一种用于时间分辨测量小胶质细胞中tau清除率的分裂路西法拉酶补体检测

摘要

我们描述了一种灵敏、时间分辨的定量平台，用于利用基于微板的发光系统测量人类诱导多能干细胞（iPSC）来源小胶质细胞中细胞外tau的清除情况。该方法使得在微孔格式中灵敏地检测tau降解动力学，从而在各种实验条件下实现高通量的tau处理。

摘要

作为中枢神经系统的驻留免疫细胞，小胶质细胞是大脑稳态的核心调节者，也是神经退行性疾病的关键介质。这些细胞持续调查神经环境，并在识别、内化和降解细胞外底物（包括病态的Tau等错误折叠和聚集的蛋白质）中发挥关键作用。尽管越来越多的证据表明小胶质细胞与tau清除有关，现有测量tau吸收和降解的方法缺乏足够的时间分辨率和灵敏度，无法完全捕捉这些动态过程。我们开发了一种基于发光的测定法，定量监测人类诱导多能干细胞（iPSC）来源小胶质细胞的tau清除率。该平台利用基于分裂荧光素酶的补体系统，实现活细胞中tau的高度灵敏实时检测，从而精确追踪其细胞内处理。该检测方法可扩展且适应多种细胞类型，提供了一种多功能工具，用于探究神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病）中控制tau的内核溶酶体通路及细胞机制。

引言

Tauopaths，包括阿尔茨海默病（AD），其特征是微管相关蛋白tau在神经回路中聚集和^扩散。胶质细胞越来越被认可为调节tau病动态的因素，包括吸收、降解和传播，3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。理解胶质细胞如何促成陶氏病变，是解决关键疾病动态（包括神经炎症和tau扩散）的紧迫问题。在胶质群体中，大脑的常驻吞噬细胞小胶质具有独特的位置来调节tau清除。

尽管迫切需要阐明小胶质中tau处理机制，但该领域在现有检测的分辨率和通量方面仍有限。关于tau内吞、细胞内运输和细胞清除的关键问题仍未解决。这些步骤代表一个机制上不同的过程：摄取指的是细胞外tau在质膜内化;运输包括通过内体、溶酶体及其他细胞内区室分选和运输内吞Tau;降解则表示Tau蛋白酶的分解，主要通过溶酶体和蛋白酶体途径实现。虽然这些步骤对细胞外tau处理是顺序的，因为内化的tau必须通过细胞内的区室才能到达降解机制，但它们是独立调控的，某一实验扰动可能只影响某一步而不改变其他步骤。例如，细胞内tau信号的降低可能反映摄取受损、偏离降解区室或降解加剧。解决这些过程需要新的检测平台，能够检测蛋白质存在，并结合现有测量方法来确定蛋白质随时间的命运。

目前解决tau内部化和降解的方法依赖免疫细胞化学、流式细胞术、西方印迹和荧光标记方法，以定量tau物种13,14,15,16,17,18的摄取、亚细胞定位和细胞内加工.然而，这些方法在蛋白质清除动力学研究中都存在根本性局限性。免疫细胞化学和西方印迹检测缺乏检测低丰度tau物种的灵敏度，且劳动强度较大。流式细胞术和荧光测定法无法忠实报告蛋白质清除率，因为荧光团可能在共轭蛋白被降解后仍存在，从而使荧光信号与目标蛋白的实际命运脱钩。这些约束共同造成了关键缺口，目前没有任何方法能同时提供定量追踪tau净空动态所需的灵敏度、时间分辨率和可扩展性。因此，理解小胶质细胞tau处理动力学的一个重大障碍是缺乏定量、时间解析、高通量的活细胞tau清除方法。

