基于微载体的珠子三维血管生成模型，利用人类脐静脉内皮细胞

摘要

该方案描述了基于微载流子珠子的三维血管生成模型，利用人类脐静脉内皮细胞。该检测法可直接观察内皮萌芽和腔状结构形成，并可应用于血管生成机制和治疗干预的研究。

摘要

血管生成是一个多步骤的生物过程，涉及内皮细胞的激活、迁移、延长、腔道形成、分枝和吻合。传统的二维培养系统对于药物、基因或培养条件的初步评估非常有用，但它们无法充分复现三维细胞外基质内皮形态发生的空间组织。本方案描述了一种基于微载流子珠的三维血管生成分析，使用人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）。HUVECs首先被植入携带化学偶联酸变性猪I型胶原的微载体珠上，然后嵌入基底膜基质中。随后将口腔黏膜成纤维细胞植入凝胶表面，为内皮萌芽和维管样结构形成提供旁分泌支持。培养基每2天更换一次，发芽行为和血管生成表型通过倒置显微镜监测。在适当的培养条件下，内皮芽将在数天内出现，随后形成腔状结构和芽间连接。该方法为体 外 内皮形态发生研究提供了便捷且可重复的平台，并可进一步应用于基因操作、药物干预和疾病建模的研究。

引言

内皮萌生是血管生成中的关键事件，涉及内皮细胞从已有血管结构中出现、迁移、增殖和排列，随后形成腔道并建立相互连接的血管样网络 ^1,2。尽管传统的二维培养系统和基于凝胶的管状形成检测技术上简单，但在三维^{微环境中重}现内皮细胞空间重塑的能力有限^3,4。经典的微载流子珠基三维萌芽测定法可在体外重现血管生成的多个阶段，包括内皮萌芽、延长、腔道形成和网络组装，因此已成为血管生成研究中广泛应用的方法。

在本方案中，建立了基于正常人脐静脉内皮细胞的三维微载珠发芽模型。基于此前报道的内皮载体微载珠萌芽^{测定5、6、7}，该方法保留了内皮细胞涂层于微载体基珠上的基本框架，嵌入三维基质中，并进行成纤维细胞覆盖培养，同时用基底膜基质代替传统纤维蛋白凝胶，简化流程并便于常规成像。在该修改方案中选择基底膜基质，出于多种实际和生物学原因。实验上，它提供了一个即用的三维基质，能够快速形成凝胶、简单的珠状嵌入和方便的常规显微观察，而无需额外的聚合步骤。从生物学角度看，基底膜基质包含支持内皮细胞粘附、迁移、芽延展及腔状结构形成的细胞外基质成分。因此，该修饰适用于需要直接可视化内皮萌芽行为、比较血管生成表型以及在三维培养环境中评估药理学或遗传干预的研究。然而，由于基底膜基质在基质成分、力学性能、降解性和生物活性线索上与纤维蛋白凝胶不同，本测定应被解释为基于微载流子的发芽模型，而非直接替代传统的纤维蛋白基测定法。这些与基质相关的差异可能影响发芽动力学、腔道稳定性和网络形态，在比较不同三维血管生成系统结果时应予以考虑。该模型适用于三维观察内皮发芽行为，并可进一步应用于药理干预、基因操作和血管生成机制的研究。

方案

本方案中使用的人类脐静脉内皮细胞，是从云南省第一人民医院产科采集的人脐带组织中分离并培养的。采样前已获得所有捐献者的书面知情同意。所有涉及人类来源材料的手术均由云南省第一人民医院医学伦理委员会批准（批准号为KHLL2023-KY198）。昆明医科大学附属口腔口腔医院翟洁美博士的研究组慷慨提供了人类口腔黏膜成纤维细胞（HOMFs）。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 细胞制备

1. 在加湿培养箱中，在含5%二氧化碳的加湿培养箱中，将人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养至37°C、37°C时的10%浓度。用于检测的细胞应无污染，生长稳定，且处于对数生长阶段。使用第4至6通道的细胞。
2. 在含5%二氧化碳的加湿培养箱中，培养人类口腔黏膜成纤维细胞（HOMFs），基底培养基培养液中补充10%胎儿牛血清（FBS），温度为37°C。使用第4至6通道的细胞。
3. 在微载珠涂层前，确认两种细胞类型是否处于适当的汇合处。避免过度混合培养或过度酶促消化，因为这些可能不利后续发芽。

