一种高效的饲养和显微注射方案，用于稳定蝇——石化石化口径（Stomoxys calcitrans）的基因改造

Summary

该方案描述了一种可靠的胚胎显微注射方法，用于将外来遗传物质整合进稳定的果蝇基因组，一种用于监测注射后胚胎发育的荧光筛选系统，以及一种由活性炭补充的卵黄琼脂组成的幼虫育育底物，该基质接种了 大肠杆菌 ，支持卵到成虫的发育。

Abstract

稳定蝇是以家畜、伴侣动物和人类为食的害虫，分布于除南极洲外的所有大陆。雄性和雌性成年动物的痛苦咬伤会引发家畜的压力相关行为，导致减重和生产者遭受重大经济损失。雄性和雌性稳定蝇都是强制性吸血者，这对无菌昆虫技术及其他需要大量释放雄蝇的害虫管理策略构成了挑战。目前稳定的苍蝇害虫管理策略往往无法有效控制苍蝇种群。尽管已开发出多种用于引入外源遗传物质或诱导基因敲除的遗传操作方法，用于蚊子、 果蝇及其他模式昆虫群，但稳定果蝇的遗传转化方法仍然有限。该方案描述了一种可靠且改进的方法，利用piggyBac转座酶的超活跃变体和一种支持胚胎显微注射后幼体恢复、孵化、摄食及荧光筛查的新型固体幼虫育种，将外来遗传物质引入稳定蝇中。

Introduction

稳定蝇（Stomoxys calcitrans L.， 1758）是经济上重要的害虫和^畜牧病害传播媒介^，分布遍及全球。综合害虫管理（IPM）策略常常无法有效控制稳定的蝇类种群 ^2,3 导致仅美国每年损失估计超过20亿美元。此外，欧洲稳定的蝇类种群中已有杀虫剂抗性记录^{，美国也有报道。}因此，遗传控制方法如无菌昆虫技术（SIT）和基因驱动系统成为传统IPM项目的宝贵补充。

此前在稳定蝇中开发遗传控制方法的努力，包括用于SIT的遗传性别分辨株，主要依赖选择性育种和辐射诱导^易位7,8。这些方法劳动密集型，且仅限于非转基因改造。随后，O'Brochta等人⁹ 证明使用赫尔墨斯转座酶系统能够将转基因整合进 S. calcitrans;然而，该方案转化效率较低，约有0.11%的注射胚胎产生转基因后代，且在外源启动子⁹的控制下，增强绿色荧光蛋白（eGFP）标记的表达较弱。

其他遗传操作方法，包括CRISPR-Cas系统，尚未在稳定蝇中广泛应用，部分原因是难以穿透稳定蝇胚胎的韧性绒毛膜。坚硬的外绒毛膜与其他有肌肉蝇类相似^10,11。尝试用石英针通过绒毛膜注射或用双面胶带去除绒毛膜均未成功，因此需要使用氧化溶液（3%次氯酸钠，NaOCl）处理，以降低卵孵化率。

稳定的蝇类可在实验室条件下长期维持，幼虫阶段通常在发酵纤维素基质中饲养，如木屑、麦麸或稻草，并补充氮源，包括小牛蛋白补充剂或鱼片¹²。然而，这些底物在用于培养微注射胚胎时存在若干缺点。它们的不透明性和高自发荧光使得孵化并钻入基底后识别GFP阳性幼虫变得困难。此外，虽然幼虫生存需要一定的细菌存在¹³，但发酵培养基会引入不可预测的细菌和真菌群落，可能在孵化前损伤或消耗胚胎。这些限制阻碍了使用上述注射和饲^{养方法恢复}转化幼虫的困难，凸显了需要更可靠的注射方案，同时允许在发育过程中进行荧光筛查。

本书呈现一种可重复的显微注射方案，涵盖转座酶选择、注射方法以及筛选和育基的改进。这些修饰促进了转基因稳定果蝇的开发，应用于包括用于SIT的遗传性别鉴定品系、基因驱动以及CRISPR-Cas介导的基因敲除。关键改进包括在稳定的果蝇热休克蛋白（hsp）83启动子控制下使用超活跃的piggyBac转座酶¹⁴ ，胚胎干燥以减少注射后卵质损失，以及胚胎注射过程中去除胶带和卤碳油。