为解决缺乏定量平台监测活tau动态的问题，我们开发了一种灵敏的发光检测法，可用于检测细胞内tau蛋白动态。该方法采用基于分裂荧光素酶的互补系统，将一个小肽标签（高亲和二元技术，HiBiT）与tau融合，从而实现活细胞中的动力学测量。当与其互补结合伙伴（大型二元技术，LgBiT）相互作用时，标记的蛋白会重构活性荧光素酶，产生定量的生物发光信号20,21,22。该发光信号直接且灵敏地读取蛋白质丰度，使细胞内水平随时间变化的动态追踪成为可能。因此，发光可以作为蛋白质存在或缺失的有力报告，如细胞内降解的情况。该平台共同实现了tau处理的精确、时间分辨测量，并为蛋白质更新的研究提供了广泛适用的策略。

方案

所有细胞实验均在马萨诸塞大学阿默斯特分校环境与健康服务部门批准的生物安全二级实验室进行。

1. 表达、纯化及内毒素去除Tau-SLP蛋白

1. 将分裂荧光素酶肽或SLP标签（VSGWRLFKKIS）附加到Tau构造体上，使用标准克隆方法（如Gibson assembly²³）创建带标记构造体（Tau-SLP）。
   注意：分离荧光素酶肽标签的互补在C端、N端或^{2N4R Tau 24}的内部结构域时，会产生强健信号。
2. 使用上述方法表达和纯化Tau-SLP，25,26，并利用SDS-PAGE和免疫印迹法确保纯度。
3. 用于小胶质细胞时，遵循已发表的去除方法，在Tau-SLP纯化后去除细菌内毒素，以限制混杂反应性²⁷。
4. 使用标准双碳酸测定法（BCA）或布拉德福德测定法^28,29定量Tau-SLP蛋白浓度。
5. 如有需要，可按照上述方案进行Tau-SLP聚合。
6. 按照制造商说明，使用市售荧光素酶底物和补体试剂生成标准曲线，验证Tau-SLP的功能性发光效果（见 材料表）。

2. iPSC衍生的小胶质细胞（iTF-Microglia）培养

1. 在适当的培养基下，5%_CO2 中培养小胶质细胞，温度为37°C。
2. 利用经过验证的³⁰ 号方案（见 材料表），分化一个含有六个多环素诱导转录因子的诱导多能干细胞系（iPSC），生成类小胶质细胞（诱导转录因子小胶质样或iTF-Microglia）。
   注意：该检测方法不限于单转青叶小胶质细胞，可用于任何粘附细胞系。在与其他细胞系合作时，可能需要优化清除时间。

3. Tau清除测定

1. 在24孔板中，将密度为1 x 10⁵ 个细胞的每孔3组，使用培养基（250微升），在37°C和5%_CO2 下培养一夜（见图1A）。
2. 取出培养基，用PBS（250微升）洗细胞一次，然后更换为250微升培养基。
3. 要时间性测量Tau-SLP净化，需错开暴露细胞以Tau-SLP方式，使所有孔同时收获，且仅在清除时间上有所不同。例如，对于0 h、2 h和4 h的清除基，先向4 h组加入含100 nM的Tau-SLP培养基，再在1小时后加入2 h组，最后1小时后加入0 h组（计时建议见 图1B ）。最终内部化期结束后，所有井都经历了相同的Tau-SLP暴露期，但仅在净化时间上有所不同（见图1B）。
4. 包括未进行Tau-SLP背景减除处理的井（图1C）。
5. 内化期结束时，去除含Tau-SLP的培养基。用PBS清洗细胞三次，去除细胞外Tau-SLP，并替换为无Tau-SLP培养基。
6. 在指定的清除期内孵育细胞（图1A）。0小时清除组在内化期结束后立即收获，代表清除阶段开始时内吞的Tau-SLP总量。
7. 在所有清除时间点后，从井中取出培养基，并用250μLPBS洗涤。
8. 用250微升胰蛋白酶-EDTA 0.25%在37°C下处理每口井5分钟。 这一步骤去除表面束缚的tau，以确保发光反射内化的Tau-SLP。用250微升胰蛋白酶抑制剂（5 mg/mL）中和每个井。
9. 将每个油井收集到一个标记适当的1.5毫升微离心管和离心沉淀中（500 x g，5分钟）。
10. 准备适量的含荧光素酶底物和补体组分的裂解缓冲液（见 材料表;50 μL x # 孔数 + 10%）。
11. 用吸液管取出每个上清液，并将细胞沉淀重新悬浮在含有荧光素酶底物和互补成分的50微升溶解缓冲液中。这将产生分裂荧光素酶互补复合物并产生发光（见图1D）。
12. 将溶解细胞转移到白色半体积96孔板上。
13. 在读数前，在室温（~23°C）下，用微板读器进行轨道振动10秒，以保证细胞颗粒完全裂解。
14. 通过先减去未暴露于Tau-SLP阱中获得的平均发光值，确定归一化的Tau-SLP丰度。将每个值归一化为0小时净空组的平均背景减去信号。
15. 图对Tau-SLP丰度归一化为清除时间的函数。发光逐渐减少表示细胞内Tau-SLP丰度下降，被解释为Tau-SLP清除率，而稳定的发光值则表示清除受损或延迟。计算出的清除率百分比为：% 清除率 = [1 − （RLUt / RLUt = 0）] × 100。

