本方案为内部冷冻电子显微镜（cryo-EM）设施的IT基础设施设计与运行提供了实用框架。内容涵盖设施规划、网络架构、存储系统、GPU计算、远程访问及实时数据处理，可在确保cryo-EM操作具备可扩展性、可持续性和高性能的同时，实现对多太字节数据集的高效管理。
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摘要
摘要
冷冻电镜（cryo-EM）已成为生物大分子高分辨率结构解析的主要方法。随着全球范围内机构级冷冻电镜设施数量的不断增长，一个持续存在的挑战日益凸显：支撑这些设施所需的数据基础设施常常规划不足。配备直接电子探测器（DED）的现代冷冻电镜设备每天可产生 2 至 5 TB 的原始数据，一个拥有 20 名用户的设施在一个运行年度内可能累积约 2 PB 的数据。处理这些数据需要专用的 GPU 计算节点、高速内部网络以及可靠的长期归档策略——所有这些都必须在数据采集开始前部署到位。本实验方案提供了一个针对自建冷冻电镜设施的信息化与计算系统设计集成框架。我们涵盖了物理设施要求（房间设计、电力、冷却和振动隔离）、设备选型（显微镜、DED 及配套仪器），以及完整的计算架构：网络交换机配置、存储服务器选型与容量规划、GPU 计算节点部署和远程访问架构。随后，我们提供了一套详细的实时数据处理流程实施方案——在数据采集过程中同步进行运动校正、对比度传递函数（CTF）估计、颗粒挑选和二维分类——使用的是行业标准工具。本文还讨论了对外部用户的数据传输策略。本指南填补了现有文献中的关键空白，将帮助研究人员和管理人员从第一天起就建立起具备充分计算能力的冷冻电镜设施。
引言
冷冻电镜的分辨率革命已彻底改变了结构生物学，使得无需结晶即可在原子分辨率水平上观察蛋白质、核酸及大分子复合物的结构1,2。推动这一变革的三大技术进步包括：具有高帧率的直接电子探测器（DED）的开发、电子光学系统和显微镜机械性能的改进，以及基于GPU加速的图像处理软件的优化3,4,5,6。这些进展共同使冷冻电镜成为日益扩大的结构生物学研究群体的首选方法。
对冷冻电镜（cryo-EM）使用需求的不断增长，已促使各国在大型国家级中心和中小型机构级设施方面投入大量资源。国家级中心——例如美国的NCCAT、S2C2、PNCC和MCCET，以及欧洲的eBIC、NeCEN和SciLifeLab3,5,6，可为获批项目提供最高端仪器的使用机会。机构自建设施则通过支持迭代式、项目特定的研究，实现更快的实验周期和更紧密的用户与技术人员协作，从而补充这些公共资源。然而，建立一个正常运行的机构级设施远不止购置一台显微镜那么简单：配套的IT基础设施同样至关重要，其不足是新建设施运行失败的主要原因之一6。
一次高端冷冻电镜实验在24小时内可产生2–5 TB的原始电影数据。随着多台显微镜和多位用户的使用，数据量迅速达到拍字节（petabyte）级别。处理这些数据需要GPU加速的分析流程，并且必须与数据采集同步运行7,8。预处理的延迟意味着数据质量反馈滞后，并造成仪器使用时间的浪费。尽管情况如此，大多数已发表的冷冻电镜设施管理指南对IT基础设施的关注极少，且没有任何文献提供用于建立和验证完整数据基础设施的逐步操作规程。
本方案旨在解决这一空白。我们详细阐述了设施建造所需的物理与技术条件、显微镜和探测器的选型标准，以及最为关键的——使冷冻电镜设施具备可操作性的信息技术主干系统的设计与实施6。特别强调了数据的实时处理：在数据采集过程中同步进行的自动化预处理，可实现采集过程中的实时质量控制，指导采集策略的制定，并显著缩短采集完成后的数据处理周期9,10,11。通过遵循本方案，设施建设者将能够构建一个完整、集成化的冷冻电镜运行体系，可持续且高效地服务于广泛的科研群体。
方案
本方案中使用的所有仪器、软件和材料的详细信息见材料表。
1. 物理设施设计、人员与基础设施规划
- 进行场地评估。选择一个能够提供以下条件的建筑地点：具有隔振地板（环境振动水平理想情况下 < 1 µm/s 1–100 Hz 下的均方根）；磁场稳定性（< 1 mG/m 空间梯度和 < 0.1 mG/m 的时间变化（针对 300 kV 仪器）；稳定的室温（18–22 °C 与 < 0.5 °C 波动）；湿度控制（40–60% RH）；低噪音环境（<50 dB）。在规划阶段早期，请咨询显微镜制造商的场地要求。
注意： 翻新现有房间的费用可能与新建相当。通常情况下，应预算显微镜购置价格的约20%用于房间准备。 - 设计设施布局时，应明确划分不同功能区域的空间：（a）用于低温透射电子显微镜（cryo-TEMs）的显微镜室；（b）用于载网操作与储存的样品制备前室；（c）放置水冷机、不间断电源（UPS）单元及显微镜冷却系统的控制室；以及（d）独立的服务器机房或数据中心，用于存储与计算基础设施。
注意：保持控制室温度在以下水平 26 °C 始终提供专用的备用电源和冷却。控制器室内的温度波动是显微镜停机的常见原因。 - 规划电力基础设施。为高端冷冻透射电子显微镜安装专用的三相电源电路。将所有显微镜、相机及服务器设备连接至指定的受保护电力基础设施。与机构的设施团队协调，配备应急发电机，确保在停电期间能够维持显微镜运行和冷却水循环。
注意：冷冻电镜设施中的多种仪器在安全断电重启时需要超过一天的时间。意外断电可能损坏敏感的电路板，并导致正在进行的数据采集会话丢失。 - 为电子显微镜及相关硬件安装冷却水系统。建立带有自动故障切换功能的备用冷却水回路。使用显微镜集成的监测系统或专用传感器阵列，持续监测水流速率、温度和电导率。
- 在施工或翻新期间，铺设从显微镜室至服务器机房的光纤电缆线路。光纤规格至少为 OM4 多模或 OS2 单模，两端须预留足够余长，并配备标有标签的配线架。
