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方法文章

定量检测免疫恒河猴血液和骨髓中抗原特异性及总抗体分泌细胞的ELISpot实验

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DOI：

10.3791/71836

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2026年8月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

本文内容

摘要

B细胞ELISpot是一种经过验证的方法，用于定量检测血液（反映免疫接种后短寿命的浆母细胞）和更持久的骨髓抗体分泌细胞（ASCs）中抗原特异性的IgG、IgM和IgA长寿命浆细胞的数量及其持久性，以及总的抗体分泌细胞（ASCs）。

摘要

对新型疫苗抗原和佐剂的评估传统上依赖于检测抗体滴度，而抗体滴度在免疫接种后需要一定时间才能形成。在初次和加强免疫后定量抗体分泌细胞（ASCs），可更早地获得具有机制性信息的疫苗诱导体液免疫指标，有助于优化疫苗配方和免疫策略。本文描述了一种用于计数恒河猴外周血单个核细胞（PBMCs）和骨髓（BM）细胞中抗体分泌细胞的实验方案；恒河猴是艾滋病病毒（HIV）疫苗研究的重要临床前模型。该酶联免疫斑点（ELISpot）检测法可通过测定绝对频率和相对频率，定量抗原特异性以及总的IgG、IgM和IgA抗体分泌细胞。在外周血中，该检测可捕获免疫后浆母细胞反应的峰值；而在骨髓中，则可检测不同同种型抗原特异性浆细胞的累积情况，从而评估长寿抗体分泌细胞的持久性。本方案为临床前疫苗研究中免疫原与佐剂组合的评价提供了可靠且可重复的方法，并为有前景的候选疫苗进入临床开发提供了有价值的数据支持。

引言

抗体分泌细胞（ASCs）是适应性免疫的关键组分，包括在免疫接种后迅速产生的短寿命浆母细胞和负责持续抗体产生的长寿命浆细胞。浆母细胞可在外周血和次级淋巴器官中短暂检出，其频率在免疫接种后的特定时间点达到峰值，该时间点因疫苗配方和宿主物种而异（在恒河猴中通常为第4至5天，在人类中约为第7天）。相比之下，成熟的浆细胞寿命较长，主要存在于次级淋巴组织和骨髓（BM）中。有效的疫苗应能诱导强烈的体液免疫和细胞介导的免疫反应。通过加强免疫后外周血单个核细胞（PBMCs）中浆母细胞的快速扩增所反映的记忆反应测定，可为疫苗诱导免疫反应的强度提供重要信息。本方案的总体目标是提供一种可靠的方法，用于定量分析恒河猴在针对Env的免疫接种后早期浆母细胞及长寿命浆细胞的应答情况。

在酶联免疫斑点（ELISpot）实验中，将抗体分泌细胞（ASCs）培养在包被有抗原（Ag）的聚偏二氟乙烯（PVDF）或混合纤维素酯（MCE）膜底96孔板中，使活细胞分泌的蛋白质可直接被捕获在膜表面。随后采用常规夹心免疫测定法，利用抗体检测这些被固定的蛋白质。在显色型ELISpot实验中，辣根过氧化物酶（HRP）催化底物3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）生成不溶性有色沉淀，从而形成可见斑点，实现对单个ASCs的可视化和计数。ELISpot具有多项重要优势，包括能够在体外（ex vivo）检测抗原特异性免疫应答，对单个免疫细胞进行高灵敏度的功能评估，以及在临床前和临床研究中对T细胞和B细胞免疫应答进行定量监测1,2,3。

本文描述了一种用于定量恒河猴外周血单个核细胞（PBMCs）和骨髓（BM） 细胞中总IgG、IgM和IgA以及抗原特异性抗体分泌细胞（ASCs）的B细胞ELISpot实验方案。该方案详细说明了所有关键步骤，包括包被、封闭、细胞接种、检测显色、斑点计数和数据分析，以表征总抗体及Env特异性浆母细胞和浆细胞反应的动力学特征。该方法为临床前疫苗研究中不同抗原与佐剂配方免疫原性的评估与比较提供了可重复的技术手段，并有助于优化疫苗策略，推动其向临床应用转化。

