一种定义的基于水凝胶的方法，用于生成三维人体乳腺类器官，以重现乳腺形态发生

Summary

该方案描述了一种定义的基于水凝胶的方法，用于生成在受控三维培养系统中重现乳腺形态发生的关键特征的人乳类器官。

Abstract

开发具有生理意义的人体模型系统，以复现组织结构和细胞状态动态，仍是研究乳房发育及致癌早期事件的重要挑战。传统的二维培养和许多三维系统未能捕捉定义人类乳腺的结构组织和微环境线索。本文介绍了一种可重复的方法，用于从嵌入定义水凝胶基质中的初级上皮细胞生成三维人乳腺类器官，该基质由I型胶原蛋白、层压蛋白、纤维内联素和透明质酸组成。该系统支持单细胞在乳腺形态发生的关键阶段中进展，包括祖细胞扩展、上皮模式形成、末端导管小叶单元状结构的形成，以及间充质样腔室的出现，这些过程持续21天的培养期。我们提供了水凝胶制备、细胞播种和培养条件的逐步方案。该方法兼容高含量成像和类器官数量、尺寸分布和结构复杂度的定量分析。该平台支持对上皮可塑性和环境扰动的机制性研究，提供了一个可扩展且生物学相关的系统，用于研究与乳腺癌风险相关的早期组织水平变化。

Introduction

理解人类乳腺发育及早期导致恶性转化的事件，需要忠实复现组织结构、细胞层级和微环境信号的实验系统。虽然二维上皮培养提供了重要的机制见解，但它们缺乏建模上皮组织和形态发生所需的结构^背景。现有的三维培养系统，包括基于基底膜提取物的系统，推动了该领域的发展，但仍受限于成分的多样性、对细胞外基质成分的不完全控制以及对高阶组织结构支持不^{一致的限制}1。此外，许多基于基底膜提取物的类器官系统因无法持续支持组织^样组织1的出现而受限。特别是，许多系统依赖外源性间质成分，而非促进支持性微环境的内源性发展，从而限制了它们模拟对组织发育和疾病至关重要的上皮-间充质相互作用的能力。这些局限限制了对发育过程、上皮可塑性以及环境或分子扰动对组织组织影响的可重复性研究。

为解决这些局限性，我们开发了一个定义的基于水凝胶的三维人乳类器官模型，使原级上皮细胞能够在定义的细胞外基质2,3,4,5,8内生成有序结构。水凝胶由I型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维内青素和透明质酸组成，这些成分根据其在乳腺发育和上皮形态形成中的作用被选定。这些细胞外基质分子会作用于不同的细胞受体，包括整合素、盘状结构域受体、CD44和RHAMM，已知能调控上皮极性、分支形态发生、干细胞维护、机械转导以及乳腺组织组织 ^6,7。先前描述该水凝胶系统的研究表明，与单胶原或基于母三质^{的条件相比}，这些细胞外基质成分的加入显著改善了导管-小叶形态发生和上皮成熟 ^3,8。此外，该水凝胶配方的物理性质此前已通过原子力显微镜进行过研究，表明复合的胞外基质水凝胶相比仅含胶原蛋白的凝胶表现出更低的刚性和更强的膨胀（杨氏模数分别为256.7 ± 20.0 Pa对比559.2 ± 204.0 Pa），与更软且更水合的基^质环境相符8。

重要的是，该模型支持与上皮结构并存的间充质样区室的出现，提供内源性结构和信号支持，更贴近原生组织结构³。通过形态学和转录组分析，与传统母三体基类器官培养物直接比较，评估了该水凝胶系统的生理相关性。早期研究表明，水凝胶培养比基于母三色菌培养的培养物更有利于导管-小叶组织的形成和多谱系分化，同时保持激素^反应性8。最近，通过比较水凝胶来源类器官、母三质生长类器官和原级人类乳腺组织的综合单细胞RNA测序分析，表明水凝胶培养的类器官更忠实地复现了天然人类^乳腺组织中存在的上皮层级、细胞多样性以及上皮-间充质相互作用3.相比之下，母三体生长的类器官富集为繁殖性杂交基底态，缺乏类链状群体，这与上皮自组装而非定向有机生成相符。

