一种基于微载体珠的人脐静脉内皮细胞三维血管生成模型

摘要

本方案描述了一种基于微载体珠的三维血管生成模型，该模型使用人脐静脉内皮细胞。该检测方法可直接观察内皮细胞出芽和类似管腔结构的形成，适用于血管生成机制及治疗干预的研究。

摘要

血管生成是一个多步骤的生物学过程，涉及内皮细胞的活化、迁移、伸长、管腔形成、分支及吻合。传统的二维培养系统可用于药物、基因或培养条件的初步评估，但无法充分模拟内皮细胞在三维细胞外基质中的形态发生空间结构。本方案描述了一种基于微载体珠的三维血管生成检测方法，使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）首先接种于表面化学偶联了酸变性猪I型胶原的微载体珠上，随后包埋于基底膜基质中。接着将口腔黏膜成纤维细胞接种于凝胶表面，以提供旁分泌支持，促进内皮出芽及类血管结构的形成。每2天更换一次培养基，通过倒置显微镜观察出芽行为及血管生成表型。在适宜的培养条件下，数天内即可出现内皮出芽，随后形成类管腔结构及出芽间的连接。该方法提供了一个便捷且可重复的实验平台 体外 内皮形态发生研究，并可进一步应用于基因操作、药理学干预和疾病建模的研究。

引言

内皮出芽是血管生成的关键事件，涉及内皮细胞从已有的血管结构中出现、迁移、增殖和排列，随后形成管腔并建立相互连接的类血管网络^1,2尽管传统的二维培养系统和基于凝胶的管形成实验在技术上较为简便，但其在模拟内皮细胞于三维微环境中的空间重塑能力方面存在局限性^3,4经典的基于微载体珠的三维出芽实验可重现血管生成的多个阶段 体外包括内皮细胞出芽、延伸、管腔形成和网络组装，因此已成为血管生成研究中广泛使用的方法。

本实验方案建立了一种基于三维微载体珠的出芽模型，使用正常人脐静脉内皮细胞进行培养。在先前报道的内皮细胞微载体珠出芽实验方法^5,6,7的基础上，本方法保留了内皮细胞包被微载体珠、嵌入三维基质以及成纤维细胞覆盖培养的基本框架，同时以基底膜基质替代传统的纤维蛋白凝胶，以简化操作流程并便于常规成像观察。在本改良方案中选择基底膜基质，主要基于多项实际操作和生物学因素的考虑。从实验操作角度，该基质提供了一种即用型的三维基质环境，可实现快速凝胶形成、简便的微珠包埋，以及无需额外聚合步骤的常规显微观察，避免了纤维蛋白凝胶制备所需的复杂过程。从生物学角度，基底膜基质含有支持内皮细胞黏附、迁移、出芽延伸及管腔样结构形成的多种细胞外基质成分。因此，该改良方法适用于需要直接可视化观察内皮细胞出芽行为、比较血管生成表型，以及在三维培养环境中评估药物或基因干预效果的研究。然而，由于基底膜基质在基质组成、力学特性、可降解性及生物活性信号方面与纤维蛋白凝胶存在差异，本实验应被视为一种改良的微载体珠出芽模型，而非经典纤维蛋白依赖性实验的直接替代。这些与基质相关的差异可能影响出芽动力学、管腔稳定性及网络形态特征，在比较不同三维血管生成系统的研究结果时应予以充分考虑。本模型适用于在三维环境中观察内皮细胞出芽行为，并可进一步应用于药物干预、基因调控及血管生成机制的研究。

方案

本方案中使用的人脐静脉内皮细胞是从云南省第一人民医院妇产科收集的人脐带组织中分离并培养获得的。所有供体在样本采集前均签署了书面知情同意书。涉及人源性材料的所有操作均经云南省第一人民医院医学伦理委员会批准（批准号：KHLL2023-KY198）。人口腔黏膜成纤维细胞（HOMFs）由昆明医科大学附属口腔医院翟洁梅博士研究组惠赠。所用试剂与设备列于材料表中。

1. 细胞准备

1. 在添加胎牛血清（FBS）至终浓度为10%的内皮细胞生长培养基中，于37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。用于实验的细胞应无污染，生长稳定，并处于对数生长期。使用第4–6代的细胞。
2. 在含10%胎牛血清（FBS）的高糖基础培养基中，于37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中培养人口腔黏膜成纤维细胞（HOMFs）。使用第4–6代的细胞。
3. 在进行微载体珠包被前，确认两种细胞均达到适当的汇合度。避免细胞过度汇合或过度酶消化，因为这些因素可能对后续出芽产生不利影响。

