本研究结合行为学和影像学技术，对接受电针治疗后的骨关节炎小鼠进行多模态、纵向评估，包括软骨染色和国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分。
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摘要
摘要
骨关节炎是一种常见的慢性退行性关节疾病，常累及膝关节，导致疼痛、肿胀、僵硬和功能受限。滑膜炎症及关节周围肌肉的变化参与了疾病的起始与进展。临床证据表明，电针治疗可能减轻局部炎症并调节软骨代谢。本研究通过手术破坏小鼠内侧半月板以诱导膝骨关节炎，并采用包括转棒试验、超声、红外热成像、磁共振成像及组织学染色在内的多模态方案评估干预效果。通过纵向监测关节腔体积和皮肤温度，并在实验终点采用磁共振成像及番红O-固绿染色，评估关节周围肌肉信号变化和软骨病理改变。电针治疗与运动功能改善、关节肿胀减轻、局部皮肤温度升高、磁共振图像上关节周围肌肉信号改变减轻以及软骨退变评分降低相关。这些结果支持利用该多模态评估方案在临床前小鼠模型中评价电针治疗的相关效应。
引言
膝骨关节炎（KOA）是全球最常见的骨关节疾病，估计影响约2.5亿人1。其病理特征包括进行性软骨退变和滑膜增生，临床表现为疼痛、肿胀和功能障碍2,3。
骨关节炎（OA）长期以来被认为是一种非炎症性关节疾病，但现在已认识到其具有炎症成分，大多数患者可检测到滑膜炎。人们认为，促炎性细胞因子如白细胞介素（IL）-1β 和 IL-18，以及活性氧和生物力学应力共同参与了病理过程4。炎症常伴随局部血流增加，临床上表现为发红、发热和肿胀5。除了加速软骨降解和功能衰退外，炎症可能在疾病早期阶段尤为活跃。因此，长期监测炎症状态有助于制定针对潜在机制的治疗策略，并实现分期适应性管理6,7。先前利用超声（US）对小鼠膝关节进行扫描的研究发现，在胫骨和股骨髁之间存在一个三角形区域。组织学分析证实，该区域包含滑膜、半月板、脂肪垫等软组织，以及充满滑液的空间。该超声可检测到的区域被定义为关节内体积，涵盖上述软组织区域8。
此外，温度是一个关键的物理参数，能够直接反映关节炎症的发展进程。局部温度升高是炎症的四大主要体征之一，而热成像技术能够精确检测并量化这些温度变化9。最近一项系统性综述强调了皮肤表面温度与炎性和退行性关节疾病之间的相关性10，进一步证实了红外热成像技术（IRT）在关节炎研究和临床管理中的应用价值11。此外，IRT 可提供与组织灌注和代谢活性相关的间接测量指标，可能有助于监测治疗反应。
在本研究中，我们结合转棒实验、超声（US）、红外热成像（IRT）和磁共振成像（MRI）来评估电针（EA）在骨关节炎（OA）小鼠模型中的作用。这种多模态方法能够同时评估运动功能、关节形态、温度变化以及软组织炎症，而这些指标仅通过组织学无法获得。重要的是，该技术组合可在几乎不增加成本和工作量的前提下，提供跨越多个生物学层面的互补信息。因此，该方法特别适用于需要长期重复、无创监测的临床前研究，尤其是在所研究的干预措施预期仅产生轻微效应，或反应的时间进程尚不明确的情况下。据我们所知，本研究是首次采用这种特定技术组合——涵盖关节腔体积、肌肉炎症和局部温度——来追踪电针对骨关节炎的治疗反应。我们所描述的实验方案具有实用性和可重复性，相信可为未来类似实验条件下开展纵向、实时疗效评估提供有价值的参考。
方案
所有实验程序均经过吴创生物技术（上海）有限公司实验动物伦理委员会审查和批准（伦理批准号：WTPZ20260209001）。本研究中使用的小鼠均为8周龄、体重约20 g的C57BL/6小鼠，购自商业供应商（见材料表）。实验共包括24只小鼠。在适应环境1周后，将动物随机分配，每组6只，共分为四种实验条件：假手术组、内侧半月板失稳（DMM）组、假针刺组（SA）和电针治疗组（EA）。实验所用动物数量未通过前瞻性样本量计算确定，而是参考既往使用类似骨关节炎模型和终点指标的电针研究，并遵循3R原则确定各组样本量。
1. 术前护理与建模
注意：所有建模操作均由经验丰富的手术技术人员完成。动物在加热垫上恢复意识后，方可放回笼中。
- 实验开始前，将小鼠在实验环境中适应至少7天。