注意：预先安装光纤的成本远低于后期加装。 - 指派专职显微镜操作员或设施科学家负责仪器维护、用户培训、使用调度、样品优化及数据采集支持。指派专职信息技术人员负责基础设施管理、网络性能监控、网络安全、数据备份、软件部署、GPU计算资源管理以及远程用户访问支持。
- 根据所提供的用户支持级别和计算基础设施的复杂性来确定人员配置需求。在规模较小的设施中，例如加州大学圣克鲁兹分校生物分子冷冻电镜设施（UCSC Biomolecular cryo-EM Facility），这些职责可由具备计算专业知识的设施经理或集中化的机构信息技术服务部门共同承担；然而，随着显微镜数量、用户数量以及年度数据采集会话次数的增加，配备专职专业人员将变得愈发必要。
- 为运行多台冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）的设施提供专门的IT支持，以确保数据采集不间断、数据管理高效以及计算资源可扩展。在设施建设初期即投入建设强大的IT基础设施和专业人员，以最大限度减少运行停机时间，简化未来的扩展，并建立可持续的框架，支持不断扩大的用户群体和日益数据密集的冷冻电镜（cryo-EM）工作流程。
2. 显微镜与检测器的选择
- 在选择显微镜之前，首先明确设施的主要科学使命。需考虑以下因素：(a) 主要工作流程是单颗粒分析（SPA）、冷冻电子断层扫描（cryo-ET）、微晶电子衍射（microED），还是多种技术结合；(b) 预期的用户规模和项目多样性；(c) 设备采购及持续服务合同的预算限制。
- 根据预期应用评估可用的冷冻透射电镜（cryo-TEM）平台。对于高分辨率单颗粒分析和亚断层平均（STA），建议考虑300 kV仪器；对于筛选和中等分辨率数据采集，建议考虑200 kV仪器；对于成本较低且具备筛选能力的入门级配置，可评估100–120 kV仪器（详见表1）。
注意：产品规格表更新频繁。在最终确定设备选型前，务必直接向制造商索取最新的配置详情和报价。 - 选择与显微镜及应用相匹配的直接电子探测器（DED）。在Thermo Fisher Scientific（TFS）仪器上进行高分辨率单颗粒分析时，目前Krios和Glacios系列的主要选项为Falcon 4i探测器。
- 对于JEOL CryoARM系列仪器，Gatan K3探测器具有优异的灵敏度和帧率。对于同时开展单颗粒分析和微晶电子衍射（microED）的设施，需确认探测器是否兼容电子衍射数据采集模式（见表2）。
注意： 直接电子探测器（DED）是设施中最昂贵的组件之一，显著影响数据质量和存储需求。例如，电子事件记录（EER）模式生成的原始文件远大于传统压缩格式，相应地需要更大的存储空间和网络带宽。 - 在选择冷冻电镜系统配置时，需评估能量滤器的作用，因其会显著影响图像质量、探测器选择及整体系统性能。通过去除非弹性散射电子，能量滤器可提高对比度和信噪比，这对具有挑战性的样品、高分辨率单颗粒分析（有益）、冷冻电子断层扫描（关键）以及微晶电子衍射（有益）等应用尤为重要。
- 在仪器选型过程中，评估可用的能量滤器系统。Gatan Bioquantum和Biocontinuum系统，或Thermo Fisher Scientific的Selectris及SelectrisX系统，通常价格约为30–150万美元，具体取决于配置。
- 在最终确定仪器配置前，应综合评估能量滤器与探测器性能、设施目标及预期用户应用之间的附加成本与复杂性。
- 在计算总采购成本时，需将服务合同费用纳入考量。服务合同通常涵盖显微镜、能量滤器、探测器和水冷系统。
- 在购买仪器时即应协商服务合同条款，包括响应时间保证和备用部件的可用性。建议每年为服务保障预留仪器购买价格的8–15%作为预算。
3. 网络架构设计与实现
- 围绕核心高速交换机设计内部设施网络。将所有产生和消耗数据的设备以最高支持速率直接连接到该交换机：显微镜控制器、相机控制器（通常为独立工作站）、存储服务器以及GPU计算节点。
- 为每个设备提供至少10 Gbps的连接。在预算允许的情况下，在交换机与存储和计算节点之间配置25 Gbps或更高速率的上行链路。
注意： 在1 Gbps速率下，传输20 TB原始数据需要2–3天；在10 Gbps下，相同传输耗时5–6小时；在25 Gbps下，耗时约2小时。网络速度直接决定了实时处理能否跟上数据采集的速度。 - 确定核心交换机规格。要求包括：(a) 全线速下的无阻塞交换架构；(b) 足够数量的SFP+或QSFP端口以连接所有设施设备；(c) 可管理交换功能（支持VLAN、流量监控、用于诊断的端口镜像）；(d) 冗余电源模块。应选择企业级可管理交换机，具备无阻塞交换架构、充足的高速端口、流量管理功能和冗余电源。
- 使用VLAN对网络进行分段，以分离以下部分：(a) 数据采集VLAN（显微镜和相机控制器、存储服务器）；(b) 计算VLAN（GPU工作站和集群节点）；(c) 管理VLAN（远程访问、监控、管理）。
注意：网络分段可减少广播流量，提高安全性，并允许对各个子系统进行独立故障排查。 - 通过核心交换机上的专用上行端口将设施网络连接至机构广域网（WAN）。1–10 Gbps的上行链路连接到校园网络，足以支持远程访问和外部数据传输。
- 与机构IT部门协调，为所有可访问设施的设备配置静态IP地址、DNS条目及适当的防火墙规则（图1）。
- 安装并标记所有网络布线。对于100米以内的10+ Gbps连接，使用直连电缆或有源光缆（屏蔽Cat6A也可用于100米以内的10 Gbps连接）；对于机架间25+ Gbps链路，使用预端接光纤组件（LC-LC或MTP）。