通过用平坦、含色素的营养琼脂平板替换大肠杆菌草坪，进一步提升了注射胚胎的回收率。这种琼脂制剂有两个主要优势。首先，它为幼虫发育提供了可预测的单基因细菌食物来源。其次，它提供了高对比度、低自发荧光背景，便于观察第一代（G0）幼虫的形态、发育和GFP表达。家蝇和马厩蝇在大肠杆菌接种的卵黄基琼脂平板上正常发育和化蛹^13,15。本文所述的配方将活性炭粉末结合为非反应性、食品安全添加剂，以进一步降低背景荧光。

Protocol

所有实验和操作均经德克萨斯农工大学机构生物安全委员会批准（协议IBC2019-081）。本协议中使用的试剂、化学品和工具列于 材料表中。

1. 饲养蝇以产卵

1. 准备成鸟笼
   1. 将孵化箱温控器温度设定为28°C，在10升的锅中混合3公斤氯化钠与~5升自来水，溶解约50%的盐。
   2. 将这个未盖的盐水盘放置在孵化箱底部，以保持约80%相对湿度。在房间或房间内保持16：8的昼夜循环。
   3. 在昆虫笼底部铺上两层纸巾，并放置一个45毫升一次性调味品杯，装满颗粒状的食糖（见图1A）。
      注意： 纸巾帮助吸收飞斑，糖分则在输血前提供食物来源。
   4. 将一个250毫升的Griffin烧杯装满约100毫升室温自来水，并将一块20厘米×20厘米的黑色棉布（从普通黑色枕套或床单裁剪）放入水中，直到织物湿润。调整黑色织物，使其边缘超出烧杯边缘1-2厘米（见图1B）。
      注意： 这种湿布既能提供液态水，也能为成蝇提供产卵面。如果成虫无法获得水分来源，死亡可能迅速发生。
   5. 将500-1500只稳定的蝇蛹转移到小盘或烧杯中，放入昆虫笼中。将成鸟笼置于潮湿的育育室（步骤1.1.1），并每天监测巢穴化情况。成年牛羽化后，开始每日喂食含柠檬的牛血（第1.2节）。
2. 喂食成蝇
   1. 将最终浓度为10.9 mM的柠檬酸三钠二水合物加入新鲜采集的牛血中，制备柠檬化牛血。
   2. 简短地，将~12.8克柠檬酸盐悬浮在极小体积的去离子水中，并加入当地屠宰场采集的4升血液中。
      注意： 血液容器应配有螺旋盖（例如方形、宽口、4升握把瓶），并在使用前用温肥皂和水彻底清洗。在屠宰场，避免从屠宰动物中采集首~1升牛血，以减少毛发、汗水、污垢及其他凝结剂的污染。
   3. 将含有柠檬的牛血冷冻于200毫升分量中，按需解冻，解冻后将血液冷藏至4°C，保存最长一周。
   4. 每600只苍蝇向每个成年笼子提供~40毫升室温血液。
   5. 血液可以装在调味品容器或烧杯中，并应将折叠的非无菌棉纱布海绵放入血管中以吸血。搅动棉芯直到棉花完全浸透，然后插入笼中。