2. 微载体珠的制备

1. 将0.5 g干燥的 微载体珠加入50 mL PBS中，水化至少3小时。洗涤后，将微载体珠重悬于50  mL PBS中，制成浓度为10 mg/mL的微载体珠悬液，相当于约3 × 10⁴ 个珠/mL。
2. 将 悬液转移至硅化玻璃瓶中 ，在115 °C下高压灭菌15分钟 ，然后于4 °C保存备用。
3. 在进行内皮细胞包被前，去除保存液，用无菌PBS洗涤微载体珠。将微载体珠在37 °C的内皮细胞生长培养基中平衡至少30分钟。
4. 使用前立即轻柔重悬已平衡的微载体珠，以避免沉降和珠体聚集。
5. 细胞包被前，取少量微载体珠悬液在倒置显微镜下观察。只有当微载体珠完全水化、均匀悬浮且无可见聚集体或碎片时，方可继续操作。

3. 将内皮细胞包被于微载体珠上

1. 使用胰蛋白酶消化并分离HUVECs，然后将细胞重悬于内皮细胞生长培养基中。
2. 以每微载体珠1,500个细胞的密度包被微载体珠。将3 × 10⁶个HUVECs与2,000个微载体珠混合于1.5 mL内皮细胞生长培养基中。
3. 将细胞-珠混合物转移至微量离心管中，在细胞培养孵箱中孵育12小时。在整个12小时孵育期间，每隔20分钟轻轻倒置管子一次，以维持细胞与珠子之间的充分接触，并促进内皮细胞均匀附着。
4. 孵育12小时后，将包被好的珠子转移至含有4 mL内皮细胞生长培养基的25 cm²细胞培养瓶中，继续过夜孵育，以使内皮细胞牢固附着于微载体珠表面。
5. 包埋前，在倒置显微镜下检查代表性包被珠子。只有当超过80%的检查珠子显示珠子表面形成连续且相对均匀的内皮细胞层，游离漂浮细胞极少、无明显细胞团块、无严重珠子聚集时，方可进行基质包埋。包被不均、存在大细胞簇或严重聚集的珠子不得用于包埋。
6. 若珠子粘附于瓶底，可轻轻摇动培养瓶使其释放。避免剧烈吹打，以免引起珠子聚集或细胞脱落。

4. 将包被的珠子嵌入三维基质中

1. 将包被有内皮细胞的微载体珠转移至15 mL离心管中，静置使珠子自然沉降。吸除多余培养基，并加入适量新鲜培养基。
2. 将微载体珠悬液与预冷的基底膜基质以1:1（v/v）的比例混合，得到终浓度为500珠/mL的悬液。
3. 取100 µL基质-珠悬液加入24孔板每个孔的中央，使混合物形成一个圆顶状凝胶滴，避免接触孔壁。加样前应立即轻轻混匀悬液，并避免引入气泡。
4. 将24孔板在室温下静置5分钟，使凝胶滴初步凝固和稳定。随后将板直立置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育15分钟，再将其倒置继续孵育15分钟，以确保完全凝胶化和正确的凝胶形态形成。
5. 待凝胶完全固化后，立即进行成纤维细胞覆层培养。

5. 成纤维细胞覆盖培养

1. 将 3 × 10⁴ 个人口腔黏膜成纤维细胞（HOMFs）重悬于 1 mL 内皮细胞生长培养基中，沿每孔壁轻轻加入细胞悬液，使细胞在凝胶表面均匀分布，避免直接破坏凝胶穹顶结构。
2. 在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中继续用内皮细胞生长培养基培养。人口腔黏膜成纤维细胞作为支持细胞使用，因其可提供基质来源的旁分泌信号，促进三维培养系统中内皮细胞出芽延伸、稳定及类血管重塑。

6. 培养物维持与显微观察

1. 每2天更换一次培养基。换液时，缓慢吸除用过的培养基，并沿孔壁加入新鲜培养基，避免扰动凝胶。
2. 每天或隔天在倒置显微镜下使用明场或相差模式观察培养物。若需进行纵向定量分析，应在第7天选择每个孔中的多个视野，并在第9天和第11天对预先设定的相同视野进行拍照记录。
3. 在最佳培养条件下，通常在第4至6天可观察到明显的内皮细胞出芽，第5至7天出现管腔样结构，第7天后逐渐形成相互连接的微血管样网络。
4. 将成功出芽定义为：多个内皮细胞突起从微球表面呈放射状向周围三维基质中生长。只有当出芽结构明显延伸超出微球表面，并且仍与微球相关的内皮细胞层保持连接时，方可计为一次出芽。
5. 将管腔样结构的形成立义为：出现具有可见中央透明区域或呈管状形态的细长内皮结构。相邻出芽之间的连接定义为出芽之间形成的直接接触或连续结构。
6. 若培养样本出现大量细胞死亡、微球严重聚集、凝胶结构破坏、气泡过多、基质塌陷，或仅有短而无规则的细胞突起，则视为培养效果不佳，不应纳入定量分析。

