在寡软精症大鼠模型中的异氟醚辅助电针治疗

摘要

该方案详细介绍了在大鼠中建立腺嘌呤诱导的寡软精症模型，并在异氟醚麻醉下对CV3、CV4、ST36和SP6进行电针治疗。结局通过计算机辅助精子分析的计数和运动性，以及睾丸组织学（含苏木精和伊红染色）进行验证。

摘要

少软精症是最常见的男性生殖功能障碍之一。在啮齿动物研究中，连续多次进行电针治疗（EA）存在技术挑战，尤其是在结合腹部中线和后肢穴位时，稳定的电极接触至关重要。中吉（CV3）、观源（CV4）、祖三里（ST36）和三阴角（SP6）被选中，是因为这些穴位常用于治疗不孕和精液异常的针灸方案，且腹部中线与后肢的结构符合标准化的电极配对。本报告描述了一种实用方案，用于建立腺嘌呤诱导的大鼠稀弱动物精子症模型，并结合配对刺激CV3–CV4和ST36–SP6进行异氟醚辅助EA。雄性Sprague-Dawley大鼠通过每日加维方式接受腺嘌呤，持续28天，以诱导生殖功能障碍。随后，EA在吸入麻醉下每日施用28天，诱导使用3%异氟醚，1.5%用于面罩维护，以实现针头稳定放置和电极配对（CV3–CV4和ST36–SP6），并符合明确的刺激参数（2 Hz，1.5 mA，30分钟）。治疗效果通过计算机辅助的精液分析评估精子数量和活动力，辅以睾丸血木精和伊苏氨酸（HE）组织学。代表性结果表明，腺嘌呤暴露减少了精子数量和活动力，破坏了精管结构，而EA则与精液参数和睾丸形态的部分恢复有关。该方案为需要稳定EA递送及在稀软精症大鼠模型中进行精液/组织学验证的研究提供了便捷的参考。

引言

男性因素对不孕症有显著贡献，约占所有不孕夫妇的一半，其中精子数量和运动能力异常是最常见的临床^{发现之一 1,2}。寡精子软弱症的特征是精子浓度降低和运动能力受损，是最常见的男性^{生殖功能障碍}形式之一^3,4。尽管辅助生殖技术和实证医学疗法已存在，改善精液质量的有效策略仍有限，这凸显了进一步临床前研究的必要性 ^5,6,7。这些临床和转化需求推动了在受控条件下研究男性生殖障碍的可重复实验流程的发展。

针灸干预已在临床和实验环境中研究精液异常和男性不孕症。⁸.尽管临床研究显示某些精液参数可能带来益处，但其设计、干预方案和结局^{指标差异很大} 9.电针（EA）特别适合实验室研究，因为它提供受控的刺激参数和比手动针灸更统一的调节，有助于评估治疗相关的可测量生殖结果变化 10,11,12。这一程序优势使EA非常适合男性生殖研究中结构化的临床前工作流程。

动物模型在评估中至关重要，但模型选择仍是寡软精症研究中的关键方法论问题。一项最新系统综述指出，布苏凡诱导的建模方法存在争议，且在评估指标中表现出显著异质性，强调了需要更清晰的程序和更一致的读数¹³。基于腺嘌呤的模型提供了实用的实验方法，因为腺嘌呤瘧可能导致大鼠生殖功能障碍，包括精子相关终点减少和睾丸组织的组织损伤^14,15。在我们之前的研究中，一个腺嘌呤诱导的寡软精精子模型在舒穆脑肾穴位组（Epangsanxian、BL23、GB25和KI3）上用EA治疗，同时配合非穴位和阳性药物对照，扩展结局指标包括通过ELISA¹⁶量化的器官系数和血清激素水平。基于这一实验基础，并认识到现有EA研究中穴位选择、对照设计、刺激参数和结局指标的异质性，本方案旨在完善和扩展稳定EA递送的方法学工作流程。