- 使用网络图记录完整的布线方案，图中需明确设备名称、IP地址、端口分配及VLAN成员关系。
注意：参见 图2，了解小型冷冻电镜设施推荐的最小网络拓扑示意图。
4. 存储服务器设计与部署
- 在采购硬件之前计算存储需求。作为基准：单次高端冷冻电镜实验每天会产生 2–5 TB 的原始数据。
- 根据预期的设施使用情况估算长期存储需求。一个配备两台显微镜、服务于 20 名用户的设施，在运行 3–6 个月后可能产生约 2 PB 的数据。需同时规划原始数据存储（短期、高吞吐量）和处理后数据存储（中期、更大容量），因为处理后的数据集通常比原始输入数据大 10–20 倍。
- 选择可靠的存储架构。对于大多数设施而言，基于 ZFS 的独立服务器是推荐的起点，其具有较高的成本容量比、内置数据完整性校验（校验和）、灵活的 RAID 等效配置（RAIDZ、RAIDZ2）以及快照支持功能。集群式分布式文件系统（Gluster、Ceph、GPFS/IBM Spectrum Scale）可提供更高的性能和可扩展性，但需要多个物理服务器并涉及更复杂的管理。
- 配置 ZFS 存储池。推荐的初始配置：两个 RAIDZ2 虚拟设备（vdev），每个由 6–8 块高容量 SAS 机械硬盘（每块 16–20 TB）组成，可在同时容忍两块硬盘故障的前提下提供约 60–70% 的可用容量。
- 使用 2–4 块 NVMe 固态硬盘添加专用的 SSD 写缓存（L2ARC）虚拟设备，以提升活跃处理任务的随机读取性能。
注意： 生产级存储阵列中不得使用消费级 SATA 硬盘。冷冻电镜工作流具有持续的随机 I/O 模式，必须采用具有额定工作负载能力（例如 550 TB/年）的企业级 SAS 或 NL-SAS 硬盘。 - 在 ZFS 存储服务器上配置 NFS 导出（用于 Linux 客户端）和 SMB 共享（用于 Windows 客户端）。将主数据共享挂载到所有 GPU 计算节点及相机控制器工作站上，以实现直接数据访问，避免中间拷贝。
- 建立数据保留与生命周期管理策略。明确以下内容：(a) 原始电影数据的保留期限（通常为采集后 3–6 个月）；(b) 运动校正后显微图像的保留期限；(c) 最终处理数据集的保留期限（直至发表前无限期保留）；(d) 已完成项目的归档流程。
- 当存储使用率超过 70% 时启用自动告警机制，以便及时采购额外存储资源。
注意： 存储是冷冻电镜设施规划中最常被低估的成本。切勿将显微镜采购获批等同于已获得充足的存储资金支持。存储设备的采购必须与仪器安装同步规划，而非在数据采集开始之后才进行。
5. GPU 计算基础设施
- 根据预期吞吐量确定计算需求。对于单台显微镜在24小时运行期间产生3,000–5,000张显微图像的情况，至少需要两个计算节点，每个节点配备4块NVIDIA GPU显卡（Maxwell架构或更新，显存≥11 GB，例如RTX 3090、RTX 4090或A100），以在数据采集速度下持续进行实时预处理。
- 对于大型设施或高倾转系列数据量的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）工作流程，应增配额外的计算节点。
- 指定GPU计算节点的硬件配置。每个节点应包含：(a) 4块支持CUDA的NVIDIA GPU（用于CryoSPARC和RELION三维精修时，每块GPU显存至少24 GB）；(b) 高核心数CPU（AMD EPYC或Intel Xeon，≥32核），以支持并行的CPU密集型步骤（如CTF估计、文件输入/输出）；(c) ≥256 GB系统内存；(d) 2–4 TB NVMe SSD本地临时存储空间，用于存储活跃任务的中间数据；(e) 10/25 Gbps网络接口卡（NIC）；(f) 足够的本地存储空间用于工作数据集（通常为RAID卷）。注意：消费级GPU（如RTX 4090）在冷冻电镜工作负载下可提供与企业级GPU（如A100）相当的性能，且成本显著更低。应专门针对CryoSPARC和RELION进行基准测试评估，因其内存访问模式更倾向于高内存带宽的GPU。
- 在每个计算节点上安装NVIDIA驱动程序套件、CUDA工具包（需与CryoSPARC和RELION兼容的版本）以及cuDNN。使用配置管理工具统一各节点的软件环境，简化未来的更新维护。
- 以独立或集群模式部署CryoSPARC。对于多节点设施，应在专用的主控节点上安装CryoSPARC-master，在每个GPU计算节点上安装CryoSPARC-worker。
- 配置作业调度系统，允许多名用户同时提交并行处理任务。请参考CryoSPARC官方架构文档中的最低系统要求和网络配置指南。
- 在主处理平台旁同时安装RELION，为用户提供两种处理生态系统。通过调度器（SLURM或PBS/Torque）配置该软件以调用本地计算节点资源。
- 安装辅助工具：MotionCor2（运动校正）、CTFFIND4和Gctf（CTF估计）、TOPAZ（基于机器学习的颗粒挑选）、crYOLO（基于神经网络的颗粒挑选工具）以及cryoDRGN（异质性分析工具）。有关单颗粒分析（SPA）、冷冻电子断层扫描（cryo-ET）、亚层析平均（STA）和微晶电子衍射（microED）可用软件包的概览，请参见表3。
- 采用SBGrid联盟的部署方案或基于容器的软件管理方式（高性能计算环境使用Singularity/Apptainer，工作站使用Docker），以维护可重复、版本可控的软件环境。