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方案

本方案中使用的恒河猴来自新伊比利亚研究中心的无特定病原体（SPF）种群，并饲养于德克萨斯大学MD安德森癌症中心的迈克尔·E·基林比较医学与研究中心。动物护理及所有实验程序均遵循《实验动物护理与使用指南》，并经德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构动物护理与使用委员会批准（方案编号 #2616RN00）。

本方案是对先前免疫接种临床前研究中所述技术的优化4,5,6,7，旨在检测抗体分泌细胞（ASC）反应。以下方案描述了使用来自参与HIV实验性疫苗研究的恒河猴的新鲜外周血单个核细胞 和骨髓 细胞制备物进行ELISpot实验的操作流程。

注意：第1至第4节的所有操作均须在经认证的II级生物安全柜中进行，并采用无菌技术。尽可能使用多通道移液器。

1. ELISpot 板的制备

  1. 包被ELISpot板
    1. 在4°C下，用100 µL/孔的5 µg/mL未标记的山羊抗猴IgG + IgM + IgA（溶于无菌DPBS）包被总免疫球蛋白（Ig）板1和板3，孵育至少8小时，最好过夜（图1A，C）。
    2. 在4°C下，用100 µL/孔的20 µg/mL Galanthus nivalis 凝集素（GNL）（溶于DPBS）包被抗原特异性板2和板4，孵育至少8小时，最好过夜（图1B，D）。
    3. 将包被好的板在4°C下保存，直至使用。
  2. 洗涤并封闭总免疫球蛋白板
    1. 将板1和板3迅速倒置于废液容器上方，弃去包被液。将倒置的板用力在吸水纸上轻拍，以去除残留液体。
    2. 每孔加入200 µL含0.05% Tween 20的PBS，洗涤两次；随后每孔加入200 µL DPBS洗涤两次，以去除残留的洗涤剂。
      注意：Tween 20具有细胞毒性。在接种细胞前必须彻底去除。
    3. 每孔加入200 µL RPMI-10培养基。在37°C、湿润培养箱中孵育2小时。
  3. 洗涤并封闭抗原特异性板
    1. 将板2和板4迅速倒置于废液容器上方，弃去GNL包被液。将倒置的板用力在吸水纸上轻拍，以去除残留液体。
    2. 每孔加入200 µL DPBS，洗涤四次。
      注意：GNL包被的板不得使用含Tween 20的PBS进行洗涤。
    3. 每孔加入200 µL RPMI-10培养基。在37°C、湿润培养箱中孵育2小时。
    4. 弃去封闭液，每孔加入200 µL DPBS，洗涤四次。
    5. 每孔加入100 µL CH505 SOSIP抗原，终浓度为5 µg/mL。在37°C孵育2小时。
    6. 弃去抗原溶液，每孔加入200 µL无菌DPBS洗涤四次。
      注意：最后一次洗涤后，将DPBS保留在孔中，以防止在接种细胞前MCE膜干燥。