结果

利用这种灵敏的发光检测法，可以在同步摄取期后监测人类iPSC来源小胶质细胞中细胞内Tau-SLP丰度的随时间变化。Tau-SLP洗脱后，发光度持续下降，符合细胞内Tau-SLP清除的趋势。该平台足够灵敏，能够检测小胶质细胞处理单体和纤维状Tau-SLP物种的差异。单体Tau-SLP在iTF-小胶质细胞中60分钟内完全清除，而纤维型Tau-SLP则持续超过240分钟（见图2A）。此外，我们对突变tau（如N279K）进行了检测，评估清除动力学，发现TauN279K-SLP在仅15分钟的短期清除时间点内表现出显著降低的清除动力学（见图2B）。这些结果表明，观察到的降解可能仅因该检测的高灵敏度而显现。我们利用小分子L-白氨酸甲酯（LLOMe）进行了Tau-SLP降解实验，以确认溶酶体的参与。LLOMe是一种卡特蛋白酶C底物，能够渗透溶酶体膜，破坏溶酶体活性³¹。使用LLOMe处理后，我们观察到t=0时Tau-SLP的稳态水平显著增加（见图3A），降解速率显著降低（见图3B），60分钟清除期后Tau-SLP含量增加4倍。最后，我们对iPSC来源神经元进行了Tau-SLP清除检测，以确认不同细胞类型的检测兼容性。我们发现，iPSC来源的神经元在Tau-SLP的单体型（图4A）和纤维型态（图4B）的清除动力学均降低。最显著的是，Tau-SLP纤维水平在240分钟清除期内保持稳定在~100%，而同期，tTF-小胶质纤维的Tau-SLP纤维水平已降至50%以下。这些结果表明，我们基于分裂荧光素酶的补体平台能够稳健可靠地检测Tau-SLP的细胞内内溶酶体清除，并展示了高度适应性的检测设计，可应用于多种其他蛋白质或细胞类型。