因此，本协议重点关注递送，解决啮齿动物重复EA会话中关键的两个实际变量。首先，为防止动物运动和导线牵引引起的针头位移和间歇性电极接触，我们描述了一种异氟醚维持的程序，该程序在刺激过程中稳定定位并确保电极接触的可靠;这在腹部中线点与后肢点结合时尤为重要。其次，基于先前综述和穴位-处方分析^9,17，确认CV4、SP6、ST36和CV3为不孕和精液异常方案中常见的生殖穴位，我们选择了CV3、CV4、ST36和SP6，并对CV3-CV4和ST36-SP6进行配对刺激。该配置结合了腹部中线和后肢点，标准化电极连接，最大限度减少导线连接不稳定引起的变异性，并支持在多次治疗中重复传递EA。为保持以方案为导向的范围，避免重复先前报告的内分泌、机理或阳性对照模块，结局验证仅限于初级精液和睾丸读出集。该套包括计算机辅助精子分析和睾丸HE染色，足以确认该工作流程中表型诱导和治疗相关变化的成功。

方案

所有动物操作均符合实验室动物护理和使用的机构指南，并获得宁夏医科大学伦理委员会批准（批准号IACUC-NYLAC-2021-130）。从宁夏医科大学实验动物中心（许可证号）获得8周龄、体重180–220克的雄性Sprague-Dawley大鼠。SYXK （Ning） 2020-0001）。动物们在标准实验室条件下生活，环境为22–24°C，相对湿度52%–56%，12小时光照/12小时黑暗循环，且可自由获取食物和水。

1. 动物制备、组别分配及腺嘌呤诱导模型建立

1. 实验前7天让大鼠适应环境，并每天监测其整体状况。
2. 适应后，给九只大鼠分配唯一识别号，并以1：1：1的比例随机分配，使用计算机生成的随机序列将其随机分配到三组：对照组（n = 3）、模型组（n = 3）和EA组（n = 3）。以每只大鼠为实验单元，除非满足预先确定的排除标准，否则将所有动物和样本纳入最终分析。
3. 研究者在进行计算机辅助精液分析和组织学评估时保持盲视，避免群体分配。
   注意：实施EA的研究者无法进行盲法，因为干预涉及明显的群体特定程序。
4. 准备20 mg/mL的肾腺素悬浮液，含0.5%（w/v）阿拉伯胶作为悬浮剂，并在消化前和过程中充分混合，以防止沉降。
5. 对照组每日一次，连续28天，通过10 mL/kg（相当于1 mL/100 g体重）的胃囊酸法给模型组和EA组的腺苷悬浮剂。使用腺嘌呤剂量200毫克/公斤/天。
6. 在模特期间记录体重和整体状态。
   注意： 腺嘌呤作为悬浮剂服用，处理过程中容易沉淀。在输液过程中保持持续搅拌，以减少降水，否则可能导致剂量不一致和消化针头阻塞。如果出现堵塞，应彻底重新悬浮溶液并更换气管针后再继续。

2. 异氟醚麻醉用于电针治疗（见图1）

1. 准备一个异氟醚麻醉系统，配备诱导舱、鼻罩和加热垫。
2. 在诱导腔内用3%异氟醚诱导麻醉，直到自发活动显著减少。
3. 将大鼠仰卧转移到热敷垫上，整个EA期间通过鼻罩维持1.5%异氟醚麻醉。
4. 通过减少自发动作和失去眨眼反射，确认麻醉效果良好，同时保持正常呼吸。