- 手术前对所有外科器械进行灭菌。彻底消毒手术区域。
- 打开气体麻醉设备。将小鼠放入诱导室，使用2–3%异氟烷诱导全身麻醉，持续5分钟。
- 麻醉诱导完成后，将小鼠转移至手术台。通过麻醉面罩持续输送1–1.5%异氟烷以维持麻醉状态，直至手术操作结束。
- 将小鼠置于仰卧位，膝关节朝上。确保体位稳定，并充分暴露手术区域。使用DMM在右侧后肢建立模型。12对于假手术组，在相同位置做切口，然后缝合关闭。
- DMM 手术过程
- 做一个1 cm纵向的内侧髌旁切口以暴露膝关节。
- 通过1.5.1.1步骤中创建的内侧旁髌骨切口，在关节囊上做一个纵向切口。使用镊子将关节囊与周围组织充分分离。然后用左手托住后肢远端足部，避免施加过大压力，同时用镊子将髌骨和髌韧带向侧方移位，从而暴露膝关节。在整个操作过程中应小心处理足部，防止损伤。
注意：充分松解关节囊可使髌骨在最小外力下发生移位。 - 手术过程中向关节软骨表面滴加无菌生理盐水，以防止干燥。
- 在内侧股骨髁与内侧胫骨平台之间的间隙中定位内侧半月板。从其外侧开始，沿内侧半月板胫骨韧带向其在胫骨髁间隆起处的附着点进行追踪。用手轻轻固定后肢足部，使用10号手术刀片横断该韧带，注意避免接触内侧半月板下方的软骨。 注意：确保不损伤关节软骨及其他韧带。在多数情况下，需将覆盖其上的脂肪垫推开但无需切除，以暴露韧带。
- 近似缝合膝关节囊边缘，并使用6-0可吸收缝线固定。
- 使用6-0丝线缝合皮肤12.
- DMM 手术过程
- 术后护理：在手术部位滴加一滴0.25%布比卡因以实现局部镇痛，并让小鼠自由摄取食物和饮水。
注意：麻醉期间，保持氧气流速在 0.5–1 NL/min 范围内。麻醉成功通过翻正反射消失、脚趾夹捏无回缩反应以及呼吸稳定且规律来确认。整个手术过程中，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）作为灌洗液以维持软骨的水合状态。关节囊缝合所用可吸收缝线及皮肤缝合所用丝线的具体尺寸和规格详见于 材料清单.
2. 电针治疗
注意：SA组和EA组的干预在模型建立后1周开始（图1A）。两组均每隔一天治疗一次，每周三次，每次持续15分钟，共持续4周。Sham组和DMM组在相同时间表下接受相同的麻醉和固定操作，但不进行针刺或电刺激。所有操作人员在实验前均接受了培训，以确保在穴位选择、进针角度和深度方面的一致性。
- 将小鼠放入诱导室，使用异氟烷麻醉后将其取出。
- 在整个电针治疗过程中，使小鼠保持仰卧位，并持续吸入异氟烷（100% O₂中浓度为1.5–2.0%）以维持麻醉状态，确保小鼠处于安静且稳定的状态。
- 准确定位小鼠的穴位。将两根一次性无菌针头（0.16 mm × 25 mm）插入下肢的ST36（足三里）和SP10（血海）穴位，进针深度为5 mm13（图1B）。
注意：ST36位于胫骨前结节外侧1 mm、腓骨头下方3 mm、膝关节正下方。SP10位于大腿内侧，在膝关节屈曲时位于髌骨上内侧缘上方3 mm处的股四头肌内侧隆起处。- 在假电针（SA）组中，将针头浅刺入非穴位区域（邻近区域，非ST36或SP10），进针深度约为1 mm，并连接电针仪但不给予电流刺激14。
注意：因此，SA组与电针（EA）组在针刺位置、进针深度以及无电刺激方面存在差异，但在其他所有操作参数上保持一致。与DMM组相比，SA组接受浅层非穴位针刺并连接设备但无电流输出，而DMM组仅接受麻醉和固定处理。
- 在假电针（SA）组中，将针头浅刺入非穴位区域（邻近区域，非ST36或SP10），进针深度约为1 mm，并连接电针仪但不给予电流刺激14。
- 将针头连接至电针仪，设置刺激参数为2/100 Hz、2 mA，以引起轻微的肌肉震颤。从造模后第7天开始，每周进行3次、每次15分钟的电针刺激，持续4周。
- 治疗结束后，将小鼠置于加热垫上，待其恢复意识后放回笼中。
3. EA 疗效的动态评估
注意：所有评估（转棒实验、超声检查、红外热成像、磁共振成像以及OARSI评分）均由对分组情况不知情的研究人员进行，在完成全部数据分析前，分组信息均被隐藏。图像采集和数据分析由不同人员分别完成，组织学评估由两名对治疗分组不知情的病理学家独立进行。所有评估人员均未参与动物分组或电针干预操作。