本文所述的方案提供了一种可重复且可扩展的方法，用于从原级人类组织生成类器官，并可选步骤进行成纤维细胞耗尽和解离为单细胞。由于该平台兼容活体成像、高含量成像、定量形态测量分析、细胞追踪和遗传扰动研究，因此可以与评估类器官数量、大小、结构和生长动态的下游方法集成。因此，该平台提供了一个生物学相关的系统，用于研究人体乳房发育、上皮可塑性、上皮细胞-微环境相互作用以及组织层面对发育、分子或环境扰动的反应。

图1提供了工作流程的示意概述，包括组织处理、水凝胶制备、类器官培养、发育进展及下游分析，而使用该平台生成的代表性类器官形态见图2。

图1。基于水凝胶的类器官生成工作流程概述。 （A） 流程图，总结了该方案的工作流程，包括组织采集、组织处理、冷冻保存、回收及可选的细胞制备、水凝胶制备、类器官培养、类器官开发及下游分析应用。（B）可视化示意图，展示了基于水凝胶的类器官生成协议的主要阶段，包括组织处理与制备、回收及可选细胞制备，以及水凝胶制备和类器官播种。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2。定义水凝胶系统中产生的代表性类器官形态。 来自不同人类组织的类器官在定义的水凝胶基质中培养的代表性明场图像。在培养第21天，对由还源乳腺成形术产生的单上皮细胞产生的乳腺类器官进行了成像。患者来源的肿瘤碎片衍生的异种移植类器官在培养第16天进行成像。培养第3天拍摄了由上皮碎片产生的唾液腺类器官。在培养第17天拍摄了由上皮碎片产生的肾脏类器官。比例杆=50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

Protocol

本应在手术后作为医疗废弃物丢弃的原发组织，按照缅因医疗中心和塔夫茨医疗中心机构审查委员会批准的方案，按照所有相关法律获得。所有组织在移植前均进行了匿名处理，无法追踪到具体患者。因此，麻省理工学院和塔夫茨大学健康科学学院的人体实验对象使用委员会授予了该研究的豁免地位（IRB #13521）。所有参与本研究的患者均签署了知情同意书，同意参与研究并发表结果。

1. 组织处理与制备

注意：所有涉及人体组织的操作均遵循机构生物安全和伦理指南。在开始操作前，请参阅图1A和图1B中展示的工作流示意图，了解协议步骤和类器官准备工作流的可视化概览。

1. 使用乳腺上皮基底培养基，辅以52 μg/mL牛垂体提取物、10 ng/mL人类表皮生长因子、5 μg/mL胰岛素、500 ng/mL氢化可的松、1%（v/v）GlutaMAX和1%（v/v）抗生素-抗真菌药（100X）制备MEGM。
2. 将1.5 mg/mL胶原酶A（储存于−20°C）和100 U/mL透明质酸酶（储存于4°C）加入乳腺上皮生长培养基（MEGM）制备解离培养基。
3. 在切除术后24小时内接受预防性乳房切除术和缩小乳房成形术获得的人类乳腺组织，未固定于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并保持在4°C。 用精密天平称重组织，确定总组织重量。
4. 将组织放入无菌生物安全柜中。用无菌手术刀机械地将组织切碎为3–^5毫米， 每块3块。将约2–3克绞碎组织转移到15毫升锥形管中。每管加入10毫升解离培养基。
5. 将管子在37°C下以8转/分钟的轨道旋转器孵育12–18小时，以酶促消化组织。当没有大型组织碎片残留，且介质中均匀悬浮均匀断裂物质时，认为消化完成。
6. 让上皮碎片通过重力沉降5分钟。确认介质中没有可见碎片悬浮，且存在明显的颗粒。小心地倾倒并丢弃上清液，且不扰动沉淀。
   注意：上清液含有基质细胞和基质成分，可清洗使用或保存用于其他研究。
7. 将沉淀重新悬浮在含有5%胎牛血清（FBS）的10毫升洗涤介质中，浸泡在PBS中。在室温下，用250×克离心机离心5分钟。
8. 重复洗涤步骤三次，直到上清液清澈且无可见杂质。
9. 将最终沉淀物重新悬浮在含有10%二甲基亚硫酸酯（DMSO）的冷冻介质中，体积为每克初始组织重量1毫升。
   注意：DMSO接触或吸入时有害。如机构要求，请使用适当的个人防护装备，并在化学安全罩内工作。
10. 将1毫升悬浮液注入每个冷冻容器。将冷冻瓶置于−80°C的冷冻容器中，再长期储存在液氮中。
    注意：这一步代表一个暂停点。在转移到长期储存条件下，将样品存放在−80°C。