2. 样本制备：外周血单个核细胞和骨髓单个核细胞的分离

  1. 从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）
    1. 将10 mL含EDTA的血液样本在室温下以450 × g 离心20分钟，离心过程中不启用刹车。
    2. 移除血浆，并加入4 mL不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液（DPBS）。使用10 mL移液管轻轻混匀。
    3. 将稀释后的血液小心地叠加至含有4 mL Ficoll的15 mL离心管中。在室温下以800 × g 离心30分钟，使用慢加速和慢减速模式。
    4. 将含有外周血单个核细胞的白膜层转移至新的15 mL离心管中。加入8–10 mL DPBS，于室温下以450 × g 离心10分钟。
    5. 弃去上清液，轻柔重悬细胞沉淀。
    6. 向细胞悬液中加入2 mL氯化铵钾（ACK）裂解缓冲液。在室温下孵育5分钟。
      注意：孵育时间不得超过5分钟，因长时间接触ACK裂解缓冲液会降低细胞活力。
    7. 通过加入含2%胎牛血清（FBS）的10 mL DPBS终止红细胞裂解。在室温下以300 × g 离心10分钟。
    8. 弃去上清液，将细胞重悬于RPMI-10培养基中。
    9. 采用适当的细胞计数方法对PBMC进行计数，并确保细胞活力 >90%，例如通过台盼蓝染色法检测。
    10. 将一份样品调整至5 × 106 个细胞/mL，用于抗原特异性ELISpot实验；将另一份样品调整至1 × 106 个细胞/mL，用于总免疫球蛋白ELISpot实验。
  2. 分离骨髓单个核细胞
    1. 将70 µm细胞筛置于50 mL离心管中，并用1 mL DPBS预润湿筛网。
    2. 向1 mL骨髓穿刺液中加入4 mL DPBS，使用移液管充分混匀。
    3. 将骨髓悬液通过70 µm细胞筛过滤，弃去筛网前用2 mL DPBS冲洗。
    4. 将过滤后的悬液叠加至含4 mL Ficoll的15 mL离心管中。在室温下以800 × g 离心30分钟，使用慢加速和慢减速模式。
    5. 将单个核细胞层转移至新的15 mL离心管中。加入8–10 mL DPBS，于室温下以450 × g 离心10分钟。
    6. 弃去上清液，轻柔重悬细胞沉淀。
    7. 向细胞悬液中加入2 mL ACK裂解缓冲液。在室温下孵育5分钟。
      注意：裂解时间不得超过推荐时长，以保持细胞活力。
    8. 通过加入含2% FBS的10 mL DPBS终止红细胞裂解。在室温下以300 × g 离心10分钟。
    9. 弃去上清液，将细胞重悬于RPMI-10培养基中。
    10. 采用适当的细胞计数方法对骨髓单个核细胞进行计数，并确保细胞活力 >90%，例如通过台盼蓝染色法检测。
    11. 将一份样品调整至5 × 106 个细胞/mL，用于抗原特异性ELISpot实验；将另一份样品调整至1 × 106 个细胞/mL，用于总免疫球蛋白ELISpot实验。

3. 细胞的接种与培养

  1. 包被总免疫球蛋白板
    1. 通过将1号和3号板快速倒置在废液容器上方，移除板中的封闭液。将倒置的板在吸水纸上用力轻敲，以去除残留的封闭液。
    2. 向第一行的每个孔中加入100 µL RPMI-10，向第二行和第三行的每个孔中加入133 µL RPMI-10。以上操作均设技术重复。
    3. 向1号板每列的第一个孔中加入100 µL PBMC悬液（1 × 106 个细胞/mL）。根据板布局安排样品（例如，A1–A6孔用于恒河猴1（RM1），A7–A12孔用于恒河猴2（RM2））。
    4. 向3号板每列的第一个孔中加入100 µL 骨髓细胞悬液（1 × 106 个细胞/mL）。根据板布局安排样品。
    5. 通过从一个孔转移67 µL至下一个孔进行三倍系列稀释，每次转移后充分混匀。继续将系列稀释进行到指定的孔中，最后弃去末尾67 µL，以保持每孔终体积为133 µL。
    6. 将板置于含5% CO2的湿润培养箱中，37 °C过夜孵育。
      ​注意：孵育期间避免移动或扰动板，以防产生双斑点。
  2. 包被抗原特异性板
    1. 通过将2号和4号板快速倒置在废液容器上方，移除板中的DPBS。将倒置的板在吸水纸上用力轻敲，以去除残留缓冲液。
    2. 向第一行的每个孔中加入100 µL RPMI-10，向第二行和第三行的每个孔中加入133 µL RPMI-10。
    3. 向2号板每列的第一个孔中加入100 µL PBMC悬液（5 × 106 个细胞/mL）。根据板布局加入样品。
    4. 向4号板每列的第一个孔中加入100 µL 骨髓细胞悬液（5 × 106 个细胞/mL）。根据板布局加入样品。
    5. 通过从一个孔转移67 µL至下一个孔进行三倍系列稀释，每次转移后充分混匀。继续将系列稀释进行到指定的孔中，最后弃去末尾67 µL，以保持每孔终体积为133 µL。
    6. 将板置于含5% CO2的湿润培养箱中，37 °C过夜孵育。
      注意：孵育期间避免扰动培养箱，因为振动可能导致双斑点或彗星尾样伪影。

