高内涵成像与数据处理的标准化工作流程

Xinyue Liu; Yili Wang; Zhenting Tan

doi:10.3791/71863

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高内涵成像与数据处理的标准化工作流程

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DOI：

10.3791/71863

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2026年8月21日

Xinyue Liu¹ , Yili Wang² , Zhenting Tan³

¹College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ²Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ³School of Life Science and Technology, Southeast University

本文内容

摘要

本文介绍了一种标准化的高内涵成像及数据处理方案，用于对碘化丙啶（PI）/Hoechst 33342染色的细胞进行自动化图像采集与分析，以实现可重复的细胞活力分析。

摘要

为解决科学研究成像中因操作差异导致的低重复性问题，以及传统方法在分析大量样本时的复杂性，本文介绍了一种对HT22细胞进行PI和Hoechst 33342染色后，利用高内涵成像系统进行成像与数据分析的实验方案。该工作流程旨在建立稳健的成像参数设置和严格的质控标准，展示了仪器提供的三种不同图像处理方法的操作设置及流程：多波长细胞评分法（Multi-Wavelength Cell Scoring, Multi）、活-死细胞分析法（Live-Dead, Live）以及自定义模块编辑器（Custom Module Editor, CME）。这些图像处理方法与传统ImageJ方法进行了比较和验证，以确保其有效性。本研究最终总结出一套利用高内涵成像系统结合PI与Hoechst双染法测定细胞活力的标准化工作流程。通过全程标准化成像与数据处理流程，显著提升了科学研究成像的可重复性与可靠性，为跨实验室数据比较提供了坚实的的方法学支持，推动了科学研究的发展。

引言

高内涵成像系统是现代科学研究中的关键工具，能够实现对受损或未受损细胞的高速成像和多参数评估¹^,²^,³。它在多个学科领域中发挥着不可替代的作用。在生命科学领域，该系统帮助研究人员探索细胞与组织的微观世界⁴^,⁵。例如，通过精确检测细胞内荧光标记的分子和结构，可清晰呈现细胞的精细结构及其动态变化过程⁶。在神经科学研究中，该系统可实现神经元的三维成像，有助于分析神经网络复杂的连接方式和信号转导机制，为理解脑功能及神经系统疾病的发病机制提供重要线索⁷^,⁸^,⁹。

尽管高内涵成像系统技术具有显著优势，其成像过程仍存在若干问题。在样品制备阶段，操作具有较高的主观性。在生物样品制备过程中，细胞处理和染色等步骤缺乏相应的标准。在成像参数方面，不同实验室及不同型号的高内涵显微镜在曝光时间与孔板选择上存在显著差异。在数据处理阶段，从原始图像的去噪与对比度调整，到目标特征参数的识别与确定，均缺乏标准化流程。这些问题直接导致显微成像结果出现偏差，引发可重复性危机。

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方案

本方案使用一种商业化的细胞系（HT22，ATCC），不涉及人类受试者或原代人类组织。本研究未使用动物。

1. 标准化样品制备

准备HT22细胞
1. 当HT22细胞融合度达到80%¹⁰^,¹¹时，弃去旧培养基。加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，在室温下孵育1–2分钟。
2. 加入体积为0.25%胰蛋白酶3倍的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）以终止消化。将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
3. 在室温下以175 × g离心3分钟，弃去上清液。用完全DMEM重悬细胞，制成单细胞悬液。
4. 使用细胞计数板进行细胞计数。每孔加入100 µL完全培养基，接种5,000个细胞至96孔板中¹²。
5. 将96孔板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。根据实验设计，在96孔板中进行分组、给药和染色操作。
  注意：应使用与成像系统兼容的96孔板。根据制造商的说明，选择具有合适底部厚度和结构的培养板。当需要更高图像质量时，推荐使用玻璃底板（底部厚度130–170 µm）¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶。
染色步骤
1. 确保细胞形成单一且分散良好的单层，融合度不超过70%，以尽量减少细胞重叠（图1B）。
2. 根据实验要求对样本进行分组，并在处理后进行染色。配制工作液，终浓度为PI 6.684 µg/mL，Hoechst 33342 10 µg/mL¹⁷^,¹⁸。
3. 从96孔板中弃去旧培养基，每孔用100 µL PBS洗涤两次。加入染料工作液，在室温避光条件下孵育30分钟进行染色。
4. 每孔用100 µL PBS洗涤两次，然后加入DMEM。
  注意：不同实验设计在加样和染色参数上可能存在差异。