2. 恢复与可选细胞制备

1. 解冻与初步恢复
   1. 冷冻至少24小时后，从−80°C的冷冻保存中取出冷冻保存组织，或从液氮长期储存中取出。立即将低温舱浸入37°C水浴中，并迅速解冻1分钟以减少细胞死亡。
      注意：解冻时应轻轻搅动冷冻舱，以确保均匀加热。
   2. 完全解冻后，立即将冷藏物转移到装有10毫升MEGM的15毫升锥形管中。离心机在250×克下5分钟。
2. 可选的成纤维细胞清除
   注意：通过预镀膜去除成纤维细胞是一种可选的富集步骤，用于减少快速粘附的基质或成纤维细胞群体，当希望获得更多上皮细胞富集的起始群体时。这一步骤对于类器官形成并非必需，且可根据实验目标进行调整。
   1. 将沉淀重新悬浮在10毫升MEGM中。
   2. 将悬浮组织转移到10厘米的细胞培养皿中。在37°C加湿的孵育箱中，含5%二氧化碳，孵育90分钟，以便成纤维细胞附着。
      注意：培养过程中不要扰动培养皿，以确保成纤维细胞的高效附着。
   3. 使用10毫升血清学移液器收集含有非粘连细胞的上清液，同时轻微倾斜培养皿至约45°。用5毫升PBS轻轻冲洗平板，并将冲洗液与收集的上清液混合。
   4. 将联合悬浮液在250×克离心5分钟，以回收富含上皮细胞的物质。
      注意：附着于平板的细胞已富集乳腺成纤维细胞，可通过添加DMEM + 10% FBS和抗生素培养基单独增殖。
3. 可选解离为单细胞
   1. 将沉淀重新悬浮在500微升预热（37°C）解离酶溶液中，该溶液含0.25%胰蛋白酶。替代解离试剂可能需要优化。将悬浮液转移到1.5毫升的微离心管上。用P1000移液器对样品搓碎20次，促进解离。
      注意：酶解离试剂可能有害。请使用适当的个人防护装备，避免皮肤或眼神接触。
   2. 将试管在37°C下孵育3-5分钟。培养后立即使用P1000移液器机械解离样品，搓洗20次。
   3. 加入1毫升含血清的洗涤液以中和酶促反应。离心机在500×克下5分钟。
   4. 将沉淀重新悬浮于300微升分散液（5 U/mL）和30 μL DNase溶液（1 mg/mL）中。在37°C下孵育3–5分钟。
   5. 通过移液15–20次机械解离样品。向悬浮液中加入含血清的700微升洗涤介质。
   6. 将电池悬浮液过滤至40微米的电池滤网中，进入干净的管子中。可以使用标准的40微米细胞过滤器或Flowmi移液器尖端滤过器。在处理细胞数有限时，Flowmi滤网可能减少样品损失。
   7. 利用锥蓝排除法确定可活细胞数。将10微升的细胞悬浮液与锥蓝混合，比例为1：1，并将10微升的混合物装入细胞计数室或计数载玻片中。使用自动细胞计数器或血细胞计测定细胞存活能力。
   8. 在室温下以500×克离心5分钟。
   9. 将细胞沉淀以所需的浓度重新悬浮在MEGM中，以便进行水凝胶播种。
      注：对于单细胞播种实验，典型输入量约为每200微升水凝胶1,000–5,000个细胞，具体取决于实验目标和供体样本特性。较低的播种密度通常用于活体成像和形态发生研究，以便跟踪单个类器官发育，而较高密度则常用于终点分子分析，包括RNA和蛋白质采集。