- 转棒疲劳试验
- 在正式测试前，预先训练小鼠以熟悉实验装置。
- 在正式测试期间，将每只小鼠单独放置于转棒上，转棒以每分钟4转的速率加速，直至小鼠掉落。
- 及时记录每只小鼠在转棒上的停留时间。每次试验后，为每只小鼠留出30 min的间隔时间，并计算三次重复试验的平均值。
注意：在建立骨关节炎模型前以及电针治疗结束后，使用转棒实验评估运动协调性。为减轻术后疼痛，手术后第一周内减少转棒实验的数据采集。
- 小动物超声检查
注意：超声成像和关节腔边界确定的逐步操作流程如以下所示 图2.- 在正式数据采集之前，将小鼠放入麻醉室直至其失去运动功能，然后使用脱毛膏去除右膝关节的毛发。去除小鼠毛发时应尽量轻柔，用温水轻轻擦拭，以尽量减少对小鼠的刺激。
注意：分析过程中需保持盲法，仅显示动物编号和时间点，直至完成全部体积测量并揭示分组信息以进行统计分析。 - 打开超声系统，安装小动物超声探头，并设置合适的小鼠检查程序。同时，将小鼠放入麻醉持续给药的笼子中。
- 麻醉完成后，将小鼠转移至控制平台，通过鼻罩给予异氟烷吸入麻醉。将小鼠头部朝向远离操作者、尾部朝向操作者的方向放置。
- 屈曲膝关节，固定小鼠，并在髌韧带表面的皮肤上涂抹超声耦合剂。
- 调整探头并将其放置，使其与膝关节平行。
- 设置 扫描距离 到 4 mm 以及 步长 到 0.04 mm根据解剖位置在图像上定位关节腔。探头扫描过程中不要移动动物。
- 获取图像。识别关节腔：即股骨、胫骨以及其上方的皮肤和肌肉之间具有清晰边界的三角形区域。
- 命名并保存扫描结果，然后在保持原始文件夹结构的同时将其导出到分析计算机。
- 使用软件分析膝关节腔容积。输入 研究 模块，并单击 导入 功能
- 浏览并选择数据文件夹，勾选要导入的数据文件，然后双击打开。
- 在 显示 模式，选择 图像处理 | 加载至三维 | 横截面视图 | 体积测量 | 开始 按顺序。
- 使用鼠标滚轮或切片滑块从近端向远端滚动切片，找到关节腔首次出现的切片（通常表现为股骨、胫骨以及覆盖的皮肤和肌肉组织之间边界清晰的三角形区域）。
- 从关节腔首次出现的切片开始描记。单击鼠标左键以开始绘制轮廓。
- 逐点沿关节腔边缘描记，绘制闭合轮廓，直至关节腔完全消失。
- 点击 完成；系统将生成一个三维分割体积，并输出体积测量结果。
- 选择所需的文件类型，将图像导出为TIFF格式的图像区域文件（.tif）。
- 在正式数据采集之前，将小鼠放入麻醉室直至其失去运动功能，然后使用脱毛膏去除右膝关节的毛发。去除小鼠毛发时应尽量轻柔，用温水轻轻擦拭，以尽量减少对小鼠的刺激。
- 小型动物红外热成像
注意：在骨关节炎小鼠模型中，分别于术前1天、术后7天以及治疗结束时进行测量。治疗后6小时在温度受控的房间（22–24 °C，小鼠在成像前适应环境30分钟。- 将动物仰卧放置，后肢伸展，并用胶带将四肢固定在实验台上，以确保膝关节暴露一致。将小鼠放入诱导室，持续给予异氟烷直至完全麻醉。
- 将麻醉后的小鼠仰卧位固定于手术台上，并保持恒定的环境温度。
- 轻轻抓住小鼠的后肢以伸展右膝关节，然后使用红外热成像仪捕捉图像并测量该区域的温度。
- 使用默认皮肤发射率（0.98）。在深度麻醉后3分钟采集图像。将膝关节感兴趣区域（ROI）定义为股骨-胫骨关节的内侧关节线，踝关节ROI定义为胫距关节的背侧表面。由一名经过培训的操作员根据这些解剖标志手动勾画所有ROI。
- 使用设备配套软件分析图像，读取膝关节及周围皮肤的温度数据，并在踝关节和膝关节处设置测量控制点，这些位置的温度梯度会降低。
- 小动物磁共振成像
注意：EA治疗后，采用小动物MRI评估各组小鼠膝关节局部炎症。- 将小鼠放入麻醉盒中进行麻醉。待其失去运动功能后，将脱毛膏涂抹于双侧膝关节。
- 1分钟后，用温水浸湿的纱布擦去脱毛膏，完成双侧膝关节的脱毛。
注意：尽可能去除小鼠的毛发，并在麻醉状态下进行采集。 - 使用适合小鼠体型的机架设置适当的实验方案。