图1：Tau-SLP清除测试的代表性实验设计。 （A）用于本检测的iTF-小胶质细胞代表性明场图像（尺度条=100微米） （B）人类小胶质细胞（iTF-小胶质细胞）以错开方式暴露于重组2N4R-SLP，从而实现基于发光的稳健检测。经过1小时的培养后，通过培养基交换去除细胞外tau，并用PBS洗涤细胞。细胞在采集前的清除期（0小时、2小时、4小时）被保存在基础培养基中。在终点处，细胞被裂解，并测量发光度。（C）拟议的板设计用于比较单体与纤维体降解的Tau-SLP净空。（D） Tau-SLP蛋白被细胞内吞并引导至溶酶体降解。添加LgBiT可通过互补和产生发光定量读取细胞内剩余的Tau-SLP量。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：iTF-小胶质细胞清除细胞外Tau-SLP。 （A）iTF-小胶质细胞暴露于单体Tau-SLP（100nM）或纤维型Tau-SLP（50nM），样本被归一化至各自的初始摄取（t = 0;100%），且未暴露于Tau-SLP（0%）的细胞（平均分± SD;n=9，三次独立分化）。（B） iTF-小胶质细胞与单体Tau-SLP或TauN279K-SLP（100nM）一起孵育，样本对各自初始摄取（t = 0;100%）和未暴露于Tau-SLP的细胞（0%）进行归一化（平均±标准差; n ≥ 7，由三个独立的微分得到;∗ p < 0.05，使用未配对的韦尔奇t检验）。数据转载自Shultz等，2025年第²⁴页，并采用知识共享署名（CC BY 4.0）许可协议。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：溶酶体抑制会损害Tau-SLP清除率。 （A） 使用1mM溶酶体抑制剂L-白酰L-亮氨酸甲基酯（LLOMe）治疗24小时，增加H4神经胶质瘤细胞的初始Tau-SLP摄取（t=0）（平均值±SD;n=9个独立培养;∗ p <0.05，使用未配对Welch's检验）。（B） 使用LLOMe（1mM）治疗24小时后，60分钟清除时间（t = 60分钟）后，与载体（DMSO）相比，正常化Tau-SLP RLU百分比增加。发光信号被归一化至各自的初始摄取水平（100%）及未暴露于Tau-SLP的细胞（0%）（平均分±标准差;n = 9个独立培养;∗∗∗∗< p 为0.0001 ，<∗ p为0.05，使用未配对的韦尔奇t检验）。数据转载自Shultz等，2025年第²⁴页，并采用知识共享署名（CC BY 4.0）许可协议。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：iTF-小胶质细胞和i神经元在Tau-SLP清除率上存在差异。 （A） iTF-小胶质细胞或i神经元与单体Tau-SLP（100nM）孵育，样本对初始摄取（t=0;100%）和未暴露于Tau-SLP（0%）的细胞进行规范化（平均±SD;n≥6，来自两至三次独立分化;∗∗ p < 0.01，∗∗∗∗ p < 0.0001，使用双向方差分析;时间： F（1， 28） = 7.489，p = 0.0107;细胞类型： F（1， 28） = 46.61，p < 0.0001;交互作用： F（1， 28） = 3.229，p = 0.0831; Sidak的多重比较检验（图中显示 p 值）和t=0值作为参考，但统计分析中排除了。（b） iTF-小胶质细胞或i神经元与纤维型Tau-SLP（50nM）一起孵育，样本对初始摄取（t=0;100%）和未暴露于Tau-SLP（0%）的细胞进行归一化（平均±标准差;n≥6，来自两至三次独立分化;∗∗ p < 0.01，∗∗∗∗ p p < 0.0001，使用双因子方差分析;时间： F（1， 26） = 0.3888， p = 0.5384;单元类型： F（1， 26） = 43.09，p < 0.0001;交互作用： F（1， 26） = 1.209，p = 0.2816; Sidak的多重比较检验（图中显示 p 值）和t=0值作为参考，但统计分析中排除了。数据转载自Shultz等，2025年第²⁴页，并采用知识共享署名（CC BY 4.0）许可协议。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