3. 水凝胶制备与类器官播种

1. 库存准备与体积计算
   1. 使用前将层压蛋白溶液（1.18 mg/mL）、透明质酸溶液（1 mg/mL，含无菌水）、纤维脑ectin溶液（无菌水中2 mg/mL）和PBS 1×放入冰中。将层压蛋白和纤维内联素分装存放在−80°C，透明质酸溶液储存在4°C。 使用前，在0°C–4°C的冰上缓慢解冻冷冻的部件。
   2. 准备一个25×的细胞外基质补充液。制备1毫升时，将425微升层压蛋白、250微升透明质酸、250微升纤维内联结素和75微升PBS混合在冰上管中。轻轻搅拌，将管子倒转3-4次。将溶液保存至4°C，保存时间长达1个月。
   3. 在制备前确定最终水凝胶的体积和成分。准备至少20%的多余体积，以应对移液和转移过程中的材料损失。
      注意：水凝胶配方由胶原蛋白I、1×最终浓度的细胞外基质补充剂（来自25×库存）和12.5%（v/v）0.1N氢氧化钠组成，相对于胶原蛋白I体积，用于pH中和和聚合。
      注：最终水凝胶浓度为1.7 mg/mL胶原蛋白I、20 μg/mL层粘连素、20 μg/mL纤维内克和10 μg/mL透明质酸。
   4. 用以下公式计算所需的胶原蛋白I（V型_胶原蛋白）体积：
      
      这里，_C最终 = 1.7 mg/mL，V总_量 是期望的最终水凝胶体积，C_为胶原蛋白溶液的浓度。使用胶原蛋白库存浓度在2–12 mg/mL之间。
      注意：胶原蛋白高汤的浓度可能因批次而异。浓度越高，粘度越高，移液应缓慢。
   5. 用以下公式计算0.1 N氢氧化钠（V_NaOH）的体积：
      V_NaOH = 0.125 × V_胶原蛋白
      将1N氢氧化钠稀释在无菌水中，制备0.1N氢氧化钠工作溶液。
   6. 使用以下公式计算细胞外基质补充剂（V_ES）的体积：
      
   7. 计算剩余的生长介质体积，使用以下公式：
      V_{个生长培养基} = _V个总量 - （V_胶原蛋白+V型_NaOH + V_ES + V_{细胞/组织}）
      注意：请单独确定每个实验的细胞或组织碎片体积。在允许容量范围内使用10–100微升的典型范围。由于不同制剂的片段大小和成分差异显著，因此不进行精确的片段计数。通过目视评估片段丰度和分布来规范播种。
2. 水凝胶主混合液的制备
   1. 将胶原蛋白I、细胞外基质补充剂、氢氧化钠（0.1N）和生长培养基置于0°C–4°C的冰上。 保持所有组分处于低温，以防止过早聚合。
   2. 将计算出的胶原蛋白I体积加入冷却的微离心管中。
   3. 将预冷培养基的计算体积加入胶原蛋白溶液中。
   4. 将计算出的0.1 N氢氧化钠体积加入中和溶液。
      注意：之前的优化已确定这些条件能产生合适的凝胶pH值;因此，无需对水凝胶混合物进行常规pH测试。
      注意：请迅速完成后续步骤，以防止胶原蛋白过早聚合。
   5. 通过以大约每秒一次的频率剧烈摇晃管子，至少摇晃6次来混合溶液。
   6. 将计算出的细胞外基质补充剂体积加入混合物中。
   7. 使用P1000移液器或宽孔移液器尖端添加计算出的单细胞或组织碎片体积。立即按照步骤3.2.5的步骤摇晃混合，然后立即进入下一步。
3. 水凝胶沉积
   1. 将水凝胶混合物以每孔所需体积移入培养容器。4孔腔滑槽每孔200微升水凝胶，8孔腔滑槽每孔100微升，96孔板每孔20微升。
   2. 使用腔体载玻片时，将水凝胶薄薄地涂抹在表面。将移液器尖端置于腔体孔的上边缘中央，在喷涂凝胶时拖动吸头，形成均匀的垫片。对于96孔板，将移液器尖端置于孔中央，同时保持与表面接触，并将凝胶中央分配，以保持穹顶结构。避免将空气移液进入凝胶，因为这会产生气泡。
   3. 将培养容器在37°C加5%二氧化碳加湿培养箱中孵育60分钟，以实现完全聚合。
      注：本文所述的聚合条件针对本研究所用培养格式进行了优化。根据培养容器几何形状、水凝胶体积和培养条件，聚合时间可能需要微调。
4. 文化与维护
   1. 向每个孔加入预热的MEGM。根据所用培养格式调整体积。
   2. 用移液器尖端轻轻将水凝胶从培养表面分离，使凝胶漂浮。将移液器尖端沿凝胶边缘滑动，轻轻抬起聚合水凝胶下方，将其从表面释放。
   3. 每周更换两次MEGM，换上新鲜预热的培养基。将培养物置于含5%二氧化碳的加湿培养箱中约3至4周，并在水凝胶完全塌陷前终止培养。通过凝胶内大量细胞生长导致的致密、不透明、塞状结构的外观来识别塌陷水凝胶（参见 补充图1中的代表性例子）。