2. 微载流子珠的制备

1. 将0.5克干燥微载体珠浸入50毫升PBS中，浸泡至少3小时。清洗后，将珠子重新悬浮在50毫升PBS中，获得10 mg/mL微载体珠悬浮液，相当于约3×10⁴珠/mL。
2. 将悬浮液转移到硅化玻璃瓶中，在115°C高压灭菌15分钟，然后保存至4°C直到使用。
3. 在内皮细胞涂层前，去除储存液并用无菌PBS清洗珠子。将珠子在内皮细胞培养基中平衡，温度为37°C，至少保持30分钟。
4. 使用前应轻轻重新悬浮平衡的珠子，以避免沉降和珠子聚集。
5. 在进行细胞涂层之前，先用倒置显微镜检查一小块珠子悬浮液。只有在珠子完全水合、均匀悬浮且无可见聚集体或碎屑颗粒后才进行。

3. 将内皮细胞涂覆在微载子珠上

1. 利用胰蛋白酶分离HUVECs，并将细胞重新悬浮在内皮细胞生长培养基中。
2. 每珠将微载流子的微载流子涂覆1500个细胞的密度。将3个×10个⁶ 个HUVEC与2000个微载体珠混合于1.5毫升内皮细胞生长培养基中。
3. 将细胞珠混合物转移到微离心管中，并在细胞培养箱中孵育12小时。在完整的12小时潜伏期间，每20分钟轻轻倒置一次管子，以保持细胞与珠子的充分接触，促进内皮细胞均匀附着。
4. 12小时后，将涂层的珠子转移到一个25厘米² 细胞培养瓶中，瓶内含4毫升内皮细胞生长培养基，继续过夜潜伏，使内皮细胞牢固附着在微载体珠表面。
5. 嵌入前，先用倒置显微镜检查代表性涂层珠子。只有当超过80%的被检查珠子显示出连续且相对均匀的内皮细胞层，游离细胞极少，无明显细胞团块，且无严重珠状聚集时，才进行基质嵌入。涂层不均匀、细胞簇大或聚集严重的珠子不应用于嵌入。
6. 如果珠子粘在瓶底，轻轻摇晃瓶子使其脱落。避免剧烈移液，以免导致珠子聚集或细胞脱落。

4. 将涂层的珠子嵌入三维矩阵中

1. 将内皮细胞包覆微载体珠转移到15毫升离心管中，让珠子通过重力沉降。去除多余的培养基，加入适量的新鲜培养基。
2. 将微载体微载珠悬浮液与预冷基底膜基体以1：1（v/v）比例混合，得到最终500珠/毫升浓度。
3. 在24孔板的每个孔中心加入100微升基珠悬浮液，使混合物形成单个圆顶形凝胶液滴而不接触井壁。在喷油前轻轻混合悬浮液，避免引入气泡。
4. 将24孔板置于室温下5分钟，以便初步凝胶化并稳定凝胶滴。然后将平板直立在37°C的5%二氧化碳中孵育15分钟，接着在倒置位置再进行15分钟培养，以确保完全凝胶化并形成正常凝胶。
5. 凝胶完全固化后，立即进行成纤维细胞覆盖培养。

5. 成纤维细胞覆盖培养

1. 将3×10⁴的人类口腔黏膜成纤维细胞（HOMFs）重新悬浮于1毫升内皮细胞生长培养基中，并沿每个孔壁轻柔地添加细胞悬浮液，使细胞能够分布在凝胶表面而不直接破坏凝胶穹顶。
2. 继续在37°C的内皮细胞培养基中，加5% CO₂的加湿培养箱中培养。人类口腔黏膜成纤维细胞被用作支持细胞，因为它们提供源自阶层的旁分泌信号，促进三维培养系统中内皮芽的伸展、稳定和血管状重塑。