2. 成像规格与参数设置

成像参数标准
注意：本研究仅演示在PI和Hoechst 33342染色后，仪器的宽场成像工作流程。
1. 打开仪器电源，然后启动计算机。打开随设备提供的分析软件。
2. 将96孔板装入仪器中。选择含有样本的视野区域进行成像。
3. 在物镜和相机设置中，将放大倍数设为“20XPh1SPlanFluorELWDADM”（Nikon，S Plan Fluor，ELWD，20X/0.45，∞/0-2，WD 8.2-6.9，OFN22，Ph1，AMD，MRH48230），相机二分之一合并（binning）设为“2”，采集模式设为“Widefield”。
4. 在孔板模式下，选择与96孔板对应的参数，并根据产品尺寸数据调整孔板参数。
5. 在“Site Option”中，通常每孔选择9个视野以实现密集成像。在自动对焦选项中，选择启用基于激光的对焦。
6. 根据至少三个样本孔测得的平均孔板底部厚度，在“Autofocus”下调整激光自动对焦参数。相应地调整底部厚度、底部厚度最大变化值、相邻孔最大变化值、孔内最大变化值以及孔板最大变化值。
7. 在“Wavelengths”中，将波长数量设为3。对于第一个照明通道，选择DAPI。在阴影校正中，选择“Auto Correction for FL”（图2B）。
8. 找到图像后，将初始曝光时间（ms）设为20–30。观察捕获的图像，并持续调整曝光时间，以获得适中的荧光强度而不发生过曝，同时将位深度设为16（图2A）。
9. 选择带z偏移的激光进行对焦调整。如果对焦不清晰，勾选使用Z栈（Use Z stack），点击“Calculate Offset”，并选择合适的焦距。勾选数字共焦（info），并将增强锐度和降低噪声的调整参数均设为0.200。
  注意：如果图像曝光或清晰度不理想，应调整曝光并重新计算偏移参数。
10. 对于第二个照明通道，选择Cy3。遵循与步骤2.1.7–2.1.9相同的设置。
11. 对于第三个照明通道，选择TL 25。遵循与步骤2.1.7–2.1.9相同的设置。
  注意：应根据通道设置阴影校正，TL 25通道应选择Auto Correction for TL。在“Wavelengths”中，TL通道必须设置用于细胞定位和形态学观察。
12. 在“Run”选项卡中，按照命名规范命名孔板：孔板名称-细胞类型-实验编号-日期-物镜放大倍数-成像类型。在“Description”下确认与成像通道相关的参数。
13. 点击“Acquire Plate”开始成像。成像完成后，依次关闭软件、仪器和计算机。
  注意：此后计算机仅可用于图像导出、数据处理和结果分析
成像操作标准与要求
1. 将视野中心对准孔中央，以避免边缘效应（图1A）。在设置成像参数时，使用荧光强度最高的阳性对照作为参考。此外，在对焦时，应选择单层细胞、清洁且无碎片的视野区域。
2. 对于相机，应严格控制像素值低于60000（最大值为65535），以防止饱和导致信息永久丢失。若出现饱和亮斑或区域，应缩短曝光时间。同时，曝光时间也不宜过短，否则噪声将主导图像。
3. 对于弱荧光信号，应优先略微增加曝光时间，而非强制提高参数，以避免光漂白引起的不可逆损伤。
  注意：对于明场成像，这些原则可适当放宽，但核心仍应关注信号完整性与样本保护。
4. 确保样本边缘轮廓清晰可辨，内部细微结构（如颗粒、纤维、细胞器）具有明确纹理而非模糊，背景散射光分布均匀，无局部亮斑或模糊光晕。严格避免过度对焦和对焦不足。
5. 确保包含正常组、阳性组、阴性组和实验组，且每个处理组至少有3个平行孔。建议将平行孔垂直排列。