      注意： 血应从卵巢破裂后24小时起每日更换。
3. 卵子收藏
   1. 一旦发现卵出现在黑色棉布上，取下烧杯中的布，用洗碗瓶将鸡蛋洗入一个~700毫升的浅塑料容器（见图2A）。产卵通常发生在蝇类7-10天大时。
      注意： 检查血杯是否有卵，并收集可能产卵的卵子。
   2. 通过真空过滤在滤纸上收集鸡蛋。方法是将黑色滤纸放入布赫纳漏斗中，施加真空，然后将步骤1.3.1的鸡蛋倒在设置上。
   3. 随后，利用洗涤瓶将鸡蛋转移到分级圆筒或1.7毫升微离心管中，记录采集的鸡蛋体积（见图2B）。
      注意： 避免将卵长时间浸入水中，因为死亡率在浸泡后~10分钟开始增加。
4. 大宗幼虫培养基的制备
   1. 收集散装幼虫培养基材料（图3A），详见 表1。
   2. 在一个1000毫升的烧杯中，加入小牛蛋白补充剂和所有自来水。在室温下过夜补充水分。
   3. 将小麦麸和蛭石加入一个更大的混合容器中。
   4. 经过一夜补水后，彻底搅拌补水后的小牛补剂以打散结块，然后将混合物倒入与麦麸和蛭石的容器中。彻底搅拌至均匀，所有小麦麸都被小牛补充剂浆液覆盖。
   5. 将散装介质转移到覆盖整个容器底部、深度约8厘米的聚丙烯食品储存容器（见图3B）。
   6. 通过收集胚胎，添加~1,000个胚胎（约每2.2升散装培养基中0.2毫升卵子）。在直径90毫米的圆形滤纸上进行真空过滤，然后将带有鸡蛋的滤纸面朝下放在介质箱中央（图3B，C）。
   7. 用~1厘米厚的滤纸覆盖滤纸以保持水分（见图3C），并用一块超大长方形黑色棉布覆盖容器，容器边缘外悬挂5厘米的棉布。
   8. 在食物容器盖子上切一个大洞（直径约12厘米），以便气体交换，然后将盖子扣在介质箱上，同时用黑色棉布夹住容器和盖子（见图3D）。
      注意：它起到密封圈的作用，防止盖子与容器之间的缝隙将第一龄幼虫困在凝结液滴中。
   9. 将完成的培养基箱放入成虫育殖室，直到化蛹并监测幼虫发育（见图4）（化蛹时间约为10天，具体取决于介质温度和幼虫密度）。
      注意： 布料覆盖物应足够细致，以防止一龄幼虫通过，同时又要足够透水，防止介质箱内壁形成冷凝水，避免捕捉并淹死幼虫。
5. 蛹分离
   1. 从蛹箱中取下布料，用勺子或勺子收集蛹。
      注意： 稳定蝇蛹呈不活动的红棕色圆柱体，长4-7毫米，与活动的黄白色幼虫形成对比。蛹通常聚集在容器壁外围或介质箱内潮湿、高处，随着蝇虫从幼虫变为蛹到成虫。
   2. 在盘子上覆盖500-1,500个蛹，深度约1厘米，并按照第1.1节描述放入新的干净笼子中，以繁殖下一代。