6. 培养维护与显微镜观察

1. 培养基每两天更换一次。更换培养基时，缓慢吸取用过的培养基，并沿井壁添加新鲜培养基，以避免扰动凝胶。
2. 每天或隔天使用倒置显微镜使用明场或相位对比模式观察培养物。纵向定量分析时，第7天在每个井中选择多个视场，第9天和第11天拍摄相同的预定视场。
3. 在最佳培养条件下，通常在第4至6天观察到明显的内皮萌芽，第5至7天出现腔状结构，第7天后逐渐形成相互连接的微血管样网络。
4. 成功萌芽定义为多个内皮延伸体从珠表面放射状生长到周围三维基质。只有当芽明显超出珠面并与珠子相关内皮细胞层相连时，才应计数。
5. 将腔状结构形成定义为内皮结构呈细长且中央透明或管状形态的表现。芽间连接被定义为相邻芽苗之间形成的直接接触或连续结构。
6. 具有广泛细胞死亡、严重珠状聚集、凝胶结构破坏、气泡丰富、基质塌陷或仅有短小不规则细胞突起的培养物应被视为次优，排除在定量分析之外。

7. 图像采集与定量分析

1. 第7天在每个井中选择多个视场，第9天和第11天从相同的预定义场获取图像。图像应在所有时间点使用相同的放大倍率、曝光设置和成像条件进行采集。
2. 量化每个微载流子珠的芽数和维管覆盖面积。
   1. 对于血管化面积测量，请使用开源图像分析软件。打开采集图像，使用多边形或自由手绘选择工具手动划定血管化兴趣区域（ROI）的边界。将选定的投资回报率添加到投资回报经理中。
   2. 在可视化方面，可以使用兴趣区域可视化插件来显示已勾勒出的投资回报率（ROI）。在测量设置中启用面积测量，并测量选定的投资回报率以获得血管化面积。对所有图像应用相同的分析设置。
   3. 血管生成率分析时，以第7天的血管化区域为基线，计算第9天和第11天血管化区域的相对变化。
3. 由三名观察者独立计数个体芽的数量，并使用平均值进行分析。

结果

三维HUVEC模型中的血管生成

在成功建立的培养中，内皮细胞均匀分布在微载体珠表面，且未观察到明显的珠子聚集。动态观察显示第7、9和11天内皮芽生和微血管样网络形成进展性（见图1A）。定量分析进一步证实了该模型中血管生成反应的进展性。以第7天为基线，血管生成率在第7天设为0%，第9天达到66.94%±18.49%，第11天达到169.51%±100.83%，表明培养过程中血管形成区逐渐扩张（见图1B）。具代表性的明场成像显示，培养7天后，内皮芽从珠表面径向进入周围的三维基质（图1C）。此外，共軛焦显微镜还提供了三维培养系统的粗略形态和空间组织概览（见图1D）。根据三位观察者的独立计数，每个微载流子珠的平均芽数为31.3个（见图1E）。这些发现表明，该模型支持三维环境中内皮萌芽、延长、腔状形态和血管状重塑。

三维HUVEC模型中的次优结果

在失败或次优培养中，可能观察到若干特征异常，包括细胞死亡（图2A）、微载体珠破裂（图2B）、珠表面异常聚集（图2C）、凝胶内广泛气泡形成（图2D）、基质局部塌陷（图2E）、珠密度过高（图2F）、微载体珠子涂层不均（图2G）），珠团聚集（图2H），且无明显萌芽或仅有限的萌芽形成（图2I，J）。这些异常表明模型的成功建立可能受细胞存活力不足、细胞涂层不足、基底膜基质温控不当、过度强力的再悬浮液或介质更换时凝胶的干扰所影响。

