以及有效靶向脂质代谢疗法的开发仍缺乏充分理解，亟需进一步研究。

磷脂酰丝氨酸合成酶PTDSS1和PTDSS2是负责合成磷脂酰丝氨酸（PS）的关键酶^8,9,10，PS是细胞膜中主要的阴离子磷脂之一¹¹，对维持膜结构和功能至关重要^8,12,13。这两种酶具有中等程度的序列相似性（约32%）¹³，并含有多个跨膜区，主要定位于内质网和线粒体相关膜^14,15,16。PS通过与现有磷脂发生丝氨酸交换反应生成^8,9，其中PTDSS1优先利用磷脂酰胆碱^17,18，而PTDSS2则利用磷脂酰乙醇胺^19,20。PTDSS1在多种组织中广泛表达²¹，而PTDSS2的分布较为局限，在小鼠脑神经元和睾丸支持细胞中表达水平较高¹⁹。功能上，PTDSS2对正常睾丸发育至关重要，约10%的PTDSS2基因敲除雄性小鼠表现出不育和睾丸体积减小，而PTDSS1缺陷小鼠未见此类表型¹⁹。尽管单独缺失任一基因均不影响存活，但两者同时缺失会导致胚胎致死^19,22，凸显了PS生物合成在细胞存活中的重要性。最近的研究表明，肿瘤中PTDSS1和PTDSS2的异常调控与乳腺癌患者肿瘤相关巨噬细胞浸润改变及生存率降低相关²³。综上所述，这些发现表明PTDSS1和PTDSS2在膜稳态中起关键作用，其异常表达可能促进疾病进展，尤其是在癌症中。

本研究系统比较了PTDSS1和PTDSS2在肿瘤表达、预后、干性、免疫调控、基因组改变及治疗反应等方面的泛癌效应。与以往仅关注单一癌种或孤立脂质代谢事件的研究不同，本研究整合了多组学数据，以探索磷脂酰丝氨酸生物合成、肿瘤免疫与癌症进展之间的潜在关联。分析内容包括表达模式、与肿瘤特征及免疫相关因子的相关性、基因组特征以及药物敏感性预测。本研究旨在深入理解PTDSS1和PTDSS2在不同恶性肿瘤中的功能作用，为个性化治疗策略的开发提供理论依据和实践指导。

方案

本研究完全基于公开可用的数据集，未涉及直接的人类或动物参与，因此无需机构伦理审批和知情同意

1. PTDSS1 或 PTDSS2 表达分析

1. 利用人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）数据库（https://www.proteinatlas.org）评估PTDSS1和PTDSS2 mRNA在正常人体组织中的表达情况。
2. 从TIMER2平台的“Gene DE”模块（http://timer.cistrome.org/）获取PTDSS1和PTDSS2基因在多种癌症类型中的表达谱。
3. 从TCGA（http://cancergenome.nih.gov）和GTEx（http://commonfund.nih.gov/GTEx/）数据库下载正常组织和肿瘤组织的RNA-seq表达数据。

2. 病理分期、生存率及肿瘤干性分析

1. 从 UCSC Xena 平台（https://xenabrowser.net/）下载 TCGA 泛癌（PANCAN，N = 10,535，G = 60,499）数据集。
2. 从所有样本中提取 PTDSS1 和 PTDSS2 的表达数据，并排除表达值为零的条目。使用 log2(x + 0.001) 转换对剩余的表达数据进行标准化。
3. 剔除样本数少于三个的癌症类型，最终得到包含 37 种肿瘤类型的数据库。使用 R 软件对不同临床分期进行差异表达分析。
4. 采用非配对 Student t 检验评估两组之间的统计学显著性，采用方差分析（ANOVA）评估多组之间的差异²⁴。
5. 从 UCSC Xena 平台（https://xenabrowser.net/）获取 TCGA 泛癌数据集。提取 PTDSS1 和 PTDSS2 的表达谱，并排除表达值为零的样本。
6. 剔除随访时间短于 30 天的病例。使用伪计数为 0.001 的 log2 转换对剩余表达数据进行标准化。
7. 排除样本数少于 10 个的癌症类型，最终得到包含 39 种癌症类型且具有相应总生存期（OS）信息的数据集。使用 R 软件包 survival 进行生存分析。
8. 使用 coxph 函数构建 Cox 比例风险模型，以评估 PTDSS1/PTDSS2 表达水平与不同癌症患者预后之间的关联。采用 log-rank 检验评估生存差异²⁴。
   注意：由于 TCGA 中不同肿瘤类型的临床注释数据存在异质性且部分信息不完整，因此在 Cox 回归分析中未统一纳入其他临床协变量（如年龄、性别和肿瘤分期）。
9. 从 UCSC Xena 平台（https://xenabrowser.net/）获取 TCGA 泛癌数据集。提取 PTDSS1 和 PTDSS2 的表达谱，并基于 DNA 甲基化特征计算肿瘤干性指数。
10. 将干性评分与基因表达数据整合用于后续分析。排除表达值为零的样本，并使用 log2 转换对剩余表达数据进行标准化。
11. 剔除样本数少于三个的癌症类型，以提高分析的可靠性。进行 Pearson 相关性分析，以评估 PTDSS1/PTDSS2 表达水平与不同癌症类型中肿瘤干性之间的关联 24。
    注意：排除表达值为零的样本是为了减少技术噪声和在基于 log 转换的标准化过程中未定义值的潜在影响。该原则同样适用于后续步骤。