7. 图像采集与定量分析

1. 在第7天选择每个孔中的多个视野，并在第9天和第11天对相同预定义的视野进行成像。所有时间点的图像应使用相同的放大倍数、曝光设置和成像条件采集。
2. 量化每个微载体珠上的出芽数量和血管化区域面积。
   1. 对于血管化区域面积的测量，使用开源图像分析软件。打开采集的图像，使用多边形或手绘选择工具手动勾画血管化感兴趣区域（ROI）的边界。将选定的ROI添加到ROI管理器中。
   2. 为实现可视化，使用感兴趣区域可视化插件显示所勾画的ROI。在测量设置中启用面积测量功能，并对选定的ROI进行测量以获得血管化区域面积。对所有图像应用相同的分析设置。
   3. 对于血管生成速率分析，以第7天的血管化区域面积作为基线，计算第9天和第11天血管化区域面积的相对变化。
3. 由三位观察者独立计数单个出芽数量，并取平均值用于分析。

结果

三维 HUVEC 模型中的血管生成

在成功建立的培养体系中，内皮细胞均匀分布在微载体珠表面，未观察到明显的珠体聚集现象。动态观察显示，在培养第7、9和11天时，内皮细胞逐渐出芽并形成类似微血管的网络结构（图1A）。定量分析进一步证实了该模型中血管生成反应的逐步进展。以第7天为基准，将血管生成率设为0%，第9天时达到66.94% ± 18.49%，第11天时达到169.51% ± 100.83%，表明在培养过程中血管化区域持续扩展（图1B）。典型的明场成像显示，经过7天培养后，内皮细胞芽体从珠体表面呈放射状延伸至周围的三维基质中（图1C）。此外，共聚焦显微镜提供了三维培养系统整体形态及空间结构的概览（图1D）。根据三位独立观察者的计数结果，每个微载体珠的平均出芽数为31.3个芽/珠（

讨论

本方案描述了一种基于微载体珠的改良三维内皮细胞出芽模型。 图3 提供了实验流程的示意图概览。 该方案改编自Nakatsu和Hughes报道的经典血管生成实验，并针对本研究的目标进行了优化^8,9在经典体系中，将内皮细胞接种于胶原包被的微载体珠上，嵌入三维基质，并与成纤维细胞共培养，以支持出芽、延伸、管腔形成及类似血管的吻合结构。^7,10在本方案中，使用基底膜基质替代纤维蛋白凝胶，并以人口腔黏膜成纤维细胞作为支持细胞，从而建立了一种便捷的三维培养系统 体外 内皮细胞促血管生成行为的观察。代表性图像中所示的出芽结构来源于HUVEC包被的微载体珠，而人口腔黏膜成纤维细胞作为覆盖的支撑细胞接种，在这些图像中未进行特异性标记。

本方案的一个重要特征是使用基底膜基...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Beyotime	FTUB306	透明，无核酸酶
15 mL 离心管	Haier	311005	锥底，无菌，袋装
24孔细胞培养板	Haier	612003	平底，组织培养处理，独立包装，适用于贴壁细胞培养
自动细胞计数载玻片	Countstar	12-0005-50	用于自动细胞计数仪的一次性载玻片，每盒50片
CO2 细胞培养孵箱	Thermo Fisher Scientific	3110	用于37 °C、5% CO2 条件下的细胞培养
Cytodex 3 微载体	Cytiva	17048503	干粉；胶原包被的葡聚糖微载体珠
Dotted Line 插件	N/A	N/A	用于显示勾画出的血管化区域的兴趣区可视化插件
Dulbecco’s 改良Eagle培养基（DMEM），高糖	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM基础培养基（1×），含4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和110 mg/L丙酮酸钠，500 mL
内皮细胞培养基（ECM）	ScienCell 研究实验室	1001	内皮细胞专用培养基，使用前补充胎牛血清至终浓度10%
胎牛血清（FBS）	Gibco	10099141C	经鉴定合格，单次使用包装，源自澳大利亚，500 mL
人口腔黏膜成纤维细胞（HOMFs）	昆明医科大学附属口腔医院 洁美斋研究组	N/A	从人口腔黏膜组织中分离的原代成纤维细胞；由其他实验室惠赠
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）	本实验室自备	N/A	从人脐静脉中分离的原代内皮细胞；无目录编号
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院（NIH）	N/A	开源软件；版本 1.54p
倒置显微镜	Olympus，日本	N/A	用于明场、相差及荧光成像
激光扫描共聚焦显微镜	Nikon，日本	N/A	用于共聚焦成像；型号未指定
Matrigel 基底膜基质	Corning	354262	高浓度（HC），无酚红，无LDEV，10 mL
青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）	Gibco	15140-122	用于细胞培养的青霉素-链霉素溶液，100×，100 mL
磷酸盐缓冲液（PBS）	LiJi Bio	AC08L011	1×，无菌，500 mL
T25 细胞培养瓶	ABCBIO	ABC707008	T25，带透气盖，组织培养处理，适用于贴壁细胞培养
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Gibco	25200-056	0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，100 mL