4. 处理ELISpot板

  1. 处理总免疫球蛋白板
    1. 孵育约 18 小时后，从培养箱中取出板。
    2. 将每块板快速倒置在装有 10% 次氯酸钠的废液容器上方，弃去细胞和培养基。将倒置的板用力在吸水纸上轻拍，以去除残留液体。
      注意：后续处理步骤可在非无菌条件下进行。
    3. 用含 0.05% Tween 20 的 DPBS 洗涤每块板 4 次，每次每孔 200 µL。
      注意：最后一次洗涤后保留洗涤液于孔中，防止膜干燥。
    4. 若处理大量板，可选择使用自动微孔板洗涤仪进行洗涤。
    5. 在含 0.05% Tween 20 和 1% FBS 的 DPBS 中，将生物素标记的抗猴 IgG 和 IgM 抗体稀释至 1:1,000，将生物素标记的抗猴 IgA 抗体稀释至 1:500，配制检测抗体溶液。
    6. 通过在吸水纸上轻拍去除最后一次洗涤液。每孔加入 100 µL 稀释后的抗 IgG 抗体至第 1、2、7 和 8 列，抗 IgM 抗体至第 3、4、9 和 10 列，抗 IgA 抗体至第 5、6、11 和 12 列。
      注意：每次仅处理一块板，以防止膜干燥。
    7. 室温孵育 2 小时。
    8. 弃去检测抗体溶液，用含 0.05% Tween 20 的 DPBS 洗涤板 4 次。
    9. 在含 0.05% Tween 20 和 1% FBS 的 DPBS 中，将 HRP-avidin 稀释至 1:1,000，配制酶结合物溶液。
    10. 每孔加入 100 µL 稀释后的 HRP-avidin。室温孵育 2 小时，避光。
    11. 弃去 HRP-avidin 溶液，用含 0.05% Tween-20 的 DPBS 洗涤板 4 次。
      ​注意：最后一次洗涤后保留洗涤液于孔中，直至底物显色完成。
  2. 处理抗原特异性板
    注意：操作流程与总免疫球蛋白板类似。但所有洗涤步骤均使用不含 Tween 20 的 DPBS，以保护 GNL 涂层。
    1. 孵育约 18 小时后，从培养箱中取出板。
    2. 将每块板快速倒置在装有 10% 次氯酸钠的废液容器上方，弃去细胞和培养基。将倒置的板用力在吸水纸上轻拍，以去除残留液体。
      注意：后续处理步骤可在非无菌条件下进行。
    3. 用 DPBS 洗涤每块板 4 次，每次每孔 200 µL。
      注意：最后一次洗涤后保留洗涤液于孔中，防止膜干燥。
    4. 在含 1% FBS 的 DPBS 中，将生物素标记的抗猴 IgG 和 IgM 抗体稀释至 1:1,000，将生物素标记的抗猴 IgA 抗体稀释至 1:500，配制检测抗体溶液。
    5. 通过在吸水纸上轻拍去除最后一次洗涤液。每孔加入 100 µL 稀释后的抗 IgG 抗体至第 1、2、7 和 8 列，抗 IgM 抗体至第 3、4、9 和 10 列，抗 IgA 抗体至第 5、6、11 和 12 列。
      注意：每次仅处理一块板，以防止膜干燥。
    6. 室温孵育 2 小时。
    7. 弃去检测抗体溶液，用 DPBS 洗涤板 4 次，每次每孔 200 µL。
    8. 在含 1% FBS 的 DPBS 中，将 HRP-avidin 稀释至 1:1,000，配制酶结合物溶液。
    9. 每孔加入 100 µL 稀释后的 HRP-avidin。室温孵育 2 小时，避光。
    10. 弃去 HRP-avidin 溶液，用 DPBS 洗涤板 4 次，每次每孔 200 µL。
      注意：最后一次洗涤后保留洗涤液于孔中，直至底物显色完成。
  3. 执行自动洗涤（可选）
    1. 根据制造商说明，用 DPBS 对自动微孔板洗涤仪进行预冲洗。
    2. 选择预设的 ELISpot 洗涤程序，并使用 DPBS 完成所有洗涤步骤。
      注意：所有自动洗涤均使用 DPBS，以避免因更换不同洗涤缓冲液而重复对仪器进行预冲洗。
    3. 使用 表 1中列出的微孔板洗涤仪设置。