Results

该方案的成功执行会形成具有组织化上皮形态和组织特异性结构特征的三维类器官结构。类器官在播种后3至7天内开始形成，并在培养过程中持续发育。此前对该水凝胶类器官系统的表征显示，该类器官在多个独立的初级人类供体中均可重复^形成3。在该研究中，评估了从12名无病还原乳腺成形术供体中分离出的原级上皮细胞，12个供体样本中有11个在所述培养条件下成功生成类器官。在供体中，每100个种子细胞形成的类器官结构中位数为1.775（95% CI：0.45–4.10）。尽管在器官形成效率和生长动态上观察到供体间存在显著变异性，但供体间可重复生成复杂的导管-小叶形态和腺窝形态。

来自单一上皮细胞的乳腺类器官表现出渐进形态发生，培养第21天时形成分支结构（见图2）。这些结构的特征是细长的突出和多细胞组织。类器官在第18天的预测面积范围为10,000至90,000微米^平方，圆周值低于0.3，计算为4π ×（面积/周长²）^3,9。由组织碎片衍生的类器官通常在第18天形成超过90,000微米^²的结构，而肿瘤碎片衍生的类器官则形成更致密且不规则的结构，组织减少且放射状突出增加，这与生长行为改变相符。

来自唾液腺和肾脏上皮碎片的类器官在相同的水凝胶条件下也表现出不同的形态（见图2）。唾液腺类器官在早期时间点（第3天）形成致密结构，而肾脏类器官在第17天开始发展出细长且不对称的形态。这些观察旨在展示水凝胶类器官系统在乳腺组织之外的更广泛适应性，并展示其支持多种上皮组织源类器官形成的能力。

先前进行^的3,5,8免疫染色和分子分析显示存在上皮谱系标记，包括管状标记KRT8、KRT18、KRT19、E-cadherin、GATA3、JAG1、Notch1和MUC1，以及基底或肌上皮标记KRT5、KRT14、Slug、SOX9和TP63，表明类器官内上皮异质性得以保存。通过共聚焦显微镜和三维重建，观察到符合末端导管小叶单元状组织的结构特征，定义为包含细长导管区域，连接末端小叶或肺泡状芽，类似人类原生末端导管小叶单元的组织。这些结构还表现出层叠上皮组织，具有腔和基底细胞模式，与此前对该平台³的分析结果一致。

观察到与上皮结构相关及间的间充质样区室，特征为迁移行为及包括VIM、SNAI1、ZEB1、S100A、CD90和FAPα等标志物的表达。结合延时显微镜分析，这些观察支持了培养系统内支持性微环境的出现³.

