一种基于明确水凝胶的三维人乳腺类器官生成方法，可重现乳腺形态发生过程

摘要

本方案描述了一种基于明确成分水凝胶的方法，可在可控的三维培养系统中生成模拟乳腺形态发生关键特征的人类乳腺类器官。

摘要

开发能够重现组织结构和细胞状态动态变化的、具有生理相关性的人体模型系统，仍是研究乳腺发育及癌变早期事件的主要挑战。传统的二维培养体系以及许多三维培养系统均无法模拟定义人体乳腺组织的结构组织和微环境信号。本文介绍一种可重复的方法，用于从嵌入于特定水凝胶基质中的原代上皮细胞生成三维人乳腺类器官，该基质由I型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和透明质酸组成。该体系支持单个细胞在21天的培养周期内经历乳腺形态发生的关键阶段，包括前体细胞扩增、上皮模式形成、终末导管小叶单元样结构的形成，以及类间充质区室的出现。我们提供了一套水凝胶制备、细胞接种和 培养条件的逐步操作方案。该方法适用于高内涵成像以及对类器官数量、大小分布和结构复杂性的定量分析。该平台可用于上皮可塑性及环境扰动的机制研究，为探究与乳腺癌风险相关的早期组织水平变化提供了一个可扩展且具有生物学相关性的系统。

引言

要理解人类乳腺发育过程以及导致组织发生恶性转化的早期事件，需要能够真实再现组织结构、细胞层级和微环境信号的实验体系。尽管二维上皮细胞培养体系已提供了重要的机制性见解，但缺乏模拟上皮组织结构和形态发生所必需的结构背景¹。现有的三维培养体系（包括基于基底膜提取物的体系）虽然推动了该领域的发展，但仍受限于成分的不稳定性、对细胞外基质组分的调控不完全，以及对高阶组织结构的支持不一致¹。此外，许多基于基底膜提取物的类器官体系受限于无法持续支持类似组织的结构形成¹。特别是，许多体系依赖外源性间质成分，而非支持微环境的内源性发育，从而限制了其对在组织发育和疾病中起核心作用的上皮-间质相互作用的建模能力。这些局限性制约了对发育过程、上皮可塑性以及环境或分子扰动对组织结构影响的可重复性研究。

为解决这些局限性，我们开发了一种基于明确成分水凝胶的三维人乳腺类器官模型，该模型可使原代上皮细胞在明确的细胞外基质中形成有序结构^2,3,4,5,8。该水凝胶由I型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和透明质酸组成，这些成....

方案

本研究获取了本应作为医疗废弃物在手术后丢弃的原代组织，获取过程严格遵守所有相关法律法规，并经缅因医学中心和塔夫茨医学中心的机构审查委员会批准的方案进行。所有组织在转移前均已匿名化处理，无法追溯至特定患者。基于此原因，麻省理工学院人类受试者使用委员会及塔夫茨大学健康科学学院（IRB #13521）认定本研究符合豁免资格。本研究中所有参与患者均签署了知情同意书，同意参与研究并同意发表研究结果。

1. 组织处理与制备

注意：所有涉及人体组织的操作均须遵循机构的生物安全与伦理准则。在开始实验前，请参考图1A和1B所示的工作流程示意图，以直观了解实验步骤及类器官制备的整体流程。

1. 使用乳腺上皮基础培养基，添加52 µg/mL 牛垂体提取物、10 ng/mL 人表皮生长因子、5 µg/mL 胰岛素、500 ng/mL 氢化可的松、1% (v/v) GlutaMAX 和 1% (v/v) 抗生素-抗真菌剂（100X），配制 MEGM 培养基。
2. 在乳腺上皮生长培养基（MEGM）中加入 1.5 mg/mL 胶原酶 A（储存于 −20°C）和 100 U/mL 透明质酸酶（储存于 4°C），配制消化介质。
3. 在切除后24小时内接收来自预防性乳房切除术和乳房缩小成形术的人类乳腺组织样本，样本未经固定，保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并维持在 4°C。....

结果

成功执行本方案可形成具有有序上皮形态和组织特异性结构特征的三维类器官结构。类器官在接种后3–7天内开始形成，并在培养期间持续发育。此前对该水凝胶类器官系统的表征研究表明，在多个独立的人类原代供体中，类器官的形成具有可重复性³。在该研究中，研究人员评估了来自12名无疾病史的乳房缩小成形术供体的原代上皮细胞，其中12个供体样本中有11个在所述培养条件下成功生成了类器官。在不同供体之间，每100个接种细胞形成的类器官结构中位数为1.775个（95%置信区间：0.45–4.10）。尽管在类器官形成效率和生长动力学方面观察到显著的供体间差异，但在不同供体中均能可重复地生成复杂的导管-小叶和腺泡样形态。