- 确保定位装置使用三平面快速梯度回波序列（TR/TE = 50/3 ms，视野（FOV）= 30 × 30 mm，层厚1 mm）以使膝关节位于图像中心；采用T2加权快速自旋回波（T2WI）序列扫描小鼠膝关节。
- 使用以下扫描参数：重复时间（TR）2,500 ms，回波时间（TE）8 ms，视野（FOV）20 × 20 mm，矩阵为256 × 256，层厚0.5 mm，无层间距，连续10层，覆盖从股骨髁至胫骨平台的区域；单次扫描预计持续时间约为8分钟20秒。
- 检查 获得的T2加权图像，以观察膝关节软骨、滑膜、关节腔及周围软组织的形态学变化，以及 评估 关节积液、滑膜增厚和局部炎症。
- 将小鼠置于检查架上，通过面罩使用异氟烷诱导吸入麻醉，并用医用胶带固定四肢，确保膝盖始终向上。
- 将机架滑入磁共振成像仪进行成像。
- 在三平面定位像上，确认膝关节间隙与冠状面平行，容积中心与关节间隙对齐，并将肠袢或含气腔隙排除在扫描视野外，以避免磁敏感伪影；若定位不准确，需重新定位并重新扫描。
- 将采集的多回波T2加权图像以DICOM或NIfTI格式导出，用于定性评估。
- 通过目视评估膝关节及关节周围软组织内高信号区域的信号强度和分布情况，并基于这些导出的图像比较各组之间的炎性信号。
4. 病理学与形态学观察
- 小鼠膝关节的固定与切片
- 将小鼠的两个膝关节样本用10%多聚甲醛固定48 h。随后将样本浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中30 min并冲洗。
- 吸去多余水分后，立即将样本转移至新配制的脱钙液（pH 7.2–7.4）中，并每3天更换一次溶液；
- 继续脱钙2周，用流水冲洗样本，然后浸入75%乙醇中2小时。
- 在组织处理仪中进行自动梯度脱水，持续18 h。
- 脱水后，将样品置于预热的石蜡中，在石蜡包埋机中浸渍2 h，然后进行包埋；
- 在膝关节矢状面包埋过程中，将内侧关节面朝下放置，以便首先切到该表面。
- 将组织块安装在切片机上，并进行连续切片 4 µm达到半月板中部分离后，连续收集21个切片。
- 在展片器上铺展切片。用镊子将标本在水面分开，并用盖玻片捞取，每张盖玻片收集两个标本；
- 将载玻片平放在载玻片烘干仪中超过1小时，以确保水分完全蒸发。将载玻片放入样品盒中，并在烘箱中进行脱蜡处理 60 °C 孵育8小时。留作后续使用。
注意：所有多聚甲醛固定液、脱钙液和乙醇洗涤液必须作为危险废物收集，并按照机构规定进行处理。
- 番红O-快绿染色
- 将未染色切片置于染色架上，放入烘箱中加热5 min。在此期间，在通风橱中配制染色液。
- 让切片恢复至室温，然后常规脱蜡至水。
- 将切片转移至湿盒中，用新鲜配制的Weigert's溶液（A液 + B液）染色5分钟。
- 用清水冲洗，每次1秒，重复3次。
- 用乙醇中的1%盐酸分化15秒，然后用蒸馏水冲洗10分钟。
- 用快绿染液染色 4 分 55 秒。
- 用1%乙酸溶液快速冲洗切片10-15秒，以去除残留的快绿，然后自然晾干。
- 浸入藏红染液 染色 4 分 35 秒。
- 用95%乙醇快速脱水3-5秒，随后用无水乙醇洗涤2次，每次1分钟。
- 用二甲苯透明，中性树胶封片，置于通风橱中4小时以挥发二甲苯。
- 使用全片扫描仪预览并扫描该切片。
注意：本研究中使用的二甲苯、酸性乙醇、乙酸、多聚甲醛以及染色液（包括Weigert's溶液、快绿和沙黄O）均为危险物质。所有操作均应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备，包括腈类手套、实验服和护目镜。危险废物（包括使用过的试剂和洗涤液）必须分类处理，二甲苯废物应与水性废物分开，置于指定容器中，并按照机构规定进行处置。
5. 统计学分析
- 将连续数据以均值报告 ± 标准差（SD），另有说明者除外；OARSI 评分以中位数（第25百分位数，第75百分位数）表示。
- 对于以均值报告的结果 ± SD，采用单因素方差分析（ANOVA）进行多组间比较，随后进行Tukey事后检验。OARSI评分采用Kruskal-Wallis检验进行分析，随后进行 事后检验 使用单侧Mann-Whitney检验对两组间进行两两比较15.