重要的是，该协议旨在提供一个广泛可适应的方法论框架，而非建立单一固定的生物学基准。定量结果，包括类器官形成效率、大小、分支复杂度和细胞组成，可能因供体来源、更年期状态、起始材料（如组织片段与单细胞）及实验条件而异。

次优结果包括类器官形成效率下降（每500个种子细胞<1个类器官）、细胞碎片过多、胶原蛋白聚合失败或未能建立有序结构。这些结果通常与细胞存活率低、组织解离不完全、水凝胶组成不正确或pH中和不当有关。

类器官发育的定量分析可以通过实时成像和高含量成像方法进行，以测量类器官数量、尺寸分布、分支行为、结构复杂性和细胞动力学。此前使用该平台的研究进行了纵向活体成像、细胞追踪、形态计量分析和遗传扰动研究，以量化类器官生长动态和谱系行为随时间的变化 ^3,5。成像采用共聚焦显微镜，图像分析使用NIS-Elements软件。

补充图1。这是18天长期类器官培养过程中水凝胶塌陷的代表性例子。坍缩 的水凝胶表现为密集、不透明、塞状结构，源于细胞广泛的生长和基质收缩。这些形态特征被用作在水凝胶完全塌陷前终止培养物的标准。比例杆=500微米。请点击此处下载此文件。

Discussion

本文所述的方案使得在支持乳腺形态发生关键特征的定义水凝胶微环境中可重复生成三维人乳腺类^器官3。该方法的成功需要几个关键步骤。首先，组织处理和酶解离必须严格控制，以保持上皮的存活能力，同时尽量减少过度消化，因为过度消化可能降低细胞产出并影响后续形态发生¹⁰。特别是，短时间且顺序的酶治疗，结合温和的机械解离，对于维持功能性上皮群体至关重要。其次，水凝胶制备需要精确控制胶原蛋白浓度、pH值和^时间。胶原蛋白的中和启动聚合;因此，添加氢氧化钠后的所有步骤都必须迅速且冰敷完成，以确保凝胶形成的稳定。不完全或延迟聚合可能导致结构不良或塌陷的水凝胶，无法支持类器官的发育。最后，必须对每个供体样本进行经验优化，因为过多的组织或细胞负荷可能导致凝胶迅速收缩和结构完整性丧失¹²。

多种故障排除考虑因素可以提高复现性。类器官形成不良可能由细胞活性低、水凝胶组成不优或沉积^时胶体处理不当引起。确保胶原蛋白库存保持在4°C且未发生过早聚合，对于凝^胶质量的一致性至关重要。此外，聚合后水凝胶成功从培养表面脱离，是凝胶形成正常的指示;未能脱离通常反映聚合不完全或^{表面条件不}当。类器官大小和形态的差异在供体样本间是预期的，反映的是生物学的异质性，而非技术故障。使用此平台的先前研究显示，尽管器官形成效率和形态发生在供体间存在显著差异，但广泛独立的初级人类供体中仍可重复形成类器官³。

这种方法存在若干局限性。虽然该模型支持与上皮结构并存间充质室的出现，但并未完全复现体内的间质、免疫和血管微环境的复杂性。虽然水凝胶的成分已明确，但代表简化的细胞外基质，可能无法捕捉到天然组织中存在的所有生物力学或生化线索^15,16。此外，供体间的变异性会影响类器官的生长动态和形态，因此需要针对特定应用进行实证优化。尽管存在这些局限，该系统支持自组织和内源性上皮-间充质相互作用的能力，是相较许多现有^{培养模型的}重大进展 3。

与常用的基底膜提取物系统相比，该方法对细胞外基质组成有更好的控制，并减少了与未定义材料相关的变异性¹⁷。此前直接比较该水凝胶平台与基于母三色体的类器官系统的研究显示，组织组织和细胞组成存在显著差异 ^3,8。水凝胶培养的类器官在形态和转录组层面上更接近人类乳腺组织，保留了多谱系上皮群体，包括腔区、基部、祖细胞和间充质样区室，而母胶培养的类器官则以增殖性杂交基底类状态为主，缺乏基质群体。此外，与依赖外源性间质细胞的共培养系统不同，该模型使支持性间充质样区室的内在出现成为可能，使得在更生理相关且人工工程较少的环境中研究上皮-微环境相互作用。水凝胶中出现的间充质样群体此前通过补充活体成像、免疫染色和单细胞转录组分析得到验证。³.这些研究显示，表现出高度运动的类间质细胞，表达间充质及上皮-间充质过渡相关标记，包括Vimentin、THY1/CD90、FAP、S100A4、ZEB1和Snail，并通过配体-受体分析识别出相互上皮-间充质信号相互作用。这些特性使该系统特别适合研究依赖组织结构和细胞间通信的过程，包括形态发生、上皮可塑性和早期组织重塑 ^4,5。