由单个上皮细胞衍生的乳腺类器官表现出渐进的形态发生，在培养第21天时形成分支结构（图2）。这些结构具有细长的突起和多细胞组织特征。到培养第18天时，类器官的投影面积范围为10,000–90,000 µm²，圆形度值低于0.3，计算公式为4π × (面积/周长

讨论

本文所述方案可在特定水凝胶微环境中可重复地生成三维人乳腺类器官，该环境支持乳腺形态发生的关键特征³。该方法的成功依赖于多个关键步骤。首先，组织处理和酶解离过程必须严格控制，以在保持上皮细胞活性的同时尽量减少过度消化，后者可能降低细胞得率并损害后续的形态发生过程¹⁰。特别是，短暂且分步的酶处理结合轻柔的机械解离，对于维持功能性上皮细胞群体至关重要。其次，水凝胶的制备需要精确控制胶原蛋白浓度、pH值和操作时间¹¹。胶原蛋白的中和会启动其聚合反应，因此在加入氢氧化钠后所有操作必须迅速并在冰上进行，以确保凝胶形成的稳定性。聚合不完全或延迟可能导致结构不良或塌陷的水凝胶，无法支持类器官的发育。最后，接种密度需根据每个供体样本进行经验性优化，因为组织或细胞密度过高可导致凝胶快速收缩并丧失结构完整性¹²。

有几点故障排除建议可提高实验的可重复性。类器官形成效果不佳可能源于细胞活力低下、水凝胶成分次优或沉积过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 锥形管	VWR	89039-664	用于组织处理和离心的无菌管
40 μm 细胞筛	VWR	732-2757	用于制备单细胞悬液的过滤装置
适用于小体积样品的 40 μm 细胞筛	Bel-Art	136800040	用于制备单细胞悬液的过滤装置
自动细胞计数仪	Bio-Rad	1450102	用于细胞计数和活力测定的设备
牛垂体提取物	Thermo Scientific	13028014	上皮细胞培养基的添加剂
细胞计数载玻片	Bio-Rad	145-0011	双腔载玻片，用于细胞计数
离心机	N/A	N/A	台式离心机需具备至少 500 × g 的转速能力，并能容纳 15 mL 和 1.5 mL 离心管。
胶原蛋白 I	Millipore Sigma	08-115	用于水凝胶形成的细胞外基质蛋白
胶原酶 A	Sigma-Aldrich	11088793001	用于组织解离的酶
冻存管	Corning	976171	用于样本低温保存的无菌小瓶
培养容器（例如，腔室载玻片、多孔板）	Corning	354104 354108 3603	用于水凝胶沉积和类器官培养的平台。
二甲基亚砜	Millipore Sigma	317275	冷冻保存液中的冷冻保护剂
分散酶 II	Roche	4942078001	用于二次组织解离的酶
脱氧核糖核酸酶 I	Roche	10104159001	细胞解离过程中使用的酶。
胎牛血清	Gibco	10437	洗涤液和中和液中使用的血清添加剂
纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F2006	细胞外基质蛋白组分
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	上皮细胞培养基的添加剂
人表皮生长因子	Sigma-Aldrich	E9644	上皮细胞培养基的添加剂
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0888	上皮细胞培养基的添加剂
透明质酸	Millipore Sigma	385908	用于水凝胶配制的细胞外基质组分
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H3506	用于组织解离的酶
培养箱	Thermo Scientific	3598	用于组织培养孵育的设备
胰岛素	Sigma-Aldrich	I9278	上皮细胞培养基的添加剂
层粘连蛋白	Gibco	23017-015	细胞外基质蛋白组分
乳腺上皮基础培养基	Thermo Scientific	M171500	上皮细胞的生长培养基
微量离心管（1.5 mL）	Thermo Scientific	3451	用于小体积反应的管子
轨道摇床	Thermo Scientific	400110	用于酶解过程中组织分散的摇床
P1000 移液器	Gilson	P1000	用于混合和转移最大 1,000 μL 体积的设备
青霉素-链霉素	Thermo Scientific	15140122	上皮细胞培养基的抗生素添加剂
磷酸盐缓冲液	Gibco	20012-027	用于洗涤和冲洗的缓冲溶液
精密天平	Mettler Toledo	ML303E	用于组织称重的天平
血清移液管	Nunc	170356N	用于收获非贴壁上皮细胞的移液管
氢氧化钠（1 N）	Fisher Chemical	SS261	用于胶原蛋白中和的试剂
无菌手术刀	Bard-Parker	372615	用于机械性组织切碎的工具
台盼蓝溶液	Gibco	15250061	用于细胞活力评估的染料
胰蛋白酶（0.25%）	Gibco	25200056	用于细胞解离的酶解试剂
水浴锅（37 °C）	VWR	10LA	用于样本受控解冻的设备