本方案描述了一种基于微载体珠的三维血管生成模型，该模型使用人脐静脉内皮细胞。该检测方法可直接观察内皮细胞出芽和类似管腔结构的形成，适用于血管生成机制及治疗干预的研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本方案描述了一种基于微载体珠的三维血管生成模型，该模型使用人脐静脉内皮细胞。该检测方法可直接观察内皮细胞出芽和类似管腔结构的形成，适用于血管生成机制及治疗干预的研究。
血管生成是一个多步骤的生物学过程，涉及内皮细胞的活化、迁移、伸长、管腔形成、分支及吻合。传统的二维培养系统可用于药物、基因或培养条件的初步评估，但无法充分模拟内皮细胞在三维细胞外基质中的形态发生空间结构。本方案描述了一种基于微载体珠的三维血管生成检测方法，使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）首先接种于表面化学偶联了酸变性猪I型胶原的微载体珠上，随后包埋于基底膜基质中。接着将口腔黏膜成纤维细胞接种于凝胶表面，以提供旁分泌支持，促进内皮出芽及类血管结构的形成。每2天更换一次培养基，通过倒置显微镜观察出芽行为及血管生成表型。在适宜的培养条件下，数天内即可出现内皮出芽，随后形成类管腔结构及出芽间的连接。该方法提供了一个便捷且可重复的实验平台 体外 内皮形态发生研究，并可进一步应用于基因操作、药理学干预和疾病建模的研究。
内皮出芽是血管生成的关键事件，涉及内皮细胞从已有的血管结构中出现、迁移、增殖和排列，随后形成管腔并建立相互连接的类血管网络1,2尽管传统的二维培养系统和基于凝胶的管形成实验在技术上较为简便，但其在模拟内皮细胞于三维微环境中的空间重塑能力方面存在局限性3,4经典的基于微载体珠的三维出芽实验可重现血管生成的多个阶段 体外包括内皮细胞出芽、延伸、管腔形成和网络组装，因此已成为血管生成研究中广泛使用的方法。
本实验方案建立了一种基于三维微载体珠的出芽模型，使用正常人脐静脉内皮细胞进行培养。在先前报道的内皮细胞微载体珠出芽实验方法5,6,7的基础上，本方法保留了内皮细胞包被微载体珠、嵌入三维基质以及成纤维细胞覆盖培养的基本框架，同时以基底膜基质替代传统的纤维蛋白凝胶，以简化操作流程并便于常规成像观察。在本改良方案中选择基底膜基质，主要基于多项实际操作和生物学因素的考虑。从实验操作角度，该基质提供了一种即用型的三维基质环境，可实现快速凝胶形成、简便的微珠....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本方案中使用的人脐静脉内皮细胞是从云南省第一人民医院妇产科收集的人脐带组织中分离并培养获得的。所有供体在样本采集前均签署了书面知情同意书。涉及人源性材料的所有操作均经云南省第一人民医院医学伦理委员会批准（批准号：KHLL2023-KY198）。人口腔黏膜成纤维细胞（HOMFs）由昆明医科大学附属口腔医院翟洁梅博士研究组惠赠。所用试剂与设备列于材料表中。
1. 细胞准备
2. 微载体珠的制备
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
三维 HUVEC 模型中的血管生成
在成功建立的培养体系中，内皮细胞均匀分布在微载体珠表面，未观察到明显的珠体聚集现象。动态观察显示，在培养第7、9和11天时，内皮细胞逐渐出芽并形成类似微血管的网络结构（图1A）。定量分析进一步证实了该模型中血管生成反应的逐步进展。以第7天为基准，将血管生成率设为0%，第9天时达到66.94% ± 18.49%，第11天时达到169.51% ± 100.83%，表明在培养过程中血管化区域持续扩展（图1B）。典型的明场成像显示，经过7天培养后，内皮细胞芽体从珠体表面呈放射状延伸至周围的三维基质中（图1C）。此外，共聚焦显微镜提供了三维培养系统整体形态及空间结构的概览（图1D）。根据三位独立观察者的计数结果，每个微载体珠的平均出芽数为31.3个芽/珠（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本方案描述了一种基于微载体珠的改良三维内皮细胞出芽模型。 图3 提供了实验流程的示意图概览。 该方案改编自Nakatsu和Hughes报道的经典血管生成实验，并针对本研究的目标进行了优化8,9在经典体系中，将内皮细胞接种于胶原包被的微载体珠上，嵌入三维基质，并与成纤维细胞共培养，以支持出芽、延伸、管腔形成及类似血管的吻合结构。7,10在本方案中，使用基底膜基质替代纤维蛋白凝胶，并以人口腔黏膜成纤维细胞作为支持细胞，从而建立了一种便捷的三维培养系统 体外 内皮细胞促血管生成行为的观察。代表性图像中所示的出芽结构来源于HUVEC包被的微载体珠，而人口腔黏膜成纤维细胞作为覆盖的支撑细胞接种，在这些图像中未进行特异性标记。
本方案的一个重要特征是使用基底膜基.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者无任何利益冲突需要披露。
作者感谢云南省张毅专家工作站（202305AF150444）和昆明医科大学研究生教育创新基金（2025S234）提供的经费支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Beyotime | FTUB306 | 透明，无核酸酶 |
| 15 mL 离心管 | Haier | 311005 | 锥底，无菌，袋装 |
| 24孔细胞培养板 | Haier | 612003 | 平底，组织培养处理，独立包装，适用于贴壁细胞培养 |
| 自动细胞计数载玻片 | Countstar | 12-0005-50 | 用于自动细胞计数仪的一次性载玻片，每盒50片 |
| CO2 细胞培养孵箱 | Thermo Fisher Scientific | 3110 | 用于37 °C、5% CO2 条件下的细胞培养 |
| Cytodex 3 微载体 | Cytiva | 17048503 | 干粉；胶原包被的葡聚糖微载体珠 |
| Dotted Line 插件 | N/A | N/A | 用于显示勾画出的血管化区域的兴趣区可视化插件 |
| Dulbecco’s 改良Eagle培养基（DMEM），高糖 | EvaCell (EVA Life Sciences) | E2102 | DMEM基础培养基（1×），含4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和110 mg/L丙酮酸钠，500 mL |
| 内皮细胞培养基（ECM） | ScienCell 研究实验室 | 1001 | 内皮细胞专用培养基，使用前补充胎牛血清至终浓度10% |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10099141C | 经鉴定合格，单次使用包装，源自澳大利亚，500 mL |
| 人口腔黏膜成纤维细胞（HOMFs） | 昆明医科大学附属口腔医院 洁美斋研究组 | N/A | 从人口腔黏膜组织中分离的原代成纤维细胞；由其他实验室惠赠 |
| 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） | 本实验室自备 | N/A | 从人脐静脉中分离的原代内皮细胞；无目录编号 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | N/A | 开源软件；版本 1.54p |
| 倒置显微镜 | Olympus，日本 | N/A | 用于明场、相差及荧光成像 |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Nikon，日本 | N/A | 用于共聚焦成像；型号未指定 |
| Matrigel 基底膜基质 | Corning | 354262 | 高浓度（HC），无酚红，无LDEV，10 mL |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep） | Gibco | 15140-122 | 用于细胞培养的青霉素-链霉素溶液，100×，100 mL |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | LiJi Bio | AC08L011 | 1×，无菌，500 mL |
| T25 细胞培养瓶 | ABCBIO | ABC707008 | T25，带透气盖，组织培养处理，适用于贴壁细胞培养 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Gibco | 25200-056 | 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，100 mL |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本文已发表
视频即将推出