5. 检测

  1. 准备底物溶液
    1. 在使用前立即配制AEC工作底物，每1 mL底物溶液中加入一滴显色剂溶液，充分涡旋混匀。
      注：为四块96孔板准备约40 mL工作底物。
  2. 在室温下孵育ELISpot板
    1. 每次处理一块板。弃去最后一次洗涤缓冲液，立即每孔加入100 µL AEC工作底物。
    2. 肉眼观察斑点形成情况，直至出现清晰的红色斑点，通常在2–4分钟内完成。
      注意：切勿过度孵育，过度反应会增加背景染色并影响斑点分辨能力。
    3. 用流动的自来水彻底冲洗板子以终止酶促反应。
    4. 用自来水洗涤板子4至5次，用吸水纸吸去多余水分。
    5. 取下板子的底座，让板子在计数斑点前于空气中干燥约24小时。
      注：一旦最高细胞浓度孔中的斑点可见，应立即终止反应，以避免过度显色。
    6. 对剩余的每块板重复步骤5.2.1–5.2.5。

6. 斑点定量分析

  1. 获取ELISpot图像
    1. 使用配备图像采集软件的ELISpot读板仪扫描每块板。
    2. 选择合适的板模板，定义需分析的孔，并根据软件说明采集图像。
    3. 保存原始数据，并以TIFF格式导出板图像以供存档。
  2. 计数抗体分泌细胞
    1. 查看每个孔的自动斑点计数结果。
    2. 手动核对每个孔，识别被错误合并或分割的斑点。必要时手动标记单个斑点，以获得准确计数。
      注意：建议进行手动核对，因为自动分析软件可能会将大斑点重复计数多次。
    3. 将斑点计数结果及其对应的稀释倍数记录在电子表格中，如表2所述。
    4. 分别分析IgG、IgM和IgA的复孔，然后计算每个稀释度的平均斑点数。
    5. 通过将平均斑点数乘以相应的稀释倍数，计算每百万输入细胞中的抗体分泌细胞数。
      注意：总免疫球蛋白检测使用15×、45×和135×的稀释倍数，抗原特异性检测使用3×、9×和27×的稀释倍数。
    6. 所有计算均在电子表格软件中完成，并使用统计绘图软件生成图表。

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结果

在本B细胞ELISpot实验中，使用CH505 SOSIP（一种可溶性HIV-1包膜糖蛋白（Env）三聚体）作为包被抗原，检测抗体分泌细胞（ASCs），该实验属于一项旨在诱导针对HIV-1的广谱中和抗体（bnAbs）的疫苗研究。图1展示了用于分别定量总抗体分泌细胞和抗原特异性抗体分泌细胞的ELISpot板布局。该布局标明了各个动物个体以及用于IgG、IgM和IgA分析的孔位位置。板上标签还包括研究编号、采样时间点和实验日期。此外，该布局还注明了实验所用的包被抗原浓度、细胞悬液体积以及系列稀释方案。