该平台在基础和转化研究中有广泛应用。它可用于研究人类乳房发育，模拟疾病早期发生事件，并评估分子或环境扰动对组织组织的影响。使用此平台的先前研究表明，发育调控因子如DDR1和RUNX1的功能扰动会改变三^{维培养中的}谱系分化、上皮组织和导管-小叶形态发生^5,18。与定量成像和高含量分析的兼容性进一步促进了对表型结果的系统性探究，包括类器官大小、结构和复杂性的变化。因此，该方法为研究人体组织及其在疾病相关环境中的破坏提供了可扩展且生物学相关性的平台。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15毫升锥形管	VWR	89039-664	用于组织处理和离心的无菌管
40 & mu;M细胞过滤器	VWR	732-2757	单细胞悬浮液制备的过滤装置
40 & mu;低容量的M细胞滤选	贝尔-阿尔特	136800040	单细胞悬浮液制备的过滤装置
自动细胞计数器	生物辐射	1450102	用于计数细胞和确定存活能力的装置
牛垂体提取物	热力科学	13028014	上皮细胞培养基补充剂
细胞计数幻灯片	生物辐射	145-0011	用于细胞计数的双腔载玻片
离心机	无	无	台式离心机需要具备至少500 x g的速度能力，并可容纳15 mL和1.5 mL的管子。nbsp;
胶原蛋白I型	米利波尔西格玛	08-115	用于水凝胶形成的细胞外基质蛋白
胶原酶A	西格玛-奥尔德里奇	11088793001	用于组织解离的酶
冷冻瓶	科宁	976171	用于低温保存样品的无菌小瓶
培养容器（例如，腔体滑轨、多孔板）	科宁	354104 354108 3603	水凝胶沉积和类器官培养平台。
二甲基亚砾	米利波尔西格玛	317275	冷冻介质中使用的低温保护剂
消散二号	罗什	4942078001	用于二次组织解离的酶
DNase I	罗什	10104159001	细胞解离过程中使用的酶。
胎儿牛血清	吉布科	10437	用于洗涤和中和培养基的血清补充剂
纤维内克素	西格玛-奥尔德里奇	F2006	细胞外基质蛋白组分
GlutaMAX	热力科学	35050061	上皮细胞培养基补充剂
人体表皮生长因子	西格玛-奥尔德里奇	E9644	上皮细胞培养基补充剂
氢化可的松	西格玛-奥尔德里奇	H0888	上皮细胞培养基补充剂
透明质酸	米利波尔西格玛	385908	水凝胶配方中的胞外基质成分
透明质酸酶	西格玛-奥尔德里奇	H3506	用于组织解离的酶
孵化器	热力科学	3598	用于组织培养的设备
胰岛素	西格玛-奥尔德里奇	I9278	上皮细胞培养基补充剂
层叠蛋白	吉布科	23017-015	细胞外基质蛋白组分
乳腺上皮基底介质	热力科学	M171500	上皮细胞培养基
微型离心管（1.5毫升）	热力科学	3451	用于小体积反应的管子
轨道旋转器	热力科学	400110	用于酶解离过程中组织分散的旋转器
P1000移液器	吉尔森	P1000	用于混合和传输高达1000 & mu的设备;L
青霉素-链霉素	热力科学	15140122	上皮细胞培养基的抗生素补充剂
磷酸盐缓冲盐水	吉布科	20012-027	用于清洗和冲洗的缓冲液
精密平衡	梅特勒·托莱多	ML303E	用于组织称重的天平
血清学移液管	努克	170356N	用于采集非沾附上皮细胞的移液器
氢氧化钠（1 N）	费舍尔化学	SS261	用于胶原蛋白中和的试剂
无菌手术刀	巴德-帕克	372615	用于机械组织绞碎的工具
特鲁潘蓝溶液	吉布科	15250061	用于细胞存活能力评估的染料
胰蛋白酶（0.25%）	吉布科	25200056	用于细胞解离的酶促试剂
水浴（37 & deg;C)	VWR	10LA	用于样品受控解冻的装置