3. 图像处理与分析

注意：本文档概述了仪器配套软件提供的三种图像处理方法，这些方法均适用于本研究中使用的染色方案。尽管这些方法在识别的基本原理上相同，但在具体的处理技术和数据结果类型上存在差异。相同的图像处理工作流程如下：打开文件 → 使用相应的处理方法加载原始图像 → 设置适当的通道参数 → 生成掩膜（Mask） → 在“测量（Measure）”中设置测量数据类型 → 运行分析 → 观察结果 → 导出数据。

打开设备配套的分析软件 → 查看“板” → 选择板。
在日期视图中，选择孔板布局，并从阳性组中选择一个视野作为参考。
在“运行分析”下，选择相应的处理程序，设置图像处理参数或导出图像。
设置并保存参数后，根据参数设置对象选择“在所有孔上运行”/“在选定区域运行”/“在显示的位点上运行”。
计算机完成数据处理后，在“测量”选项卡下，于“分析”中选择相应的数据处理程序，并在“测量”中选择不同的测量结果以检查数据。
点击“打开日志”开始导出数据。为三种图像处理方法在参数设置中设置以下详细信息：
1. 图像处理方法一：多波长细胞评分
  1. 选择“多波长细胞评分”程序并配置设置。设置波长数量。算法选择标准。
  2. 根据PI染色结果设置所有细胞核的识别参数。默认W1源图像为DAPI通道。
  3. 根据待识别单个物体的大小，将“近似最小宽度”设为8–10 µm，“近似最大宽度”设为30–35 µm。
  4. 将“高于局部背景的强度”设为2,000–10,000灰度级。使用“预览”功能测试并根据识别结果调整设置。
  5. 根据Hoechst 33342染色结果设置W2参数。为此通道命名。W2源图像为Cy3。
  6. 在“染色区域”中，将该通道染色的区域选为“细胞核”。后续设置参照步骤3.6.1.3–3.6.1.4。在“配置摘要日志”或“配置数据日志（细胞）”中，根据所需的结果参数选择相应的参数配置。
    注意：通常使用“配置摘要日志”来设置所需的数据类型，而当需要对单个细胞进行特殊标记时使用“配置数据日志（细胞）”。
  7. 执行测试运行以观察识别效果。若对识别结果满意，则保存设置。
2. 图像处理方法二：活-死细胞分析
  1. 选择“活-死细胞”程序并开始配置设置。依次设置波长1参数和波长2参数。
  2. 在波长1参数下，将波长1源设为DAPI。默认算法为“标准”。
  3. 根据染色条件，将“染色细胞类型”设为“所有细胞”，“染色区域”设为“细胞核”。使用与多波长细胞评分方法相同的设置来设定“近似最小宽度”、“近似最大宽度”以及“高于局部背景的强度”。
  4. 勾选“分割接触对象”并使用“预览”进行测试。
  5. 在波长2参数下，将波长2源设为Cy3。
  6. 根据具体染色情况，将“染色细胞类型”设为“死亡”，“染色区域”设为“细胞核”。使用与多波长细胞评分方法相同的设置来设定“近似最小宽度”、“近似最大宽度”以及“高于局部背景的强度”。
  7. 点击“配置摘要日志”，并根据所需的数据类型选择参数配置。执行测试运行以观察识别效果。若对识别结果满意，则保存设置。
3. 图像处理方法三：开发者模式CME
  1. 选择“自定义模块（CME）”程序并开始配置设置。设置图像名称和通道。
    注意：为便于后续参数设置，通常将其设置为成像时使用的通道名称。
  2. 在“查找对象”中，打开“简单阈值”以设置整个集合的识别。
  3. 将“源”与图像名称对应。根据16位灰度值范围，在“低阈值”处填写0，“高阈值”处填写65535。