3. 生存预后分析

1. 使用基因表达谱交互分析平台（GEPIA）中的“Stage Plot”模块（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析PTDSS1/PTDSS2表达水平与肿瘤分期之间的关联。
2. 利用KM Plotter数据库（https://kmplot.com/analysis/）评估PTDSS1和PTDSS2在多种癌症类型中的预后意义。
3. 根据中位表达值将患者分为高表达组和低表达组（高值截断值 = 50%，低值截断值 = 50%）。
4. 使用GEPIA2生成PTDSS1和PTDSS2在TCGA肿瘤中的总生存期（OS）显著性图谱和Kaplan–Meier生存曲线。采用log-rank检验评估统计学显著性。

4. PTDSS1 或 PTDSS2 相关基因分析

1. 从 STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）获取 PTDSS1 和 PTDSS2 的蛋白质-蛋白质相互作用网络，选择 Homo sapiens 中经实验验证的相互作用，参数设置如下：最低相互作用评分 = 0.150（低置信度），完整网络类型，基于证据的边，最大互作蛋白数 = 50。
2. 利用 GEPIA2 中的“相似基因检测”模块（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index），识别潜在共表达基因，并选取相关性最高的前 100 个基因进行后续分析。
3. 使用 TIMER2.0 的“Gene_Corr”模块（http://timer.cistrome.org/），评估 PTDSS1/PTDSS2 与前 10 个互作蛋白在多种肿瘤类型中的表达相关性，并以热图形式可视化结果。
4. 通过 KEGG REST API（https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）获取京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路注释，并将其作为功能富集分析的参考背景。
5. 使用 R 软件包 clusterProfiler 进行基因集富集分析，基因集大小范围设定为 5 至 5000。
   注：统计学显著性定义为 P < 0.05 且错误发现率（FDR）< 0.25。
6. 利用 DAVID 数据库进行基因本体（GO）富集分析，包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），并通过 microbiome 平台可视化富集通路。

5. 基因改变分析

1. 基于 TCGA 泛癌图谱研究队列，利用 cBioPortal 平台（http://www.cbioportal.org/）分析 PTDSS1 和 PTDSS2 在多种癌症类型中的突变谱。
2. 使用“OncoPrint”和“Cancer Types Summary”模块，检查 PTDSS1 和 PTDSS2 的变异频率及变异类型。通过“OncoPrint”模块可视化各样本中的突变、拷贝数变异以及基因表达改变情况。
3. 在“Cancer Types Summary”和“Mutations”部分中分别查询 PTDSS1 或 PTDSS2，以获取有关变异位点、突变类型及其在不同癌症类型中分布的详细信息。
4. 从 UCSC Xena 数据库（https://xenabrowser.net/）下载 TCGA 泛癌（PANCAN，N = 10,535，G = 60,499）数据集。提取每个样本中 PTDSS1 和 PTDSS2 的表达数据，并获取相应的微卫星不稳定性（MSI）评分。整合基因表达数据与 MSI 数据用于后续分析。
5. 剔除表达值为零的样本，并对剩余数据采用 log2(x + 0.001) 进行转换。去除样本数少于三个的癌症类型，最终获得包含 37 种癌症类型的基因表达和 MSI 数据集²⁴。
6. 从 UCSC Xena 数据库获取 TCGA 泛癌数据集，并提取每个样本中 PTDSS1 和 PTDSS2 的表达数据。从 GDC 门户（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载经 MuTect2 处理的 4 级单核苷酸变异数据。
7. 使用 maftools R 软件包中的 TMB 函数计算每个样本的肿瘤突变负荷（TMB），并将 TMB 值与对应的基因表达数据进行整合。
8. 剔除表达值为零的样本，并对剩余数据采用 log2(x + 0.001) 进行转换。去除样本数少于三个的癌症类型，最终获得包含 37 种癌症类型的数据集。