注意：SBGrid为所有主流冷冻电镜软件工具提供预编译且经过验证的版本，并为学术机构提供自动化的更新管理。
6. 远程访问基础设施
- 将基于虚拟专用网络（VPN）的远程访问确立为所有远程用户和工作人员的主要安全入口。与机构信息技术部门协作，配置特定设施的VPN配置文件或隧道，以实现对设施计算和存储网络的访问，同时避免设备暴露于更广泛的公共互联网中。
- 在所有远程访问点实施双因素身份验证（2FA）（图2）。
- 部署远程桌面软件，以实现对显微镜控制器和GPU工作站的图形化访问。推荐选项包括：(a) TeamViewer（商业软件，跨平台，支持NAT穿透——适用于显微镜控制器访问）；(b) NoMachine（商业软件，跨平台，支持OpenGL 3D图形转发——推荐用于运行可视化工具的GPU工作站）；(c) TurboVNC配合VirtualGL（开源软件，仅限Linux系统，支持远程3D渲染）。
注意：许多冷冻电镜（cryo-EM）可视化工具使用OpenGL进行3D渲染。标准X11转发不支持硬件加速的OpenGL。对于此类应用，请使用NoMachine或VirtualGL/TurboVNC。 - 配置对显微镜数据采集软件的远程访问。通过机构VPN使用Leginon或SerialEM实现远程操作。可通过经批准的远程桌面应用程序远程访问显微镜数据采集软件。
- 在正式开展用户操作前，从典型的远程位置（家庭网络、合作机构）测试远程连接性（表4）。
- 建立基于网页的设施监控仪表板，使工作人员和用户能够远程监控数据采集状态、预处理结果、存储使用情况以及计算队列状态。Leginon包含内置的网页监控界面。
- 针对CryoSPARC工作流程，配置由流水线日志输出和系统监控工具（Prometheus、node_exporter）驱动的Grafana或自定义网页仪表板。
- 为外部用户建立数据交付机制。在设施存储系统上配置经过身份验证的数据传输服务，例如Globus Connect Server。
- 对于无法使用Globus的用户，准备带有记录校验和的USB硬盘邮寄流程。外部用户直接下载多TB级数据集时，需具备10 Gbps的互联网上行带宽以保证实用性。
7. 实时数据处理工作流程：实施
- 每次数据采集前预先配置数据流路径。确认以下事项：（a）相机控制器将原始影片直接写入机构的NFS挂载高性能存储；（b）NFS共享已挂载并可在所有GPU计算节点上访问；（c）计划会话所需的存储空间充足（24小时单粒子分析会话至少需要5 TB可用空间）；（d）GPU计算节点可用，且无长时间运行的任务争用资源。
- 设置增益参考校正。每次实验前，按照探测器供应商的要求获取增益参考图像（通常为在网格空白区域上的空白光束曝光）。
- 将增益参考文件放入指定的预处理输入目录中。所有运动校正软件（MotionCor2、RELION 自带的实现版本）在正确配置后将自动应用此参考文件。
- 使用CryoSPARC-Live启动实时预处理流程（推荐用于实时可视化）。当输出目录中出现首批电影文件时即应启动该流程——通常在自动数据采集开始后的前5–10分钟内。
注意：CryoSPARC-Live 会持续监控指定目录中的新电影文件，并在文件到达时立即进行处理。主要区别在于，CryoSPARC-Live 提供了一个用于实时监控的交互式网页界面。 - CryoSPARC-Live 工作流程
- 在网络界面中，导航至一个新项目或现有项目，并创建一个新的实时会话11,36.
- 配置输入源：指定由相机控制器写入的目录路径（“监视文件夹”）、匹配原始电影文件的文件模式（例如 *.tif、*.mrc 或用于 EER 格式 Falcon 4i 数据的 *.eer），以及增益参考文件路径。
- 设置运动校正参数：使用的帧数、基于图像块的运动校正（推荐使用 5×5 图像块）、输出二值化因子（通常在接近奈奎斯特采样频率的数据采集时设为 1，初步筛选时设为 2），以及每帧电子剂量（根据总剂量和帧数计算得出）。
- 设置CTF估计参数：拟合的分辨率下限和上限（通常为30 Å 和 4 Å），离焦搜索范围（0.5–5 µm 推荐用于 SPA），以及最大可接受的散光值。为冷冻电子断层成像数据集启用每倾角 CTF 估计。
- 配置颗粒挑选：选择挑选方法（初始阶段使用斑点挑选器；获得首批良好的二维分类结果后使用模板挑选器；对于难以处理的样本使用 TOPAZ 挑选器）。设置预期颗粒直径以及颗粒间的最小/最大间距。
- 为了显著降低存储需求、数据传输负载和计算成本，建议在颗粒提取过程中进行傅里叶裁剪，裁剪因子为4（导致物理像素尺寸增大至原来的4倍）。对于常规数据质量评估，可采用3–5 Å的中间分辨率。 Å 在实时处理过程中，通常已足够。
- 在实时会话中启用二维分类。设置二维分类的类别数量（通常为 50–200），用于增量更新的批次大小（200–500 个粒子），以及分类的分辨率限制（6–8 Å 用于初步评估）。
- 启动实时会话。实时监控仪表板中的以下参数：传入视频数量及速率、运动校正质量（每段视频的总运动量——拒绝总运动量过大 >30 Å 总运动（作为经验法则），CTF 拟合质量（剔除 CTF 拟合分辨率较差的显微照片） >6–8 Å每张显微照片的颗粒产量以及二维分类平均图像质量的变化。
- 设置自动筛选的接受阈值。在“筛选”面板中，定义针对运动（总运动量截断值）、CTF质量（拟合分辨率截断值）以及离焦范围（排除严重欠焦或过焦的显微照片）的剔除标准。经筛选的颗粒将自动传递至下游的二维分类任务。
8. 数据采集过程中的实时质量控制与反馈
- 持续监测整个实验过程中的CTF统计信息。绘制每张显微照片的离焦值分布图：数据应集中在目标离焦范围内（通常为−0.5至−3.0 µm 用于SPA）。