  4. 在“结果”中命名处理结果，应用并观察标记情况。在“查找对象”中打开“查找斑点”以生成掩膜结果。
  5. 将“源”与图像名称对应，如同“简单阈值”设置。根据多波长细胞评分设置，设定“近似最小宽度”、“近似最大宽度”以及“高于局部背景的强度”。
  6. 在“结果”中命名处理结果，应用并观察标记结果。对于“查找斑点”的识别结果，使用“修改对象”工具进行过滤、生长、收缩和反转操作。
  7. 在“测量”下，设置“已修改”。在“测量输入”中，输入标准面积值为1，并勾选“创建对象叠加”。
  8. 在“待测对象”中，选择“对象掩膜”中标记对象的来源，以及“待测图像”中待测量的源图像。根据所需的处理结果参数选择相应的“测量名称”，应用并观察参数识别结果。
  9. 确认参数设置后，保存配置。
4. 通用方法：ImageJ
  注意：使用ImageJ方法分析荧光图像¹⁹，然后与本仪器的三种方法进行比较分析。
  1. 打开ImageJ软件。图像导入：文件 → 打开 → 选择待分析的原始灰度图像。
  2. 将图像转换为8位：图像 → 类型 → 8位。灰度值识别：图像 → 调整 → 阈值 → 默认，红色 → 勾选“暗背景” → 设置 → 确定。
    注意：若红色区域识别效果不理想，可将“默认”替换为ImageJ内置的其他16种识别模型之一，或调整对话框中的滑块。
  3. 设置参数：分析 → 设置测量值。在弹出的对话框中，勾选面积、平均灰度值、积分密度、限定于阈值、显示标签，默认重定向为“无”，并输入小数位数为2（0-9）。点击确定。
  4. 分析识别结果：分析 → 测量。保存结果：在弹出的结果对话框中，文件 → 另存为，并选择保存位置。
图像导出
1. 选择一个高质量的阳性孔视野作为参考标准。
  注意：基本质量要求包括真实性、准确对焦、合适曝光（16位）和适当对比度（信噪比越高越好）。高质量要求包括特征清晰、对比明显、实用性强、形态变化直观以及重点突出。
2. 在“运行分析”下，于“分析”部分选择ExportPro，并开始“运行设置”进行分析。在“选择输出选项”中，根据图像需求选择“单通道”、“彩色叠加”、“缩小图像”（可选）和“比例尺”（可选）。
3. 为每个视野选择要导出的荧光通道图像。在“单通道”中，为每个通道选择颜色，例如DAPI通道为蓝色，TL通道为单色。
4. 在“彩色叠加”中，依次选择对应于明场、红色、蓝色和绿色的通道（选择彩色叠加的颜色波长）。将“数量”设为100；观察预览图像并接受预览结果。
5. 在输出中，选择导出图像将存储的文件夹（导出到文件夹）。开始运行。
  注意：同一批次的图像不得分开导出；一批图像指的是在完全一致的实验条件下获得的四个核心样本的图像集合：阴性对照、阳性对照、基础对照组和目标实验组。
图像处理方法比较
1. 选择9个视野，将传统人工计数活细胞和死细胞的方法与多波长细胞评分、活-死细胞分析、CME和ImageJ方法在活细胞数、死细胞数及死/活细胞比例方面的计数结果进行比较。使用GraphPad Prism 10.1版进行单因素方差分析，并辅以Tukey多重比较检验，分析差异。
2. 选择81个视野，比较多波长细胞评分、活-死细胞分析、CME和ImageJ方法在细胞计数、面积和强度方面的差异。使用GraphPad Prism 10.1版进行单因素方差分析，并辅以Tukey多重比较检验，分析差异。
  注意：细胞培养和染色实验必须在生物安全柜内进行。废液、枪头及其他实验废弃物应按照实验室规定处理。确保实验全程充分防护。