6. 免疫调节基因、免疫检查点和RNA修饰基因分析

1. 从 UCSC 数据库获取 TCGA 泛癌数据集，并提取每个样本中 PTDSS1 或 PTDSS2 的表达数据，以及代表五种免疫相关通路的 150 个标记基因（趋化因子：41 个基因；受体：18 个基因；MHC：21 个基因；免疫抑制因子：24 个基因；免疫刺激因子：46 个基因）。
2. 剔除正常组织样本及表达值为零的样本，并对所有表达数据进行 log2(x + 0.001) 转换。采用 Pearson 相关性分析评估 PTDSS1 或 PTDSS2 与免疫通路标记基因之间的关联性。
3. 从 UCSC 数据库获取 TCGA 泛癌数据集，并提取每个样本中 PTDSS1 或 PTDSS2 的表达数据，以及参与免疫检查点通路的 60 个基因（抑制性：24 个基因；刺激性：36 个基因）。
4. 剔除正常样本及表达值为零的样本，并使用 log2(x + 0.001) 对所有表达数据进行转换。进行 Pearson 相关性分析，以评估 PTDSS1 或 PTDSS2 与免疫检查点相关基因之间的关联。
5. 从 UCSC 数据库下载 TCGA 泛癌数据集，并提取每个样本中 PTDSS1 或 PTDSS2 的表达数据，以及与三种 RNA 修饰类型相关的 44 个基因（m1A：10 个基因；m5C：13 个基因；m6A：21 个基因）。
6. 剔除正常组织样本及表达值为零的样本，并对所有表达数据应用 log2(x + 0.001) 转换。进行 Pearson 相关性分析，以评估 PTDSS1 或 PTDSS2 与 RNA 修饰相关基因之间的关系。

7. 免疫浸润分析

1. 从 UCSC Xena 数据库下载 TCGA 泛癌数据集，并提取每个样本中 PTDSS1 和 PTDSS2 的表达数据。
2. 排除正常样本及表达值为零的样本。使用 log2(x + 0.001) 转换对表达数据进行标准化，并将基因标识符映射为 GeneSymbol 格式。
3. 利用 ESTIMATE R 软件包计算每位患者的基质评分（StromalScore）、免疫评分（ImmuneScore）和 ESTIMATE 评分，获得涵盖 39 种癌症类型的 9,554 个肿瘤样本的免疫浸润评分。
4. 使用 psych R 软件包中的 “corr.test” 函数进行 Pearson 相关性分析，以评估基因表达与免疫浸润评分之间的关联。
5. 利用 IOBR R 软件包中实现的 TIMER 算法，估算 B 细胞、CD4⁺ T 细胞、CD8⁺ T 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞在 36 种肿瘤类型共 9,405 个样本中的免疫细胞浸润评分。
6. 进行 Pearson 相关性分析，评估 PTDSS1/PTDSS2 表达水平与免疫细胞浸润程度之间的关系。

8. PTDSS1 和 PTDSS2 在泛癌中的药物敏感性

1. 从 CellMiner 下载 NCI-60 化合物活性数据和 RNA-seq 表达谱。
2. 选择经 FDA 批准或处于临床试验阶段的化合物用于后续分析。
3. 使用 R 软件进行泛癌中 PTDSS1 和 PTDSS2 的药物敏感性分析。

结果

PTDSS1 或 PTDSS2 mRNA 在多种人类正常组织中的表达

利用HPA数据库的数据，分析了PTDSS1和PTDSS2在多种人类组织中的mRNA表达谱。分析揭示了显著的组织特异性表达模式。PTDSS1在甲状旁腺、心肌、淋巴结、扁桃体和骨髓中高表达（图1A），而PTDSS2在甲状旁腺、睾丸、骨骼肌、肾脏和大脑皮层中表达水平较高（图1B）。这些结果表明，PTDSS1和PTDSS2在人类不同组织中具有不同的表达模式。

PTDSS1 或 PTDSS2 在多种人类癌症中表达上调

为了进一步研究 PTDSS1 和 PTDSS2 在癌症中的潜在作用，利用整合的 TCGA 和 GTEx 数据集分析了它们在 33 种癌症类型中的肿瘤特异性表达模式。PTDSS1 的表达在多种恶性肿瘤中显著升高，包括...