- 考虑 P 数值 < 0.05 具有统计学意义"无内容可供翻译。" 表示无显著性差异。
结果
转棒实验显示，与DMM组相比，EA组的跌落潜伏期更长（P < 0.05），而SA组与DMM组之间差异无统计学意义（图1C 和 表1）。建模前，对膝关节进行纵向超声扫描（扫描距离为4 mm，步长为0.04 mm），结果显示各组之间关节腔体积无显著差异（图3A、B 和 表2）。建模后1周，三维重建结果显示，DMM组、SA组和EA组的关节腔体积均显著大于假手术组（P < 0.05），但DMM组、SA组与EA组之间的差异无统计学意义（P > 0.05）（图3A、C）。经过4周EA治疗后，EA组的关节腔体积显著低于DMM组（P < 0.05）（图3A、D），提示关节腔肿胀减轻。
红外热成像技术（IRT）是一种用于获取视场内焦平面温度信息，并以伪彩色形式显示表面温度分布的技术16。在建模前或建模后1周，各组之间的皮肤表面温度无显著差异（图4A-C 和 Table 3）。然而，在电针（EA）治疗后，DMM组的皮肤表面温度显著低于假手术组；相反，EA组的皮肤表面温度显著高于DMM组（图4A,D），表明EA与较高的局部皮肤表面温度相关，而SA则无此效应。
MRI图像显示，假手术组未见明显的关节周围肌肉信号异常，DMM组信号改变更为明显，电针组信号改变较轻，而SA组与DMM组的信号改变相似（图5A）。电针治疗后，取右侧膝关节，包埋于石蜡中，以4 µm厚度进行矢状面切片。切片采用番红O-快绿染色，并根据OARSI组织病理学评分系统进行分级。与假手术组相比，DMM组表现出更严重的关节软骨磨损和更高的OARSI评分。电针组的软骨退变程度较轻，OARSI评分低于DMM组（P < 0.05），而SA组与DMM组之间差异无统计学意义（图5B、C 和 Table 4）。
图 1：骨关节炎小鼠的实验时间线、针灸穴位示意图及转棒实验。（A）实验时间线。（B）针灸穴位示意图。（C）转棒实验。每组 n = 6。每只小鼠完成三次试验。数据以均值 ± 标准差表示。### 假手术组 vs DMM 组，P < 0.001；ns，SA 组 vs DMM 组，P > 0.05；** EA 组 vs DMM 组，P < 0.01。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：超声检查的逐步操作流程。（A）将小鼠放入麻醉诱导舱中进行麻醉。（B）在后肢涂抹脱毛膏。（C）均匀涂抹脱毛膏后，等待1分钟。（D）用纱布擦去多余的脱毛膏及脱落的毛发。（E）检查脱毛后的后肢。（F）在开始图像采集前，将小鼠重新放回麻醉诱导舱中进行麻醉。（G）在后肢涂抹超声耦合剂，并旋转探头直至其与后肢的长轴平行。（H）采集超声图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：骨关节炎小鼠小动物超声检查的代表性图像及定量结果。（A）术前、术后1周及电针治疗后的膝关节三维超声重建图像（扫描距离为4 mm，步长为0.04 mm）。比例尺 = 2 mm。（B）术前关节腔体积（每组n = 6）。（C）术后1周关节腔体积（每组n = 6）。（D）电针干预后关节腔体积（每组n = 6）。### 假手术组 vs DMM组，P < 0.001；ns，SA组 vs DMM组，P > 0.05；*** EA组 vs DMM组，P < 0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：骨关节炎小鼠的代表性红外热成像图及皮肤温度定量结果。 (A) 术前、术后1周及电针（EA）治疗后的下肢热成像图。每幅热成像图均使用红外相机软件的自动温度范围显示，因此各图之间的颜色不可直接比较。定量比较应依据B–D图中的散点图。(B–D) 感兴趣区域（ROI）在膝关节部位的定量皮肤温度分析，ROI定义为股胫关节的内侧关节线。(B) 术前下肢皮肤温度（每组n = 6）。(C) 术后1周下肢皮肤温度（每组n = 6）。(D) 电针干预后下肢皮肤温度（每组n = 6）。数据以均值±标准差表示。### 假手术组 vs DMM组，P < 0.001；ns，SA组 vs DMM组，P > 0.05；** EA组 vs DMM组，P < 0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：骨关节炎小鼠模型中关节周围肌肉信号改变的代表性 MRI 图像、膝关节组织学切片及定量结果。 （A）各组代表性 MRI 图像。（B）代表性番红O-快绿染色的膝关节切片。比例尺 = 1 mm。（C）OARSI 软骨病理评分（每组 n = 6）。OARSI 评分以中位数（P25，P75）表示。### 假手术组 vs DMM 组，P < 0.001；ns，SA 组 vs DMM 组，P > 0.05；** EA 组 vs DMM 组，P < 0.01。请点击此处查看该图的放大版本。