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结果

标准化制备对成像质量的影响

配置了培养板参数，以确保仪器能够可靠地定位细胞图像层。将样品制备成中等汇合度的单层细胞，有助于在不同物镜放大倍数下实现图像聚焦，并提高图像识别和定量分析的效果（图1）。

图像计算方法功能的比较

采用PI/Hoechst 33342双染法区分活细胞与死细胞。多波长细胞评分法、活-死细胞分析法和CME方法通过基于荧光强度和目标大小识别目标成功处理了这些图像，而ImageJ则基于灰度值识别目标。这些方法获得的标记结果总体上具有可比性（图3A–E）。

多波长细胞评分法需要进行细胞核染色以识别所有细胞（图4A）。该方法可处...

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讨论

例如，采用PI与Hoechst双染法检测细胞活力时，高内涵仪器可通过内置的算法模块，快速、高通量地计算同一批次中的细胞活力。该方法具有多种优势，包括样本用量少、成本低、对细胞损伤小、荧光漂白弱、抗淬灭性强，以及能够获取多张图像。此外，对96孔板进行成像通常仅需30–45分钟²⁰。

在实验方案中，为确保成像质量，请关注以下步骤：首先，确保培养板的细胞密度适宜，避免密度过高导致图像中细胞过满，或密度过低导致染色和洗涤过程中细胞被冲走。其次，充分洗涤染料，防止残留染料影响成像效果。对于贴附性较弱的细胞，在染色前后添加或移除液体时应轻柔缓慢操作，避免垂直加液；应沿孔壁加液，以防止视野中心区域细胞脱落，并在活率检测时特别注意死细胞的脱离。必要时可考虑对样品板进行离心，以减少实验误差。第三，选择合适的曝光时间：曝光时间过长会增加整体成像时间，可能错过检测窗口，并可能导致部分细胞过曝或背景被误识别；曝光时间过短则可能导致图像信息不完整，丢失某些特征性细节。

如果在成像过程中无法获得清晰的图像，...

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披露

所有作者声明不存在利益冲突。在翻译稿件过程中，智谱AI仅用于翻译，未用于生成研究数据、实验结果或核心学术内容。作者对稿件内容承担全部责任。

致谢

作者感谢成都中医药大学校级基金提供的支持。作者感谢MPRC2022034项目资助的支持。该资金用于开发一种三维动态成像方法，以研究二陈汤治疗单纯性肥胖小鼠过程中肠道菌群的变化。作者感谢成都中医药大学中医药创新研究院和交叉科学研究所提供的研究平台。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	Labigic Technology Co., Ltd.	MCT-001-150
1000 µL 吸头	Labigic Technology Co., Ltd.	35423003E
15 mL 离心管	Labigic Technology Co., Ltd.	CT-002-15A
2.5 µL 吸头	青岛海尔生物医疗股份有限公司	B10T
200 µL 吸头	Labigic Technology Co., Ltd.	T-001-200
50 mL 离心管	Labigic Technology Co., Ltd.	CT-002-50A
96孔细胞培养板	康宁公司	3599
可调式单通道移液器，0.1–2.5 μL	Eppendorf SE	3120000216
可调式单通道移液器，100–1000 μL	Eppendorf SE	3120000267
可调式单通道移液器，20–200 μL	Eppendorf SE	3120000259
可调式单通道移液器，2–20 μL	Eppendorf SE	3120000232
细胞培养皿	康宁公司	430167
冻存管	Labigic Technology Co., Ltd.	BS-20-ST
二甲基亚砜（DMSO）	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	D8371
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies Limited	11966-025	本研究中，完全DMEM培养基的配制成分为10% FBS、1%青霉素-链霉素溶液和89% DMEM。
ESCO CelCulture CO₂ 培养箱	Esco Micro Pte. Ltd.	CCL-170B-8
胎牛血清（FBS，超纯）	普罗赛尔生命科学 & 技术有限公司	164210-50
Hoechst 33342 荧光染料	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	B8040
HT22细胞	普罗赛尔生命科学 & 技术有限公司	CL-0697
ImageJ	美国国立卫生研究院		ImageJ 是本文中使用的一种图像处理软件。
ImageXpress Micro Confocal 高内涵成像系统	Molecular Devices, LLC	ImageXpress Micro Confocal	在文稿中使用 "高内涵成像系统" 作为仪器名称的替代。
低速冷冻离心机	湖南湘仪实验室仪器开发有限公司	L530R
MetaXpress 高内涵成像采集与分析软件	Molecular Devices, LLC		该软件是ImageXpress的配套软件® 微型共聚焦高内涵成像系统。在文稿中， "设备附带的分析软件" 指此软件。
OptiMair 垂直层流洁净工作台	Esco Micro Pte. Ltd.	ACB-4E1
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging Inc.	PM996
PBS	上海宇淳生物科技有限公司	YC-5013
青霉素-链霉素溶液	普罗赛生命科学 & 技术有限公司	PB180120
碘化丙啶溶液（PI）	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	C0080
胰蛋白酶-EDTA 溶液	BasalMedia Technology Co.,Ltd.	S310KJ

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