讨论

癌症是一种全身性疾病，其特征是多个系统的功能失调，通常经历三个阶段：清除期、平衡期和逃逸期²⁵。在清除期，免疫系统能够有效清除新形成的癌细胞；在平衡期，癌细胞与免疫细胞处于相对平衡状态，抑制肿瘤的扩展和转移；最终在逃逸期，癌细胞逃避免疫监视，迅速增殖并发生转移²。因此，恢复免疫监视功能或建立一种平衡的疾病进展状态，对于有效的抗肿瘤治疗至关重要²。随着医学科学的进步，现代癌症治疗采用综合策略，结合多种方法，旨在提高治疗效果、延长患者生存率并改善生活质量^26,27。免疫治疗因其高度特异性、持久的应答、广泛的适用性、克服耐药性的能力以及可与其他疗法联合使用等优势，已成为当前癌症治疗的重要组成部分^28,29,30<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
cBioPortal 平台	cBioPortal	http://www.cbioportal.org/	用于可视化和分析多维癌症基因组数据的平台
GDC 门户	基因组数据共享平台（GDC）	https://portal.gdc.cancer.gov/	用于下载 TCGA 基因组和突变数据集的门户
GEPIA 平台	GEPIA	http://gepia.cancer-pku.cn/	基于 TCGA 和 GTEx 数据集进行基因表达谱分析和生存分析的网络服务器
GEPIA2	GEPIA2	http://gepia2.cancer-pku.cn/#index	用于基因表达相关性及交互式分析的更新版网络服务器
GTEx 数据库	基因型-组织表达项目（GTEx）	http://commonfund.nih.gov/GTEx/	包含正常人体组织基因表达谱的数据库
人类蛋白质图谱（HPA）数据库	人类蛋白质图谱	https://www.proteinatlas.org	用于分析正常组织和癌症中蛋白质与 RNA 表达谱的数据库
KEGG REST API	京都基因与基因组百科全书（KEGG）	https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html	用于获取 KEGG 通路注释的应用编程接口
KM Plotter 工具	KMplot	https://kmplot.com/analysis/	用于评估多个癌症中基因预后意义的在线工具
maftools R 包	Bioconductor 软件包 maftools	version 2.8.05	用于肿瘤突变负荷和突变分析的 R 软件包
psych R 包	CRAN R 软件包 psych	version 2.1.6	用于相关性和心理统计分析的 R 软件包
R 软件包	统计计算 R 基金会（R Foundation for Statistical Computing）	version 4.1.3	用于药物敏感性分析的统计计算软件
R 软件包 clusterProfiler	Bioconductor 软件包 clusterProfiler	version 3.14.3	用于 KEGG 和功能富集分析的 R 软件包
R 软件包 survival	CRAN R 软件包 survival	version 3.2-7	用于 Cox 回归和 Kaplan–Meier 生存分析的 R 软件包
R 软件	统计计算 R 基金会（R Foundation for Statistical Computing）	version 3.6.4	用于生物信息学和生存分析的统计计算软件
STRING 数据库	STRING	https://cn.string-db.org/	用于蛋白质–蛋白质相互作用网络分析的数据库
TCGA 数据库	癌症基因组图谱（TCGA）	http://cancergenome.nih.gov	包含基因组、转录组和临床癌症数据的大规模癌症基因组数据库
TIMER2.0	TIMER2.0	http://timer.cistrome.org/	用于肿瘤中免疫细胞浸润估算和相关性分析的平台
肿瘤免疫估计资源 2.0（TIMER2）平台	TIMER2.0	http://timer.cistrome.org/	用于系统分析多种癌症类型中免疫浸润的网络平台
UCSC Xena 平台	UCSC Xena	https://xenabrowser.net/	用于可视化和分析 TCGA 及其他公共多组学数据集的平台