图1：三维HUVEC模型中的血管生成。（A） 在第7、9和11天对三维HUVEC模型中的血管生成进行动态评估。图像采用20×倍放大。比例杆 = 10 微米。（B） 血管生成速率的定量分析。血管生成率定义为第7、9和11天血管化区域随时间的相对变化，以第7天为基线。计算结果为：血管生成率 = [（指示时间点的血管化面积 − 第7天的血管化面积）/ 第7天的血管化面积] ×100%。血管生成率数据以三项独立实验的平均值±标准差（SD）呈现。（C） 培养7天后HUVEC内皮萌芽的代表性图像。图像采用20×倍放大。比例条 = 10微米。（D） 共焦点概览图像，展示了三维培养系统的粗略形态。图像采用4×扫描。比例尺 = 500微米。（E） HUVECs芽数的定量分析。三位观察者独立计数芽数，并以平均值进行分析。未对这些描述性定量分析进行统计比较。图中所示的内皮萌芽结构源自HUVEC涂层的微载体珠;HOMFs作为叠加支持细胞使用，图像中未被特异标记。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：三维HUVEC模型中的次优结果。（A）细胞死亡。如白色箭头所示，细胞呈现为点状碎屑，微载子珠表面变得光滑。比例条 = 50 微米。（B） 微载流子珠的破裂，如白色箭头所示。比例条 = 50微米。（C） 微载流子珠表面的单元聚集。如白色箭头所示，细胞呈现出珠状簇状。比例尺 = 50 μm。（D） 凝胶内存在大量气泡形成，如白色箭头所示。比例条 = 100微米。（E） 矩阵局部坍缩，如白色箭头所示。比例杆 = 10 微米。（F） 微载流子珠密度过高。比例杆 = 10微米。（G） 微载流子珠上的电池涂层不均匀。如白色箭头所示，珠面一侧保持光滑。比例杆 = 50 微米（H）珠聚合。比例尺 = 50微米（I，J）无明显萌芽或仅有限的芽状形成。比例杆 = 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：实验工作流程的示意图。（A） 在适当条件下制备含有化学偶联酸变性猪I型胶原蛋白的HUVECs、HOMFs和微载体珠子，然后进行检测设置。（b）将HUVEC与制备好的微载体珠混合，促进内皮细胞与珠表面的附着。（C）每20分钟轻微倒置一次珠包层培养，持续12小时，促进内皮细胞均匀附着。（D）将涂层珠转移到培养瓶中进行进一步孵育，以便内皮细胞牢固附着在微载子珠表面。（E）将 HUVEC 涂层的微载体珠嵌入基底膜基质中，随后在凝胶上播种 HOMF，以提供基于基层的旁分泌支持，支持内皮萌芽和维管状重塑。（F） 显微镜观察和定量分析内皮萌芽、腔状结构形成、芽间连接、芽数及血管化区域，时间为第7、9和11天。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本协议描述了基于微载流珠的改良三维内皮发芽模型。图3提供了实验工作流程的示意概述。 该方案基于中津和休斯报告的经典血管生成方法进行改进，并优化以满足^本研究8,9的目标。在经典系统中，内皮细胞被包裹在胶原蛋白包覆的微载体珠上，嵌入三维基质中，并与成纤维细胞共培养，以支持萌芽、延长、腔腔形成及血管样吻合 ^7,10。在本方案中，使用基底膜基质代替纤维蛋白凝胶，并使用人类口腔黏膜成纤维细胞作为支持细胞，建立了便于三维培养系统，用于体外观察内皮血管生成行为。代表性图像中显示的萌芽结构源自HUVEC涂层的微载珠，而人类口腔黏膜成纤维细胞作为覆盖支持细胞植入，且在这些图像中未被特异标记。

该方案的一个重要特点是使用基底膜基质代替传统的纤维蛋白凝胶系统。实验上，基底膜基质简化了检测设置，因为它随时可用，能快速适应温度依赖的凝胶化，并且便于嵌入内皮细胞涂层的微载体珠，无需单独的纤维蛋白原、凝血酶或抑肽酶制备。这一特性使该协议相对简单，适合常规显微观测。然而，这种修饰也改变了测定的生物微环境。与纤维蛋白凝胶不同，基底膜基质包含与基底膜相关的细胞外基质成分和生物活性线索，这些可能影响内皮的粘附、迁移、芽苗伸展、腔状形态和网络重塑。此外，基质刚度、可降解性和配体组成的差异可能影响萌发动力学和网络形态。因此，使用该改良测定获得的结果应被理解为基于基底膜基质的微载子发芽模型的结果，而非原始纤维蛋白基测定的直接等效方法。

该模型的成功建立依赖于若干关键步骤。微载体珠表面均匀的内皮细胞涂层对于稳定的芽起始和伸展至关重要。涂层不足或不均匀可能导致芽数减少、方向性差以及重复性下降。稳定凝胶形成是测定性能的另一个关键决定因素。在基质制备和嵌入过程中，温度控制不当可能导致过早凝胶、珠子分布不均或气泡形成，这些都可能干扰内皮萌芽。此外，支持性成纤维细胞还需要持续提供旁分泌信号，促进芽的生长和稳定。因此，对这些步骤的严格控制对于获得稳定且可复现的结果至关重要。