- 系统性地向更高离焦值漂移可能表明样品台漂移或齐焦高度校准错误。若CTF拟合分辨率下降至6埃以下，应立即通知设施工作人员。 Å，因为这通常表明存在冰污染、光束不稳定或需要干预的焦距漂移。
- 监测运动校正输出结果。每部影片的总帧内运动应小于10–30 Å 以获得高质量数据。早期帧中出现系统性大幅运动是正常现象，可进行校正；然而，若在整个视频过程中持续存在大幅运动（>40 Å 总计）可能表明机械台不稳定或样品充电，应进行排查。
- 在会话期间定期检查二维分类平均图（每30–60分钟一次）。高质量数据集的指标包括：分类平均图中可见二级结构特征、颗粒的多个不同视角，以及无堆积或聚集伪影。
- 监测需干预的指标：所有颗粒被分选至无特征的“垃圾”类别（提示样品或冰层质量较差），某些视图完全缺失（提示存在优势取向，可能需要优化载网），或每张显微照片颗粒产出量极低。
- 在结构化的会话日志中记录所有观察结果。记录内容包括：会话的开始和结束时间、显微镜和相机设置、实时统计摘要（采集的电影总数、通过CTF筛选的比例、通过运动校正筛选的比例、已挑选的颗粒总数、2D分类评估结果）以及任何干预操作。该日志对于回溯性质量评估和设备性能报告至关重要。
- 在会话结束时生成一份总结性数据质量报告。实时处理平台会自动导出会话摘要。
注意：生成摘要和报告的另一种选择是使用人工智能工具，例如 Vitreum。在加州大学圣克鲁兹分校生物分子冷冻电镜中心，Vitreum 平台被用于管理实验室工作流程和实验记录。Vitreum 能在实验过程中实时记录操作步骤，执行协议层面的约束条件，根据预设的质量标准验证工作流程的执行情况，并提供可审计的实验室活动记录。通过将实验室操作与设施的计算和数据管理基础设施相整合，该平台最大限度地减少了人工记录的工作量，提高了实验可重复性，促进了中心工作人员与用户之间的沟通，并实现了从样品制备到数据采集及后续计算分析全过程的实验一致性追踪。
9. 采集后数据处理流程
- 实时预处理完成后，将经过筛选的分箱粒子堆栈与经过筛选的预处理电影一并导出。
- 将CryoSPARC项目从主工作站分离，然后重新连接至另一个可共享且远程访问的工作站。这可以快速卸载数据并周转，以便启动下一次数据采集会话。
注意： 典型的数据收集过程通常持续1–2天，可通过CryoSPARC-Live轻松监控。然而，三维处理步骤可能需要数周甚至数月，因此在不同工作站及存储服务器之间转移项目是合理且必要的。 - 在CryoSPARC中，将实时会话中筛选后的分箱粒子导出至一个标准项目，用于离线三维处理36。
- 执行从头开始的三维重构。在CryoSPARC中使用“Ab Initio Reconstruction”任务（对于异质样品建议生成3–5个初始模型），生成1–4个初始模型以评估结构异质性。
- 当重构结果达到满意水平后，重新提取未分箱的粒子以提高整体分辨率。
- 进行三维精修：若怀疑存在多种构象或类别，则使用非均质精修，随后对最优类别进行均质精修。在CryoSPARC中，应依次使用非均质精修和非均匀精修。
- 在RELION中应用贝叶斯抛光13，或使用CryoSPARC中的“CTF refinement”任务进行单粒子运动校正和CTF精修，以根据用户偏好通过校正电子束诱导运动和单粒子离焦来提升每颗粒子的信号质量。该步骤通常可使最终密度图分辨率提高0.2–0.5 Å。此外，CryoSPARC中的基于参考的运动校正（RBMC）也可作为提升分辨率和密度图质量的可选方案。
- 使用黄金标准傅里叶壳层相关（FSC）方法验证最终密度图。将粒子堆栈分为两个独立的半数据集，分别进行精修，并计算两个半图之间的FSC。以FSC = 0.143时的数值报告最终分辨率。
- 在完成原子模型拟合后，计算密度图与模型之间的FSC（FSC-Q）以及Q-score，作为独立的验证指标37。
- 进行原子模型构建与验证。使用ModelAngelo从密度图中自动进行从头建模20。利用PHENIX进行实空间精修，并通过MolProbity进行验证。
- 在初始模型生成后，使用COOT35可视化密度图，拟合或调整原子坐标，修正建模错误，构建缺失区域，并优化蛋白质、核酸或配体结构。该工具支持对残基、侧链构象、二级结构及序列指派进行交互式编辑，并结合实空间精修以提高原子模型与实验密度之间的匹配度。
- 最后，将最终的原子模型存入蛋白质数据库（PDB），将密度图存入电子显微镜数据银行（EMDB），并将原始数据或预处理数据存入电子显微镜公共图像档案库（EMPIAR）。
结果
成功实施的设施信息技术基础设施与实时数据处理流程将在每个阶段产生以下可验证的结果：
网络与存储
相机控制器与存储服务器之间的内部数据传输应保持 ≥当使用 iperf3 或 fio 等工具测量时，传输速率可达 800 MB/s（接近理论 10 Gbps 吞吐量）。该吞吐量足以在 1 秒内传输一个 10 GB 的文件。–12 GB 电影堆栈可在 15 秒内从检测器获取，确保存储写入不会在高速 EER 数据采集中形成瓶颈。应每日监控 ZFS 存储池利用率及各池 IOPS；健康存储池应无降级或故障的 VDEV，且读取速度稳定保持在 ≥顺序读取速度为 500 MB/s。
实时预处理
即时工作流应处理每一段新影片。—包括运动校正、CTF估计与颗粒挑选—在写入磁盘的数秒内即可完成，从而与现代探测器帧率（例如以5帧/秒速率运行的TFS Falcon 4i）保持同步。–每分钟 15 部影片（以 10 秒计）–100 Gbps 网络连接与交换机）。对于一次持续 24 小时、产生约 8,000–在150,000倍放大倍率下使用选定探测器采集的12,000张显微照片，该流程应产出约200,000–选取的800,000个颗粒，中位CTF拟合分辨率为3.0–5 Å以及一套初步的二维类别平均图，在4Å分辨率下显示出清晰的二级结构特征（α-螺旋、β-折叠）。–会议开始后6小时。