该检测方法提供了一个可扩展且定量的平台，以高灵敏度和时间分辨率测量小胶质细胞外Tau-SLP清除率。与传统基于成像的方法不同，后者通常需要繁琐的样本处理，且在通量和时间采样方面受限，这种基于发光的系统实现了微板格式中直接、群体级的tau处理量化。所得读数为暴露于细胞外Tau后Tau-SLP通关的定量测量。由于测量可以跨多个时间点反复获得，且潜伏期更长，该测定能够实现高通量、动力学分辨的tau摄取和清除动力学分析。此外，发光随时间的变化与细胞内Tau-SLP丰度的变化一致，但无法区分运输、降解或分泌，除非采用互补方法。尽管Tau-SLP标记在我们的配套研究中并未显著改变tau的摄取或聚集，^但外源性标签可能影响其他蛋白质的行为。因此，检测结果应采用正交方法补充，并尽可能与无标记tau制剂进行比较。另一个限制是该检测使用重组的Tau-SLP物种，而非内源性tau或患者来源的病理tau聚集体。虽然重组2N4R tau提供了可重复的实验底物，但它并不能完全复现从人类患者大脑分离出的tau物种的内源性异质性（即翻译后修饰）。存在许多用于体外磷酸化重组tau蛋白的方案，这些方案可以轻松地纳入该工作流程。该平台也可用于研究内源性tau;这需要通过基因工程在tau位点（MAPT）基因座引入SLP标签序列。

重要的是，信号还原为降解的解释依赖于通过胰蛋白酶化或等效剥离步骤有效去除细胞外和表面结合的tau。如果未能有效去除，可能会出现假阴性。也可能出现表观信号损失，这被解读为τ磷降解的假阳性。这可能源于细胞脱离或死亡、Tau-SLP的分泌，或蛋白水解切割，将SLP与tau分离，但不降解蛋白质。因此，发光的减少应被解释为细胞内Tau-SLP丰度的减少，而非溶酶体降解的直接测量。为了更明确地将信号变化归因于溶酶体降解，建议采用正交验证策略。这些方法可能包括对溶酶体功能的药理扰动，如巴非洛霉素A1或LLOMe治疗（见图3），以及脉冲追踪实验设计以解析摄取与降解动力学。

该检测法的灵活性使其非常适合探究控制tau摄取、细胞内运输和降解的机制，以及筛选人类细胞系统中tau清除的药理或遗传调节因子。尽管该平台已在iPSC来源的小胶质细胞中得到了验证，但该平台能够轻松适应其他细胞类型（见图4），使其能够广泛应用于tau生物学和神经退行性疾病模型，包括阿尔茨海默病及其他原发性和继发性陶氏症。由于该检测依赖于Tau-SLP的细胞外暴露和基于发光的检测，因此应能轻松适应星形胶质细胞、寡突胶质细胞或常用细胞系，尽管可能需要优化摄取条件。总体而言，这一方法为剖析参与蛋白质稳态的细胞通路和推进对神经退行性疾病过程的机制理解提供了有力工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	Thermo Scientific	A1110501
锥形无菌聚丙烯离心管	Fisher Scientific	12-565-268
Corning Matrigel 生长因子减少 (GFR) 基膜基质，无酚红，无 LDEV	Corning	356231
DMEM/F-12, HEPES	Thermo Scientific	11330057
多西环素	Clontech	631311
DPBS	Thermo Scientific	14-190-250
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061
绘图软件	GraphPad Prism（或类似产品）	n/a
人 GM-CSF	Thermo Scientific	300-03
KnockOut DMEM	Thermo Scientific	10829018
发光板读取仪	SpectraMax i3x（或类似产品）- Molecular Devices	n/a
微离心管	Fisher Scientific	02-682-002
96 孔板，PS，半区域，白色	Greiner	675075
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
Nano-Glo HiBiT 裂解检测系统	Promega	N3030
Poly-L-Lysine hydrobromide	Fisher Scientific	ICN15017750
重组人 IL-34	Thermo Scientific	200-34
重组人 M-CSF	Thermo Scientific	300-25
重组人 TGF-β1	Thermo Scientific	100-21C
表面处理无菌组织培养板	Fisher Scientific	FB012927
Tau-HiBiT 蛋白	内部	n/a	带 VSGWRLFKKIS 肽标签的 Tau 蛋白
胰蛋白酶抑制剂	Sigma Aldrich	T9128
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Scientific	5-200-072
Y-27632 二盐酸盐	Bio-techne	1254