| 组别 | N | 第5周 |
| Sham | 6 | 101.300 ± 5.416 |
| DMM | 6 | 70.280 ± 3.363### |
| SA | 6 | 70.060 ± 7.796 |
| EA | 6 | 84.390 ± 9.504** |
| 注：### Sham 与 DMM 比较，P < 0.001；** EA 与 DMM 比较，P < 0.01。 | ||
表1：转棒实验（均值 ± 标准差；每组 n = 6）。 ### 假手术组 vs DMM组，P < 0.001；** 电针组 vs DMM组，P < 0.01。
| 组别 | N | 第0周 | 第1周 | 第5周 |
| 假手术组 | 6 | 2.029 ± 0.055 | 2.056 ± 0.071 | 2.061 ± 0.079 |
| DMM组 | 6 | 2.058 ± 0.068 | 2.591 ± 0.056### | 2.926 ± 0.088### |
| SA组 | 6 | 2.056 ± 0.045 | 2.592 ± 0.076 | 2.915 ± 0.112 |
| EA组 | 6 | 2.032 ± 0.059 | 2.548 ± 0.074 | 2.177 ± 0.110*** |
| 注：### 假手术组 vs DMM组，P < 0.001；*** EA组 vs DMM组，P < 0.001。 | ||||
表2：关节腔容积（均值 ± 标准差；每组 n = 6）。 ### 假手术组 vs DMM组，P < 0.001；*** 电针组 vs DMM组，P < 0.001。
| 组别 | N | 第0周 | 第1周 | 第5周 |
| 假手术组 | 6 | 35.517 ± 1.366 | 35.717 ± 0.546 | 35.650 ± 0.701 |
| DMM组 | 6 | 35.783 ± 1.292 | 35.033 ± 0.781 | 32.967 ± 1.223### |
| SA组 | 6 | 35.583 ± 1.780 | 35.283 ± 0.861 | 33.267 ± 0.501 |
| EA组 | 6 | 35.500 ± 1.510 | 35.417 ± 0.882 | 34.533 ± 0.929** |
| 注：### 假手术组 vs DMM组，P < 0.001；** EA组 vs DMM组，P < 0.01。 | ||||
表3：皮肤温度（均值 ± 标准差；每组 n = 6）。### 假手术组 vs DMM组，P < 0.001；** 电针组 vs DMM组，P < 0.01。
| 组别 | N | 第5周 | 中位数 |
| 假手术组 | 6 | 0.000 (0.000, 0.250) | 0 |
| DMM组 | 6 | 4.000 (3.000, 4.250)### | 4 |
| SA组 | 6 | 4.000 (3.000, 4.250) | 4 |
| EA组 | 6 | 2.500 (1.750, 3.000)** | 2.5 |
| 注：### 假手术组 vs DMM组，P < 0.001；** EA组 vs DMM组，P < 0.01。 | |||
表4：OARSI评分[中位数（第25百分位数，第75百分位数）；每组n = 6]。### 假手术组 vs DMM组，P < 0.001；** EA组 vs DMM组，P < 0.01。
讨论
膝骨关节炎（KOA）是一种进行性退行性疾病，目前的治疗干预措施在阻止其根本进展方面疗效有限17。肌肉功能受损和身体活动能力下降是临床症状严重程度的重要预测因素。因此，积极管理可调控的危险因素对于延缓KOA进展至关重要18。本研究采用多模态评估系统，证明在骨关节炎小鼠模型中，电针（EA）与运动功能改善、关节腔体积减小、局部皮肤表面温度升高、关节周围肌肉MRI信号变化减轻以及OARSI评分降低相关。