二维与三维处理基准测试
每个计算节点配备4块NVIDIA RTX 4090 GPU，在包含500,000个颗粒的数据集上，CryoSPARC二维分类（200个类别，25次迭代）预计可在约30分钟内完成。–60分钟。从10万个颗粒进行从头三维重建应在15分钟内完成。–30分钟。对一个300 kDa的复合物进行完整的3D精修以达到近原子分辨率通常需要2–具体时长取决于颗粒数量与目标分辨率，通常为 2 至 8 小时。这些基准测试结果为检测因硬件故障或资源竞争导致的性能退化提供了参照基线。
设施性能指标
一个运行良好的设施应每月追踪以下关键绩效指标（KPI）：(a) 仪器正常运行时间百分比（目标： >(a) 数据采集会话成功率（目标：>90%）；(b) 从会话启动即启用实时处理流程的会话比例（目标：100%）；(c) 存储利用率与增长率；(d) 活跃用户与项目数量；(e) 提交至 EMDB/PDB 的结构数量；(f) 产出可发表质量二维分类的会话比例。这些指标为运行成功提供了客观证据，并支持设施向资助机构提交报告。
图 1冷冻电镜设施数据流架构概述。 从电子探测器到最终存储结构的完整数据路径示意图。原始电影帧通过10 Gbps设施网络交换机从相机控制器写入高性能NFS存储。GPU计算节点挂载同一存储共享并开始实时预处理（运动校正）。 → CTF 估计 → 颗粒挑选 → 二维分类）与数据采集同步进行。预处理输出结果与最终的三维重构数据存储于同一存储池或二级存储池。远程用户通过机构虚拟专用网络及经批准的远程桌面软件访问计算资源与存储。外部数据交付通过经认证的传输服务或寄送物理存储介质完成。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2小型冷冻电镜设施的最小网络拓扑结构。 所有数据采集与处理设备—相机控制器、显微镜控制器、存储服务器>1 PB 容量存储服务器，以及 GPU 计算服务器（N 个节点）—通过一台中央10 Gbps（或更高速度）管理型网络交换机进行连接。该交换机上行链路接入机构互联网/广域网，以实现远程访问。远程数据处理和远程监控可通过VPN在公共互联网上访问。所示存储容量代表一个单显微镜、20名用户、运行3年的设施。–6个月。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 制造商 | 模型 | 千伏最大 | 电子源 | 兼容性 DED | 主要应用 | 优势 | 局限性/注意事项 |
| 赛默飞世尔科技 | Krios G4/Krios 5 | 300 千伏 | XFEG/CFEG | Falcon 4i, Falcon 3EC, Gatan K3/K2 | SPA、冷冻电子断层扫描/亚断层图像平均、微晶电子衍射 | 金标准平台，全自动化（EPU），最高通量，最适合高分辨率（<2.5 Å) | 成本最高、对基础设施要求最高 |
| Glacios 2 | 200 kV | XFEG | Falcon 4i, Falcon 4, Gatan K3 | SPA、冷冻电子断层扫描、微晶电子衍射 | 性能强劲，成本更低，占地面积紧凑，高度易用 | 相较于 300 kV 的较低极限分辨率 | |
| Talos Arctica | 200 kV | XFEG | Falcon 3, Falcon 4, Gatan K2/K3 | SPA，冷冻电子断层扫描 | 经过验证、稳定可靠、广泛采用 | 老一代，自动化程度较低 | |
| Talos L120C | 120 千伏 | LaB6 | Ceta CMOS（有限剂量电子衍射） | 筛选，微晶电子衍射（有限） | 经济高效，培训/筛选 | 不适用于高分辨率单颗粒分析 | |
| JEOL | CRYO ARM 300 II (JEM-Z300FSC) | 300 kV | 冷场发射枪 | Gatan K3/K2, Direct Electron DE64 | SPA、冷冻电子断层扫描/亚层析平均技术、微晶电子衍射 | 冷场发射枪（高相干性），顶级分辨率，优异光学性能 | 生态系统整合度较低 |
| CRYO ARM 200 | 200 kV | 冷场发射枪 | Gatan K3/K2, DE64 | SPA，冷冻电子断层扫描 | 卓越的性能成本比，高稳定性 | 现成的自动化工具较少 | |
| JEM-3200FSC | 300 千伏 | 场发射枪 | Gatan K2/K3, DE20 | SPA，冷冻电子断层扫描 | 庞大的装机量，久经验证 | 遗留系统，过时支持 | |
| 日立高新技术 | HF8300 | 300 kV | 场发射枪 | Gatan K3/K2，DE64（定制集成） | SPA，冷冻电镜断层成像 | 高电压耐受能力，灵活集成 | 结构生物学中的有限应用 |
| HT7800 | 120 千伏 | LaB6 | 互补金属氧化物半导体，有限直接电子探测器 | 筛选，微电子衍射 | 可靠的筛查范围 | 不适用于高分辨率冷冻电镜 | |
| SU9000 (透射电子显微镜/扫描透射电子显微镜) | 200 kV | 冷场发射枪 | 兼容低温条件的有限剂量电子束曝光 | 生态位冷冻，材料 | 先进光学 | 不广泛用于 SPA/ET |