图1：成蝇饲养材料。 （A） 成蝇饲养笼，显示蔗糖杯（S）和产卵杯（O）。（B） 用含水的黑棉布制成的产卵杯，布料略超出烧杯边缘。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：卵收集。 （A） 使用洗涤瓶从产卵布上采集卵。（B）通过真空过滤将鸡蛋回收到高对比度滤纸上。 请点击此处查看该图的放大版本。

大宗幼虫培养基材料
试剂	质量 （g）
水	900
小麦麸	230
小牛补充剂	100
蛭石（A4粗）	70
去色粒化溶液材料
解决方案	创作
氧化浴	去离子水中含3%次氯酸钠
洗澡	Triton X-100 0.02% 溶液在去离子水中
冲洗	去离子水
黑琼脂筛查与养殖板材料
试剂	质量 （g）
水	500
蛋黄粉	18
活性炭	4
氯化钠	1

表1：用于散装幼虫培养基的试剂、脱胆液溶液和黑琼脂平板。 用于制备大宗幼虫培养基以维持群体的试剂，以及用于削弱和去除稳定蝇胚胎绒毛膜的溶液配方，以及制备500毫升黑琼脂筛选和育养介质所需的材料。

图3：大宗幼虫培养基的制备。 （A） 用于大宗幼虫培养基制备的材料：小牛蛋白补充剂（CM）、小麦麸（WB）、蛭石（VM）、储存容器（SC）、盖子（L）和织物垫片（FG）。（B）介质成分的彻底混合。（C）将蛋覆盖的滤纸（EP）面朝下放置在介质表面，并覆盖额外的滤材以防止干燥。（D） 在容器与盖子之间安装棉布垫圈。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：幼虫在大宗培养基中的发育。 透明容器便于监测幼虫发育和介质状况。幼虫（L）可见于容器壁、盖子及介质内。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 注射准备：去色粒化和干燥

1. 将湿润的黑色棉布放入烧杯中，按照 步骤1.1.4 的描述，然后转移到成虫笼子中25分钟采集卵。用洗瓶将鸡蛋冲洗到106微米不锈钢筛子上。
   注意： 25分钟的采集期通常可获得约400枚卵。
2. 让胚胎在筛子上再静置30分钟，不受干扰。
3. 胚胎老化期间，准备表 1 “去色化溶液”部分描述的氧化、洗涤和冲洗各150毫升溶液（见图5）。使用足够体积覆盖胚胎，约1厘米的溶液。
4. 将含有胚胎的筛子浸入氧化浴中2分钟，并用巴斯德移液器轻轻搅拌胚胎（见图6A）。
   注意： 反复抽吸和喷洒溶液形成圆形漩涡，有助于将胚胎集中在筛子中心，防止新鲜脱胆液的胚胎附着在筛壁上。
5. 将筛子从氧化浴中取出，敲出多余的溶液。将筛子转移到洗涤液中，通过吸入和分液搅拌2分钟。
6. 将含有胚胎的筛子转移到冲洗溶液中，按照 步骤2.4 的描述搅拌2分钟。将筛子从冲洗液中取出，并用水头冲洗多余的水。
7. 将无菌玻璃盖片放在筛子上，在解剖显微镜下，用细尖尼龙画笔将胚胎（见图6B）从筛子转移到盖片边缘。将胚胎靠近但不接触，较宽的后极朝向盖膜边缘。在移植过程中避免弯曲、扭曲或撕裂胚胎。
8. 准备干燥室，将1升瓶底部涂满100毫升硫酸钙干燥剂，并用橡胶塞封住。
   注意： 平衡24小时后，干燥室通常在23°C时达到<5%的相对湿度。
9. 去除盖玻片上的多余水分，将含有脱绒丝胚胎的盖玻片放在干燥剂上。用橡胶塞重新封好烧瓶，并让胚胎干燥8分钟。
10. 将盖片从干燥室取出，放置在显微镜台上，置于20×物镜下进行显微注射。

图5：去程膜解。 从左到右：不锈钢筛、氧化液、洗涤液和用于胚胎角膜剥茧的冲洗液。次氯酸钠以6%的液体形式保存，避免光照保护;Triton X-100则以10×的液体保存，并在使用前稀释至最终浓度0.02%。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：胚胎脱胆 。（A） 轻微吸取和喷洒溶液会产生涡旋，使胚胎集中在筛子中心，减少与筛壁的附着。（B）冲洗后脱毛膜胚胎从半透明绒毛膜中出。前极（较窄的一端）通常先于后极突出。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 显微注射