红外热成像（IRT）的结果进一步支持了这种整合性观点。术后1周时，各组间的皮肤温度无显著差异，包括假手术组，这可能反映了对手术创伤的普遍反应，其特征为短暂的血管收缩和表层水肿，暂时性地减少了皮肤表面的热量散发。相比之下，治疗后出现的显著温度差异表明，电针（EA）的抗炎作用和对微循环的调节作用是累积性的而非即时性的，只有在多次治疗后才显现出来。这些结果指标之间可能存在关联。关节腔肿胀通常反映了滑膜炎症和积液的程度，而局部微循环状态则与炎症过程中血管通透性的变化密切相关19。在本实验中，电针干预后关节体积的减小伴随着局部温度的升高。尽管红外热成像不能直接测量血流量，但这种同步变化提示，局部血流的增强可能有助于清除炎症介质，从而减少滑膜及周围肌肉中的炎性浸润。随后运动功能的改善可能源于肿胀减轻与炎症缓解的共同作用。总体而言，这些参数所观察到的变化似乎是相互关联的反应，而非孤立事件。这一模式提示，电针可能以整合的方式调节多种病理过程，而非通过单一机制发挥作用20。
与传统的终点组织学评估相比，本研究采用的多模态动态监测系统具有显著的实用优势。小动物超声成像能够对关节积液进行纵向、无创的追踪观察，且无需暴露于辐射，从而避免了终点组织取样所固有的个体间差异21。小动物磁共振成像（MRI）可补充超声检查，提供关节周围肌肉信号变化的详细可视化图像，从而实现对肌肉炎症的定性评估，而这是单独使用超声可能无法充分捕捉的信息。结合红外热成像技术（IRT）对局部皮肤温度进行实时测量，该方法可提供炎症消退情况的间接指标。这些成像技术的可及性使得在治疗过程中进行多次重复测量成为可能。除了符合“3R”原则外，这种纵向研究设计还可在每只动物体内进行多次观察，从而最大限度地减少个体间变异的影响。据我们所知，此前尚无评估针灸治疗骨关节炎（OA）的动物研究在同一实验框架中整合超声、磁共振成像、热成像、行为学测试和组织病理学分析。这种多层次的研究方法可在功能、形态和组织学等多个层面获得互补的数据，所提供的评估比单一终点指标更为全面。
应承认本研究存在若干局限性。首先，本研究依赖于动物实验的观察性数据，缺乏来自体外研究的机制性证据。目前尚不清楚电针（EA）是否激活了NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）/caspase-1/IL-1β信号通路。IL-1β和IL-18是滑膜和肌肉炎症的关键介质，其成熟过程依赖于NLRP3炎性小体的激活22。我们亦无法确定所观察到的循环改善是否与血管内皮生长因子（VEGF）或内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达水平的变化相关23。其次，我们仅采用了一种固定的电针参数（2/100 Hz），并作用于两个穴位（ST36和SP10）。不同参数设置或不同穴位组合是否可能产生更优效果，尚需进一步研究24。第三，所有影像数据均由同一名操作者采集。尽管这种方法保证了技术上的一致性，但未评估观察者间的可靠性，可能限制影像结果的普适性。第四，我们未设置仅接受束缚处理的对照组，因此难以完全区分麻醉、固定和操作处理的影响与电针治疗效应之间的差异。第五，假针刺（SA）操作被设计为最小化对照，以减少穴位特异性、深部组织影响及电刺激效应的干扰。然而，真针刺与假针刺在进针深度上的差异，使我们无法单独分离出深度因素的作用。因此，本研究结果应被理解为完整电针方案与最小化假操作之间的比较，而非对电刺激本身进行的严格独立评估。第六，相机距离、成像角度及感兴趣区域（ROI）的绝对面积未被正式记录，构成一项技术局限。最后一项局限在于对每个时间点分别使用了独立的方差分析（ANOVA），忽略了重复测量相关性及时间与组别间的交互作用，从而降低了对动态变化的检测敏感性。
综上所述，在DMM诱导的小鼠KOA模型中，电刺激（EA）与抗炎效应及功能改善相关。尽管该方案存在一些局限性，例如不同成像模式间分辨率不一、超声（US）和红外热成像（IRT）对操作者的依赖性、磁共振成像（MRI）成本较高，以及重复测量可能带来的应激反应，但该方案仍可作为纵向多模态评估的可行平台。该集成系统为临床前评价提供了框架。未来的研究应优化电刺激参数，并利用类器官、器官芯片和人工智能（AI）平台来阐明其作用机制并指导个体化治疗25,26。此外，还需改进假刺激对照、建立标准化操作流程，并延长随访时间，以增强向临床应用的转化能力。
披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本研究由上海市科技创新行动计划（23YF1447900，JMC）和国家自然科学基金（U23A20508，LQY；82575196，HSC；U24A6013，HX）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1% 乙酸溶液 | Solarbio | Cat# G1371 | 染色用分化/洗涤液 |