表1：现有冷冻透射电镜平台与推荐直接电子探测器的比较。 按制造商（赛默飞世尔科技、日本电子株式会社、日立）汇总的市售冷冻透射电镜，包括型号名称、最大加速电压（kV最大)、适用于低温操作的兼容直接电子探测器，以及主要成像应用领域（单颗粒分析、亚断层图平均/冷冻电子断层扫描、微电子衍射）。本资料旨在作为规划参考；具体技术规格请咨询制造商。缩写说明：DED = 直接电子探测器；XFEG = 极端场发射电子枪；CFEG = 冷场发射电子枪；FEG = 场发射电子枪；SPA = 单颗粒分析；cryo-ET = 冷冻电子断层扫描；STA = 亚断层图平均；MicroED = 微电子衍射；TEM = 透射电子显微镜；STEM = 扫描透射电子显微镜。
| 检测器 | 供应商 | 关键特征 | 典型配对 | 最佳应用场景 |
| Falcon 4i | 赛默飞世尔科技 | EER模式，极高帧率，高DQE | Krios, Glacios | 高通量单颗粒分析，冷冻电子断层扫描 |
| Gatan K3 | Gatan (AMETEK) | 计数模式，大视场，超分辨率 | JEOL + Thermo | 高分辨率 SPA（标准） |
| Gatan K2 | Gatan | 上一代计数探测器 | 遗留系统 | 成熟的工作流程 |
| DE64 | 直接电子 | 大尺寸传感器，高通量 | JEOL，选定的 Thermo | 冷冻电子断层扫描，大视野 |
| 阿波罗 | 直接电子 | 高帧率，高通量 | Krios, Glacios, JEOLs | SPA 与微晶电子衍射 |
表2：当前市场上可用的DED产品。 按制造商分类的商用直接电子探测器概览。缩写：EER = 电子事件记录；DQE = 探测量子效率；FOV = 视场；SPA = 单颗粒分析；cryo-ET = 冷冻电子断层扫描；microED = 微电子衍射。
| 软件 | 主要功能 | 关键特征 | 参考文献 |
| RELION | 端到端单粒子分析处理 | 贝叶斯精修、分类、CTF精修 | 7, 12, 13 |
| cryoSPARC | 端到端单粒子分析 | 快速 GPU 处理管线，从头重建 | 11 |
| EMAN2 | 图像处理套件 | 重建与异质性分析 (e2gmm) | 14 |
| cisTEM | SPA处理 | 用户友好的图形用户界面、优化与验证 | 15 |
| SPHIRE | SPA（基于SPARX） | 高分辨率精修工作流程 | 16 |
| cryoDRGN | 异质性分析 | 深度学习潜在空间重建 | 17 |
| Topaz | 颗粒挑选 | 基于深度学习的挑取 | 18 |
| crYOLO | 颗粒挑选 | 实时神经网络拾取 | 16 |
| Warp | 预处理 | 运动校正、CTF估计、实时处理 | 19 |
| 模型 Angelo | 模型构建 | 基于电子密度图的自动化模型构建 | 20 |
| 冷冻电子断层扫描 + 亚断层平均 | |||
| 软件 | 主要功能 | 关键特性 | 参考文献 |
| IMOD | 倾转系列图像对齐 & 重建 | 断层扫描重建的金标准 | 21 |
| Dynamo | STA | 基于几何结构的颗粒挑选，灵活的工作流程 | 22 |
| emClarity | STA 精修 | 高分辨率单颗粒分析，模板匹配 | 23 |
| RELION（电子断层成像模块） | STA 精修 | 贝叶斯 STA，与 SPA 工作流程的集成 | 24 |
| EMAN2 (SPT) | STA | 亚体素图优化工具 | 14 |
| Warp/M | 预处理 + STA | 实时断层扫描预处理 | 19 |
| AreTomo | 断层图重建 | 快速对齐与重建 | 25 |
| PEET | STA | 亚断层图平均（基于IMOD） | 26 |
| PyTom | STA | 模板匹配，分类 | 27 |
| Tomo3D | 重建 | 快速 GPU 断层图重建 | 28 |
| crYOLO (3D) | 颗粒挑选 | 基于机器学习的断层扫描图像颗粒挑选 | 16 |
| AITom | 基于人工智能的分析 | 深度学习用于分割与分类 | 29 |
| 微电子衍射 | |||
| 软件 | 主要功能 | 关键特征 | 参考文献 |
| DIALS | 衍射处理 | 衍射数据整合 | 30 |
| XDS | 数据处理 | 衍射数据的索引与整合 | 31 |
| MOSFLM | 数据处理 | 晶体学指标化 | 32 |
| SHELX | 结构解析 | 定相与精修 | 33 |
| Phenix | 结构精修 | 自动化模型构建 | 34 |
| COOT | 模型构建 | 手动模型校正 | 35 |
表3：单颗粒分析、冷冻电子断层扫描、亚断层扫描平均与微晶电子衍射常用软件包示例。 商业与公开软件包概览。缩写：SPA = 单颗粒分析；cryo-ET = 冷冻电子断层扫描；STA = 亚断层图平均；MicroED = 微电子衍射；CTF = 衬度传递函数；GUI = 图形用户界面；ML = 机器学习。
| 类别 | 软件 | 类型 | 主要功能 | 关键特性 / 在设施中的作用 |
| 操作系统 | Linux (Ubuntu, CentOS/Rocky) | 操作系统 | 核心计算环境 | 高性能计算标准，GPU支持，脚本编写，集群部署 |
| 操作系统 | Windows | 操作系统 | 用户界面/工作站操作系统 | 与供应商软件的兼容性、远程桌面访问 |
| 文件系统 | ZFS | 文件系统 | 数据存储 & 完整性 | 快照、冗余、数据完整性（校验和）、可扩展存储 |