1. 从100毫米的玻璃丝毛细管（内径0.7毫米，外径1.0毫米）中拔出石英微注射针，使用 表2中列出的参数。使用前请将针头存放在无尘的地方。
   注意： 也可以使用几何形状相似的硼硅酸盐针。
2. 准备注射缓冲液（0.1% w/v 酚红，磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），pH 7.4），并通过0.22微米注射器过滤器进行滤灭。
3. 通过将各10微克的piggyBac辅助质粒和供体质粒（包含左右piggyBac倒置末端重复序列之间的遗传货物）与4微升注射缓冲液混合，准备20微升注射混合物。用无核酸酶水稀释至最终浓度500 ng/μL。
   注意： 辅助质粒包括3.1 kb的 HSP83 启动子序列，位于 hsp83。 起始密码子和高活跃piggyBac转座酶编码序列。
4. 将注射混合物转移到一个低容量0.20微米的PTFE注射器过滤器中，并将过滤器放入0.5毫升微离心管的开口中（见图7A）。在≥11,000 x g 下离心10分钟，直到所有注射混合物通过过滤器。未使用的注射混合物储存在-20°C。
5. 用微型凝胶装填移液器尖端回填约2微升注射混合物（见图7B）。装弹时避免引入气泡。
   注意： 将显微注射针与胚胎长轴平行，保持水平和垂直角度偏移为零，以最大限度减少撕裂和剪切。
6. 轻轻用针尖敲击玻璃滑套边缘，直到注射混合物流过针尖（见图7C）。
   注意： 逐渐折断针尖，创造最小、最锐利的孔径，同时允许注射混合液流动。
7. 干燥后立即通过后极注入胚胎，注射压力约700 hPa，背压约300 hPa。
8. 轻柔地穿透胚胎，并注射约十分之一的胚胎体积（见图7D–F）。
   注意： 尽量减少针头穿透，以减少玻璃腺膜的干扰，并防止针头拔除时卵质损失。
9. 注射后，将盖片转移到内衬无菌、湿润的90毫米黑色滤纸的培养皿中，并在室温下孵育48小时。
   注意： 所有注射须在产卵后2小时内完成，目标胚胎在合胞期前完成。
10. 每12至16小时检查一次孵化的胚胎。将新孵化的幼虫和玻璃盖片转移到第4节所述的已接种和调制琼脂平板 上。

参数	热量	菲尔	维尔	德尔	拉
价值	825	5	60	150	175

表2： 拉针参数。 用于生成石英微注射针的参数。

图7：胚胎显微注射 。（A） 使用嵌套于0.5 mL微离心管中的注射器过滤器过滤注射混合物。（B）使用凝胶装填移液头将过滤后的注射混合物装入微注射针头。（C）石英微注射针的末端几何形状。（D）针头与胚胎后端对齐。（E）在最小化玻璃膜干扰的同时，穿透胚胎表面。（F）注射约十分之一胚胎体积后拔针。透明度提高表示注浆混合物对卵质的置换。比例尺 = 400微米（D–F） 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 处理过的板材准备

1. 琼脂培养基配方
   1. 准备表1中“黑琼脂筛分和养殖板材料”部分描述的培养基，并在121°C下高压灭菌15分钟。 将琼脂倒入40°C或存放室温后再加热，倒入90毫米培养皿中。
      注意： 倒入前用力旋转，重新悬浮固体颗粒。
2. 板接种
   1. 将24小时的 K12大肠 杆菌培养液稀释至OD600=0.200，浸泡在Luria-Bertani汤中，并向冷却固化琼脂板上滴注200微升。使用无菌玻璃珠或玻璃扩散器均匀涂抹培养物，并让培养板吸收多余水分（图8A、B）。
      注意： 倒入琼脂平板后1个月内使用或丢弃，以确保细菌和幼虫稳定生长。
3. 板式调理
   1. 折叠6×6厘米的黑色滤纸，形成6-10条波纹状纹理，并通过烘烤或高压菌灭菌。将一张无菌波纹滤纸无菌地放在已接种的培养皿上，并用几滴无菌水润湿（见图8C）。
   2. 对未处理、未注射的野生型（WT）一龄幼虫进行表面灭菌，并将10只幼虫转移到湿润的滤纸上。
      注意： 将白天胚胎浸泡在10%漂白剂（0.6% NaOCl）中1分钟，然后用无菌去离子水冲洗2分钟来灭菌。
   3. 在培养皿盖子和本体之间放置一枚90毫米的滤纸，作为密封圈。
   4. 让WT幼虫在玻璃盖片上添加注射胚胎前，先让白天幼虫对板进行24小时的处理（见图8C）。在首次注射胚胎孵化后移除白海燕幼虫。