| 乙醇中的 1% 盐酸 | Solarbio | Cat# G1371 | 酸性乙醇分化液 |
| 7T 小动物 MRI | 上海辰光 | 7T MRI NOVAL | 小动物磁共振成像系统 |
| 针灸针（0.16 mm × 25 mm） | 无锡佳健医疗器械有限公司，中国无锡 | 批号 491226 | 无菌针灸针 |
| 粘附性载玻片 | 江苏世泰 | MH0662 | 组织切片用显微镜载玻片 |
| 无水乙醇 | 上海 Titan 科技有限公司 | 64-17-5 | 脱水用乙醇 |
| C57BL/6 小鼠 | 上海斯莱克实验动物有限公司 | https://www.slaccas.com/ | 实验动物 |
| 盖玻片 | 江苏世泰 | 未提供 | 组织切片收集与封片 |
| 脱钙液 | Serivebio | G1105-500ml | 骨与关节脱钙试剂，pH 7.2–7.4 |
| 电疗仪 | 苏州医疗用品厂有限公司 | SD-Z | 电针刺激仪 |
| 乙二胺四乙酸 | 上海 Titan 科技有限公司 | 60-00-4 | 螯合试剂 |
| Fiji (ImageJ) | 美国国立卫生研究院（NIH） | ImageJ 捆绑 64 位 Java 8 | 图像分析软件 |
| 纱布 | 维哲医疗 | 型号 A1：标准纱布垫（无菌） | 脱毛与清洁材料 |
| 脱毛膏 | VEET | 未提供 | 脱毛霜 |
| 红外图像分析软件 | FLIR | 版本未提供 | 红外热成像仪配套软件 |
| 红外热成像仪 | FLIR | 435-0007-03（早期批次） | 红外热成像系统 |
| 小动物吸入麻醉系统 | Matrx | 07149 | 小动物气体麻醉系统 |
| 异氟烷（吸入麻醉剂） | RWD | 217140901 | 吸入麻醉剂 |
| 耐适康医用防水弹性胶带（3.81 cm × 4.57 m） | Naisikang™ | 732 | MRI 检查时肢体固定材料 |
| 改良藏红 O-快绿染色试剂盒（骨组织用） | Solarbio | Cat# G1371 | 软骨与骨组织染色试剂盒 |
| 持针器 | RWD | F21001-12 | 术中夹持与缝合工具 |
| 中性树脂封片介质 | biosharp | 23338664 | 组织学封片介质 |
| 氧气 | 未提供 | 未提供 | 吸入麻醉载气 |
| 石蜡包埋机 | LEICA | EG1150C | 石蜡包埋系统 |
| 石蜡切片机 | LEICA | RM2235 | 旋转式切片机 |
| 石蜡 | epredia | 151534 | 包埋介质 |
| 多聚甲醛 | 国药集团化学试剂有限公司 | 80096618 | 组织固定剂 |
| PBS | Servicebio | G0002 | 磷酸盐缓冲液 |
| 转棒仪 | Panlab | LE8205 | 转棒疲劳测试系统 |
| 小动物超声成像平台 | Fuji | Vevo 3100 | 小动物超声系统 |
| 氢氧化钠 | 上海 Titan 科技有限公司 | G19852H | 实验室试剂 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZ61 | 解剖显微镜 |
| 带线缝合针（6-0 可吸收缝线和 6-0 丝线缝线） | 宁波医用缝线有限公司 | 美容针 1/2 4X12 40 | 术后缝合 |
| 手术刀片（10#） | 杭州诺阳生物科技有限公司 | 20090120 | 内侧半月板韧带切开 |
| 组织脱水机 | LEICA | TP1020 | 全自动组织处理仪 |
| 组织烘片机 | LEICA | HI1220 | 载玻片烘片机 |
| 组织包埋盒 | 江苏世泰 | REF31050102W | 包埋耗材 |
| 展片仪 | LEICA | HI1210 | 切片展平系统 |
| 超声分析软件（Vevo Lab 3.1.0） | Optic | 版本 3.1.0 | 三维超声分析软件 |
| 超声耦合剂 | 胡庆余堂 | YY0299-2008 | 超声耦合凝胶 |
| 全片扫描仪 | Olympus | VS200 | 数字切片扫描系统 |
| 二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10023418 | 透明试剂 |
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