图2 展示了骨髓中具有代表性的抗原特异性抗体分泌细胞（ASC）反应，可见大小和强度各异的斑点，对应着分泌不同数量抗体的单个 ASC。产生 IgG 的 ASC 形成的斑点数量最多，其次是 IgM，而 IgA 反应相对较低。自动斑点计数基于预设的斑点直径，当存在较大斑点时倾向于高估斑点数量。因此，如单个动物的放大代表性孔所示，需进行手动斑点计数以准确统计 ASC 数量。

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讨论

B细胞ELISpot是一种用于检测血液、血浆和骨髓细胞中总免疫球蛋白及抗原特异性抗体分泌细胞（ASC）反应的敏感方法8,9,10,11。为确保该实验方案的可重复性，多个步骤至关重要。首先，膜必须用最佳浓度的捕获抗体进行精确包被。封闭膜是防止非特异性结合的关键步骤，最好按照本方案所述在4 °C条件下过夜进行。若时间有限，也可在37 °C条件下封闭至少2小时。

另一个关键因素是使用新鲜分离的细胞以维持较高的细胞活力。与T细胞不同，B细胞谱系（尤其是浆母细胞和浆细胞）在冻存后极易发生功能丧失（数据未显示）。因此，建议使用活力超过90%、理想情况下达到95–99%的新鲜分离细胞，以确保结果可靠。此外，外周血单个核细胞（PBMCs）和骨髓（BM）细胞应尽可能不含或仅含极少红细胞污染。精确控制孵育温度和CO2浓度对于细...

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披露

作者声明无经济利益冲突。

致谢

作者谨向凯林比较医学与研究中心的动物和科研护理人员表示感谢，感谢他们提供的悉心照料，同时感谢众多前任团队成员和合作者对本实验方案持续改进所做出的贡献。本非人灵长类动物HIV疫苗项目由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号分别为授予MBZ的5R01AI183472和授予FJV的R24OD010947。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACK 裂解液Quality Biological118-156-101500 ml
70µm 滤器Fisher22363548无菌细胞滤器，适用于 50 mL 离心管
AEC 显色工作液BD Biosciences551951可配制用于 10 块板的试剂
数据分析：ExcelMicrosoft OfficeVersion 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel for Microsoft 365
数据分析：GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
抗恒河猴 IgA 生物素标记抗体NHPRRAB-3086851冻干粉
抗猴 IgG 生物素标记抗体RocklandP/N 617-106-012冻干粉
抗猴 IgM 生物素标记抗体RocklandP/N 617-106-007冻干粉
封闭液实验室自配试剂实验室自行配制RPMI-10
稀释二抗和 HRP 的缓冲液实验室自配试剂实验室自行配制含 1% FBS 的 1X DPBS
离心机 Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR，生产年份：2013，TX-750 转子及 75003608（圆形吊篮）
包被缓冲液实验室自配试剂实验室自行配制1X DPBS
DPBSGibco14190-1361X
ELISpot 板Millipore SigmaMSHAN4B50每包 50 块板
胎牛血清（FBS）Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL 未标记抗体Vector LaboratoriesL-1240-5冻干粉
辣根过氧化物酶（HRP）-亲和素Vector LaboratoriesA-20045 mg/ml，即用型
Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpot 分析仪Mabtech ABP/N: 2000用于 ELISpot 和 Fluorospot 检测的自动成像与分析系统
青霉素/链霉素Gibco15140-122100X
洗板机BioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRS405 TS 微孔板洗板机
RPMI-10实验室自配试剂实验室自行配制RPMI-1640 + 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life SciencesP7949500 ml
未标记多克隆山羊抗猴 IgG+IgA+IgM 抗体（IgG/IgM/IgA）LS-BioC347340冻干粉
洗涤缓冲液（抗原特异性板）实验室自配试剂实验室自行配制（仅含 1X DPBS）
洗涤缓冲液（总 Ig 板）实验室自配试剂实验室自行配制（含 1X DPBS + 0.05% Tween 20）

参考文献

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  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
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