多种措施可以提高检测的一致性。 图2 所示的代表性次优结果可作为实际的故障排除指标。广泛细胞死亡可能由细胞存活能力差、脱离时过度消化、传代次数不当或培养基置换延迟引起;因此，建议使用健康的对数期内皮细胞和温和的酶促消化。微载珠破裂或珠子聚集可能由剧烈移液、过度机械搅拌或珠子悬浮不足引起，通过温和混合和细心处理细心处理，可以减少。内皮细胞涂层不均匀或珠表面大簇通常表明混合不足、细胞密度过高或涂层期间珠细胞接触不足;在这种情况下，应在固定间隔轻微倒置细胞珠悬浮液，并在嵌入前检查。气泡形成和局部基质塌陷通常与基质处理不当、过早凝胶化或介质添加或替换时凝胶的干扰有关;使用前保持基质冰敷，避免喷洒时气泡，允许完全凝胶，并沿井壁缓慢添加介质，可以减少这些问题。无明显萌芽或仅有限发芽的培养物可能反映内皮细胞附着不良、细胞存活率低、成纤维细胞来源支持不足或基质形成不稳定，应排除在定量分析之外。

与传统的二维管形成测定相比，这种基于三维微载体珠的模型更有效地重现了细胞外基质内皮细胞的空间行为，并允许可视化内皮的萌芽、延长、类腔结构形成及网络组装。此外，三维培养环境提供了更接近体内营养和信号分布的条件 ^11,12。与通常技术要求高且成本高的微流控血管芯片系统相比，该方法相对简单、可重复且成本效益高，非常适合常规体外血管生成研究。

该方案的一个重要限制是，基底膜基质被用作经典纤维蛋白凝胶系统的替代品。因此，本检测应被视为此前报道的内皮微载体珠芽模型的修改版本，而非原始纤维蛋白方法的直接复制。由于不同基质在成分、机械性能和降解行为上存在差异，它们可能影响发芽动力学、腔体稳定性和血管网络形态13,14,15。因此，在比较该模型与传统纤维蛋白系统生成的结果时需谨慎。

该模型具有超越基底内皮萌芽观察的潜在应用。它也可用于药理干预研究、基因过表达或敲低实验、信号通路分析以及疾病相关内皮表型的研究^16,17。通过进一步优化，该三维萌芽测定有望成为研究血管发育机制及针对血管生成治疗策略的可靠体外平台。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微离心管	Beyotime	FTUB306	透明，无核酸酶
15 mL 离心管	海尔	311005	锥底，无菌，袋装
24孔细胞培养板	海尔	612003	平底，组织培养处理，独立包装，用于黏附细胞培养
自动细胞计数载玻片	Countstar	12-0005-50	用于自动细胞计数器的一次性载玻片，每盒50片
CO2 细胞培养箱	Thermo Fisher Scientific	3110	用于在37°C和5% CO2下进行细胞培养
Cytodex 3 微载体	Cytiva	17048503	干粉；胶原蛋白包被的葡聚糖微载体珠
点状线插件	无	无	用于显示轮廓血管化区域的感兴趣区域可视化插件
杜尔贝科改良鹰酵母营养基（DMEM），高葡萄糖	EvaCell（EVA Life Sciences）	E2102	DMEM 基本（1×），含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和 110 mg/L 钠丙酮酸，500 mL
内皮细胞培养基（ECM）	ScienCell Research Laboratories	1001	内皮细胞培养基，使用前补充额外的FBS至最终浓度为 10%
胎牛血清（FBS）	Gibco	10099141C	合格，单次使用格式，澳大利亚原产，500 mL
人口腔黏膜成纤维细胞（HOMFs）	昆明医科大学附属口腔医院课题组	无	从人口腔黏膜分离的原代成纤维细胞；由另一实验室友好提供
人脐带静脉内皮细胞（HUVECs）	内部	无	从人脐带静脉分离的原代内皮细胞；无目录号
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院（NIH）	无	开源软件；版本 1.54p
倒置显微镜	日本奥林巴斯	无	用于明场、相差和荧光成像
激光扫描共聚焦显微镜	日本尼康	无	用于共聚焦成像；型号未指定
Matrigel 基底膜基质	康宁	354262	高浓度（HC），无苯酚红，无LDEV，10 mL
青霉素-链霉素（Pen-Strep）	Gibco	15140-122	细胞培养用青霉素-链霉素溶液，100×，100 mL
磷酸盐缓冲液（PBS）	力吉生物	AC08L011	1×，无菌，500 mL
T25 细胞培养瓶	ABCBIO	ABC707008	T25，带通气盖，组织培养处理，用于黏附细胞培养
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Gibco	25200-056	0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，100 mL