3. 刺激传递的忠实度与质量控制

1. 使用热敷垫在整个治疗过程中保持体温，减少因体温过低引起的生理变异。
2. 对所有动物和治疗过程施加一致的麻醉设置，诱导使用3%异氟醚，维持使用1.5%异氟醚。保持麻醉深度在最低水平，以防止挣扎，同时保持正常呼吸。
3. 在选定的穴位垂直插入无菌一次性针灸针（0.25毫米×13毫米）。在CV3和CV4处将针头插入约2毫米深，ST36处7毫米，SP6处5毫米深度。
4. 针头插入和电极连接后，目视确认每根针头位置稳定，没有因呼吸或肢体运动而出现的松动。如果发生位移，针头垂直插入至原始深度，确认电极接触稳定后再继续刺激。
5. 在针柄近端附近剪断电极导线，然后布线并固定，以减少牵引力，因为铅重和拉扯是脱落的常见原因。
6. 通过观察穴位局部轻微肌肉震颤且无粗体动作来确认有效刺激。如果没有震颤，请重新检查并确认电极接触和针头位置。
7. 在15分钟时进行一次标准化检查。如有必要，重新调整针头并确认轻度局部震颤，然后继续减少动物间刺激传递的变异性。
   注意： 连接EA设备时，将引线夹在针柄近端，以减少电缆重量带来的牵引力。如有需要，用胶带固定导线和/或针头，防止脱落。

4. 电针治疗（见图2）

1. 在28天腺嘌呤漏斗期结束后的第二天开始EA，连续28天每天施用一次。
2. 在异氟醚麻醉下，暴露下腹部和后肢，利用表面解剖标志定位中吉（CV3）、观源（CV4）、祖三里（ST36）和三阴角（SP6）。
3. 在CV3和CV4处垂直插入无菌一次性针灸针（0.25毫米×13毫米），深度为2毫米，ST36深度7毫米，SP6深度5毫米。
4. 将一对电极连接到CV3和CV4，另一对接ST36和SP6。
5. 以2赫兹和1.5毫安电频率进行电刺激，持续30分钟。利用这些参数与此前用于腺嘌呤诱导寡软精症的参数相^匹配。
6. 应用第3节中列出的质量控制检查，包括15分钟的一次中途检查。
   注意： 根据Yong Tang的《实验针灸与艾灸科学^》第18卷附录II（“实验动物常用的针灸穴”），以及比较解剖标志，定位大鼠穴位。由于大鼠穴位代表的是离散的解剖区域，而非固定的几何点，因此在动物和疗程中使用一致的身体姿势、固定的解剖参考点以及基于毫米的表面测量。在腹侧中线（CV3）位置，距脐腹中央约33毫米。将冠源（冠源4）定位于腹侧中线，约位于脐腹中央尾侧25毫米处，靠近腹壁皮下浅动脉。将祖三里（ST36）定位在膝后外侧，距离腓骨头约3毫米远侧。将三阴焦（SP6）定位于后肢内侧，约位于内侧槌骨尖端10毫米处。在所有动物和治疗过程中，保持一致地应用相同的定位参考、身体位置、插入角度和插入深度。

5. 样本采集

1. 在最后一次EA后，让老鼠禁食24小时。
2. 在组织采集前，通过腹腔注射2%戊巴比妥钠，剂量为2 mL/kg，诱导深层麻醉。通过消除足部撤回反射和自发动作来确认深度麻醉。
3. 按照机构批准的程序，在深度麻醉下斩首安乐死老鼠。
4. 立即无菌暴露生殖器官。分离一个尾部附睾进行精子分析，切除一个睾丸进行组织学检查。
5. 在组织学处理前，将睾丸固定在4%的对甲醛中至少24小时。

6. 精子分析

1. 去除尾突附睾周围的脂肪，立即将组织放入预热至37°C的2毫升生理盐水中。
2. 将组织置于37°C水浴中孵育5分钟，用眼镜剪切碎，通过200网筛过滤悬浮液，轻柔混合过滤液。
3. 将10微升的精液悬浮液装入预热计数室，并使用计算机辅助精液分析（CASA）系统分析精子数量和活动力。
4. 在给定实验中，所有样品使用相同的腔体类型、加热条件和采集设置。

7. 睾丸组织的组织学检查

1. 将睾丸组织固定在4%的对甲醛中，至少24小时。修剪目标区域，放入带有标签的磁带中。
2. 通过分级乙醇序列脱水样品，用二甲烷清除，浸入石蜡，嵌入，并在4微米处切片。
3. 将切片放在40°C的水浴中，安装在载玻片上，然后放入60°C的烤箱中晾干。
4. 对于赤木精和伊松染色，先用二甲苯脱蜡，再用分级乙醇加水，再用赤木精染色5–10分钟，再用伊松染色1–5分钟，然后脱水、透明并装裱。
5. 在所有组的定量放大条件下，观察精细管的组织和精子生成细胞排列。