图8：琼脂平板制备及注射后回收。 （A） 使用无菌玻璃珠对琼脂平板进行OD600 = 0.2大 肠杆 菌培养的接种。（B）胚胎移植前吸收过量表面水分。（C） 在培养皿盖子与本体之间放置90毫米滤纸垫圈。（D）对幼虫在调控琼脂平板上的荧光标记进行筛查。注射后的胚胎会在倒置培养皿盖子内的去离子水饱和90毫米滤纸上回收，孵育48小时后再转移到筛查板上。 请点击此处查看该图的放大版本。

Results

采用该方案，431个稳定的果蝇胚胎被去程膜化，并以 最终浓度500 ng/μL注射piggyBac-Hsp83 供体质粒和Hsp83辅助质粒。 在431个注射胚胎中，18个ZsGreen阳性幼虫（4.2%）和8个ZsGreen阴性幼虫（1.9%）在注射后48-76小时内在黑色碳琼脂平板上孵化（见表3）。总体而言，431个注射胚胎中有26个孵化（6.0%），26个孵化幼虫中有16个存活至成虫（61.5%）。

物种	注射类型	构造	# 注射	ZsGreen（+） L1	ZsGreen（-） L1	ZsGreen（+） 蛹	绿蛹	ZsGreen（+） 成虫	ZsGreen（-）成虫	# 成虫产下ZsGreen（+）后代
石化石心	转座酶插入	Hsp83：hy-pBac（助力，500 ng/uL） Hsp83： zsGreen（供体，500 ng/uL）	226	5	8	5	6	3	6	1
石化石心	转座酶插入	Hsp83：hy-pBac（助力，500 ng/uL） Hsp83： zsGreen（供体，500 ng/uL）	205	13	0	7	0	7	0	5

表3：注入统计。 胚胎显微注射后的生存、转化和恢复率。

在18只ZsGreen阳性G0幼虫中，12只存活至化蛹（66.7%），10只成虫化蛹。6个ZsGreen阳性成体（注射胚胎的1.4%，可育G0幸存者的60%）产生了ZsGreen阳性后代。这些后代（见图9A–E）在撰写时已自我杂交并保持荧光六代。

在8只ZsGreen阴性幼虫中，有6只存活到成虫（75%）。非荧光成体均未产生荧光后代。

图9：转基因果蝇的荧光筛查。 （A）表达ZsGreen的F1幼虫与WT幼虫的比较。（B）通过蛹表皮可见的荧光，支持蛹期转基因筛选。（C，D）在白光（C）和荧光（D）照明下，比较三只表达ZsGreen的幼虫和蛹（左）与三株WT幼虫和蛹（右）。（E）表达ZsGreen的成体转基因F1蝇（左）与WT成蝇（右）。比例杆 = 1毫米（A）、2毫米（B，E）和3毫米（C，D）。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

非模式昆虫物种的遗传转化仍然是节肢动物害虫和媒介遗传控制策略开发和评估的主要瓶颈。

对于稳定的果蝇，这里描述的方案减少了胚胎显微注射后G0果蝇注射和饲养所需的时间、资源、劳动力和变异性。此外，使用黑琼脂筛查板可直接观察整个生命周期发育，便于识别和纠正注射、回收及幼虫育育过程中出现的问题。利用本研究评估的质粒构造，该方案以比之前报告的方法更少的注射胚胎数量，生成了转基因稳定的飞蝇^系9。虽然超出本方法文章的范围，但可以通过逆PCR和斯普林克雷特PCR等成熟方法，确认和定位转基因插入位点。

高效的注射方案还促进了未来功能基因组学的研究，包括利用荧光报告器进行启动子表征;通过对与病原体传播相关的基因进行逆遗传分析，进行载体能力评估;核酸酶表征，包括稳定果蝇中CRISPR-Cas9及其他可编程核酸酶的评估;通过修饰候选抗性等位基因进行杀虫剂抗性研究;以及基础生物学的研究，包括参与血液喂养、交配和发育的基因。我们的方案还消除了对胚胎注射和含氧湿度舱的依赖，如之前Musca家用和Lucilia cuprina piggyBac转化文献中^{所述，用于}胚胎注射后恢复。