| 网络文件共享 | NFS | 实验方案 | 基于 Linux 的文件共享 | 跨计算节点的高性能共享 |
| 网络文件共享 | SMB (CIFS) | 实验方案 | 跨平台文件共享 | Windows–Linux 互操作性 |
| 远程访问 | Microsoft Remote Desktop (RDP) | 远程访问 | 基于图形用户界面的远程控制 | 原生 Windows 远程访问 |
| 远程访问 | NoMachine | 远程访问 | 高性能远程桌面 | 快速 GPU 加速可视化，在冷冻电镜中广泛应用 |
| 远程访问 | TeamViewer | 远程访问 | 远程支持/访问 | 易于设置，跨平台支持 |
| 远程访问 | VirtualGL + TurboVNC | 远程可视化 | GPU 加速远程渲染 | 远程 cryoSPARC/RELION 可视化必备 |
| GPU 计算 | CUDA | 计算框架 | GPU 加速 | cryoSPARC、RELION 及深度学习工具所需 |
| 数据转移 | Globus | 数据传输 | 安全的大规模转移 | 跨机构高速容错数据传输 |
表 4：冷冻电镜设施 IT 运维与数据处理软件参考。 关键软件工具参考列表涵盖操作系统（Linux、Windows）、文件系统（ZFS）、网络文件共享（NFS、SMB）、远程访问（Microsoft RDP、NoMachine、TeamViewer、VirtualGL/TurboVNC）、GPU计算（CUDA）以及数据传输（Globus）。缩写说明：OS = 操作系统；HPC = 高性能计算；NFS = 网络文件系统；SMB = 服务器消息块；CIFS = 通用互联网文件系统；RDP = 远程桌面协议；GUI = 图形用户界面。
讨论
冷冻电镜设施的IT基础设施并非可有可无的辅助环节，而是运行的先决条件。若设施在缺乏足够存储、网络和计算能力的情况下启动数据采集，最终必然面临选择：要么丢弃原始数据，要么停止数据采集，要么接受长达数月的结构解析延迟。本文所述方案旨在防止上述情况的发生，确保在首位用户开始使用前，计算基础设施已得到合理设计、充分测试和有效验证。
冷冻电镜信息技术设计中最重要的一条原则是，存储和网络容量的规划必须与探测器的数据输出相匹配，而非依据设施设计者的过往经验。在 EER 模式下，探测器每个电影堆栈可写入 8–12 GB 数据；在 24 小时运行期间，以每分钟约 15 个电影的速度采集，压缩前将产生约 2–5 TB 的原始数据。尽管实时无损压缩技术（CryoSPARC-Live 提供）可将数据量减少 50–70%，但网络和存储系统仍必须能够承受压缩功能被禁用或失效时的未压缩写入速率。设计时必须以峰值容量而非平均容量为依据。
实时处理是近年来冷冻电镜设施运行中最具影响力的技术进步之一。在实时处理流程出现之前，设施工作人员无法在数据采集后的数小时甚至数日内客观评估数据质量，而此时实验已经结束，样品载网可能已被丢弃。通过使用 CryoSPARC-Live，实验开始后 2–4 小时内即可获得显示可识别二级结构的二维分类平均图，从而能够科学地决策载网选择、数据采集参数调整以及实验的延续或终止。这种反馈机制或许是信息技术基础设施提升科研成果最直接的体现。
实时工作流程的一个已知局限性是其对配置错误的敏感性。像素尺寸设置错误、增益参考不正确或每帧剂量值不匹配，都会在整个流程中传播，导致产生误导性的质量评估指标和受损的颗粒堆栈。因此，我们建议采用标准化的会话前检查清单，在开始数据采集之前明确验证所有流程配置参数。该检查清单应被视为关键安全文档，类似于航空领域中的飞行前检查清单，正如冷冻电镜设施管理相关文献中所述。
在CryoSPARC-Live与RELION之间的选择取决于设施的优先需求。实时处理平台提供了更优越的实时网页界面，实现了实时处理与离线处理环境之间更紧密的整合，并为非专业用户提供了更简便的配置方式。相比之下，RELION在处理参数方面提供了更精细的控制，对于需要特定算法选项（例如贝叶斯抛光、特定的三维分类策略）的用户而言是首选平台，而CryoSPARC则具备其他三维分类策略（例如3DVAR或三维分类）。许多设施会并行部署两种平台，使用CryoSPARC-Live进行实时监测，同时使用RELION进行最终结构解析。
远程访问基础设施需要特别强调。根据我们的经验，用户在数据采集过程中报告的大多数问题源于远程访问失败，而非显微镜或探测器本身的问题。对显微镜和数据采集工作站实现可靠、低延迟的远程桌面访问并非奢侈需求，而是大多数用户与设施交互的主要方式。在专业配置的远程桌面服务器上投入资源，从典型用户位置测试连接性，并清晰记录连接流程，这些措施对提升用户体验的积极影响，将超过许多成本更高的硬件投资。
最后，在设施开始运行之前，必须制定数据管理政策并向用户明确传达。用户经常低估其数据集的大小，同时高估其存储配额的使用期限。制定一份清晰的书面政策，明确规定原始数据的保留期限、用户数据配额、归档流程以及超出存储配额后的费用补偿机制，既能保护设施本身，也能保障用户利益，并避免因会话中途存储空间耗尽而引发的运行危机。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢加州大学圣克鲁兹分校化学与生物化学系生物分子冷冻电镜中心（RRID: SCR_021755）提供的科学与技术支持（NIH高端仪器项目，S10OD02509）。
材料
参考文献
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