8. 模型建立及治疗相关变化的评估

1. 通过减少精子数量和运动能力，以及相较对照组的精细管结构紊乱来确认模型建立。
2. 确认EA组通过增加精子数量和运动性，以及部分恢复精管形态相较模型组，带来治疗相关变化。
3. 预先定义技术上受损的样本，如精子处理延迟、腔室装载失败或与建模无关的低质量切片，作为排除标准。分析过程中记录任何排除情况。

结果

精子分析（图3）
使用计算机辅助精液分析系统分析附睾的精子悬浮液，以量化精子数量和活动力。在该代表性数据集中，腺嘌呤给药显著降低了这两个参数相对于对照组，证实了模型建立的成功。EA干预随后提高了精子数量和运动能力，相较于模型组（见图3）。单向方差分析显示精子数量（F = 78.39，P < 0.001）和 精子运动性（F = 374.81，P < 0.001）均有显著的群体 效应。Bonferroni调整后的事后比较显示对照组与模型组之间，以及模型组与EA组之间有显著差异。

睾丸组织学（图4）
图4展示了代表性大鼠睾丸的HE染色切片，提供各组逐步放大的视图，包括250微米的概览和100微米的代表性精管区域内嵌。对照组表现出完整的睾丸结构，精管结构正常，精子生成细胞排列有序。相比之下，模型组显示出较薄的碎丝管壁和无序、还原的细胞层。其他...

讨论

鉴于寡软弱动物精子症的多因素病因及现有药物治疗疗效有限，针灸和EA作为可重复的非药物干预手段受到关注¹⁹。现有临床和临床前文献提出了针灸或EA可能影响男性生殖功能的多种合理机制，包括调节神经内分泌调节、改善生殖器官微循环，以及减轻影响精子生成的氧化应激和炎症反应²⁰.这些提出的机制为利用精液和睾丸组织学作为主要读数的受控动物实验评估EA提供了转化基础。

EA特别适合基于方案的临床前工作，其刺激参数（如频率、强度、疗程时长和电极配对）比手动针具操作更为规范和复^现。在大鼠中，参数控制的EA被报道促进受伤后精子生成的恢复，在特定实验条件下观察到精液相关终点的改善。近期临床研究持续评估EA在男性不孕症中的结局，如活力和总活动精子数量，反映了持续的转化研究兴趣，同时强调了前临床研究中明确定义且可重复的手术程序的必要性。

与之前基...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺嘌呤	北京索莱宝科技有限公司	A8330
CASA计算机辅助精液分析系统	南宁松井天伦生物科技有限公司	VICOS-SPERM
离心机	萨特里斯	A-14C
分化液	上海碧云天生物科技有限公司	C0163M
一次性无菌针	汉医品牌		0.25毫米×13毫米
干燥机	徕卡	HI1220
电刺激器	常州英迪电子医疗器械有限公司	KWD-808I
电子天平	杭州优恒称重设备有限公司	HLD-6002
伊红Y染色液	蓝科生物科技	BS248
苏木精染液	珠海贝索生物科技有限公司	BA-4041
异氟烷	RWD生命科学有限公司	R510-22-10
显微切片机	徕卡	RM2255
中性巴尔萨木	北京中山金桥生物科技有限公司	Zli-9555
石蜡包埋机	徕卡	HistoCore Arcadia H
SD大鼠	宁夏医科大学动物中心		8周龄，雄性，180-220克
幻灯片扫描仪	徕卡	Aperio LV1
小动物麻醉机	RWD生命科学有限公司	R500
旋转摇床	海门齐灵钟乐器制造有限公司	QL-902
保温垫	东莞宏达电子有限公司	45W-80X28CM