成功转基因有几个关键参数。胚胎干燥和注射时机尤为重要，因为质粒DNA必须在细胞化前引入，以确保被生殖系前体细胞吸收。然而，稳定蝇胚胎中合胞体形成的确切时间仍不清楚。此外，胚胎发育速率受温度影响，稳定果蝇胚胎在不同环境条件下的发育时间线尚未完全确定。未来对稳定实验室果蝇品系发育速率和胚胎发生的研究，或将有助于优化显微注射和转化方案，从而进一步提高效率和方案的重复性。然而，在此之前，确定最优注入窗口仍是一个方法学上的限制，可能影响转化效率。当存活率较低时，可以通过比较未处理胚胎、去绒毛胚胎、注射过滤无菌PBS的胚胎以及在琼脂平板上培育的野生胚胎的孵化和成体存活率来进行排查。此前描述 家鼠斑马 转化的文献在1668次注射中产生了14次整合事件（占注射总数的0.84%）¹⁶，而绵害虫 Lucilia cuprina 的转化则通过约900次胚胎注射（占注射总数的0.33%）建立了3条转基因系¹⁷，表明该协议中描述的稳定果蝇转化方案（431次注射中6次整合事件， 1.4%的注入效率相比文献中其他害虫双翅目物种有显著提升。

稳定蝇 的hsp83 本构启动子在整个发育过程中提供了ZsGreen的强有力表达，并支持了早期胚胎发生期间高活性piggyBac转座酶的表达，从而提升了荧光标志物的可见性和转化效率，相较于先前报道的稳定果蝇转化方案⁹。本研究中使用的辅助质粒是通过将3.1 kb基因组DNA在 hsp83 起始密码子上游的亚克隆到极小质粒载体中，生成的，位于高活性的piggyBac转座酶编码序列上游。辅助物与货物质粒比在质量比1：1的经验中确立，并在整个研究过程中被使用。虽然未评估其他质粒比值，但替代比也可能有效。

这里描述的改进可能适用于其他节肢动物的转基因方案。此外，基于琼脂的筛选和养殖系统目前正应用于黑兵蝇（Hermetia illucens）胚胎注射和筛查。该方案对其他贻贝蝇类的转基因工作尤其有用，包括 家蝇 和 红血蝇，因为它们在分解纤维基质中发育相似。使用大 肠杆菌接种琼脂平板，可能为注射后监测提供实用方法，同时使研究人员能够评估胚胎发育、幼虫形态、标记表达、孵化率及整体恢复。将培养基中的细菌成分适应目标物种的生物特性，可能进一步提升该方法在开发和优化转基因协议方面的实用性。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	干燥室
Bacto Agar	Difco	281230	用于黑色琼脂板的琼脂
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	用于鸡蛋收集杯的黑色棉布和用于幼虫养殖箱的织物垫圈
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	用于干燥室的干燥剂
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	批量幼虫培养基
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	注射显微镜
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	用于黑色琼脂板的营养源
E. coli	New England Biolabs	C2987H	用于黑色琼脂板的细菌
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	微注射压力供应
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	转移胚胎
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	用于拉针的毛细管
Forceps	Fine Science tools	11251-20	样品处理
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	在去膜过程中固定胚胎
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	用于去除胚膜的漂白溶液
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	批量幼虫培养基容器
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	收集胚胎
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	用于大肠杆菌培养的LB肉汤
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	用于移动和排列胚胎的显微镜
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	用于将注射混合物装入针头
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	用于注射的微操作器
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	用于过滤注射混合物
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	注射缓冲液
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	用于黑色琼脂板的颜料
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	用于从毛细管中拉针的设备
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	注射缓冲液
Petri plates	VWR	391-0609	用于黑色琼脂蛋板的培养皿
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	用于注射的染料
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	干燥室塞子
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	批量幼虫培养基
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	用于微注射的玻璃盖片
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	用于筛选幼虫的荧光灯和滤光片
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	将细菌撒在培养板上
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	在去膜过程中洗涤胚胎
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	去膜胚胎
Wash bottle	Safetyware	Z423335	将胚胎从表面洗涤