利用基于CD90的荧光激活细胞分选技术从甲状腺功能减退小鼠中富集垂体促甲状腺细胞

摘要

本方案描述了利用酶解离和基于CD90的荧光激活细胞分选技术，从甲状腺功能减退的成年小鼠垂体中富集促甲状腺细胞的方法，从而实现对富集后的促甲状腺细胞群体进行下游分子分析和短期原代培养。

摘要

促甲状腺激素细胞是位于腺垂体中的特化内分泌细胞，可分泌促甲状腺激素（TSH）并调节甲状腺功能。TSH 的分泌受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素正向调控，并受循环中的甲状腺激素负向调控。促甲状腺激素细胞仅占垂体细胞的一小部分（约 5%），这使得分离和研究其生理特性较为困难。本文中，我们描述了一种从甲状腺功能减退的成年小鼠中高效分离促甲状腺激素细胞的方法。通过诱导甲状腺功能减退以扩增促甲状腺激素细胞群体，随后对腺垂体进行酶解离，并利用 CD90.2 表面抗原进行荧光激活细胞分选。处理来自十二只小鼠的腺垂体可获得约 1.5 × 10⁶ 个 CD90.2 阳性细胞，这些细胞中 Tshb 信使 RNA 的表达显著富集。CD90.2 阳性细胞约占腺垂体细胞总数的 25%，其 Tshb 表达水平较 CD90.2 阴性细胞高出约五倍，表明促甲状腺激素细胞实现了显著富集。分离得到的细胞在短期培养中保持活性，并仍能对三碘甲腺原氨酸处理产生反应。该实验方案可实现小鼠促甲状腺激素细胞的富集与培养，适用于后续的分子、转录组、表观基因组及生理学分析。

引言

垂体是一种位于脑底部的内分泌器官，对激素稳态具有层级控制作用。其功能受下丘脑信号的调控，这些信号可刺激或抑制垂体激素的生成，而垂体激素又进一步调控外周内分泌器官的功能。该器官包含一群异质且动态变化的细胞，包括干细胞/前体细胞以及分化的激素分泌细胞¹。在生理应激或损伤情况下，垂体干细胞/前体细胞可被激活，进行自我更新，并分化为多种分泌激素的细胞谱系^2,3。结构上，垂体分为两个主要叶：后叶（PL），由垂体细胞和释放催产素与血管加压素的神经分泌末梢组成；前叶（AL），包含多种特化的内分泌细胞类型，可分泌生长激素、催乳素、促甲状腺激素（TSH）、促肾上腺皮质激素以及促性腺激素——卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）。垂体前叶还含有非激素分泌细胞类型，如S100B阳性的滤泡星形细胞、内皮细胞和周细胞，这些细胞支持内分泌功能^4,5,6。啮齿类动物在垂体中间叶中还额外含有黑素细胞^7,8。

对垂体功能、分化和发育的研究兴趣推动了多种旨在从啮齿类动物模型中分离成年垂体干细胞和祖细胞的实验方案的发展。大鼠在垂体生理学研究中被广泛使用，因为其较大的垂体腺体可获得更多的细胞数量，并在组织处理过程中提高细胞回收率^4,9。相比之下，从小鼠垂体中分离细胞仍存在技术上的挑战，且标准化的实验方案较为有限。近年来利用成年垂体干细胞/祖细胞聚集体建立的新方法为研究垂体发育和功能提供了有用的工具¹⁰；然而，这些系统尚无法实现对特定内分泌细胞群体的直接分离。在腺垂体的激素分泌细胞类型中，促甲状腺细胞是下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴的主要调控者，负责调控哺乳动物甲状腺激素（TH）的合成与分泌。促甲状腺细胞产生的TSH是一种异源二聚体糖蛋白，由一个共同的α亚基（由Cga基因编码，与FSH和LH共享）和一个β亚基（由Tshb基因编码）组成，后者赋予其受体特异性。这些细胞对循环中的三碘甲腺原氨酸（T3）和甲状腺素（T4）水平高度敏感。在甲状腺功能减退期间，当T3和T4水平降低时，促甲状腺细胞群体扩增；而在甲状腺功能亢进期间，则通过经典的负反馈机制发生收缩^11,12,13。

尽管促甲状腺细胞具有重要的生理功能，但由于它们仅占垂体前叶细胞的一小部分（约5%），并且与其他内分泌细胞群体具有相似的表型特征，因此难以开展研究。这种稀有性，加上缺乏可靠的体外模型，限制了对促甲状腺细胞调控机制及下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴控制的深入机制研究。TαT1 肿瘤细胞系是一种常用的类促甲状腺细胞模型¹⁴，但它并不能完全模拟生理状态下的反应；特别是由于其基础转录水平极低，T3依赖性的Tshb抑制作用往往难以评估¹⁵。因此，许多研究依赖于非促甲状腺细胞系，如表达不同Tshb构建体的HEK293、COS、CV1、GH3或JEG3细胞¹⁵。然而，这些属于异源表达系统，可能引入非生理性的调控干扰，包括由质粒骨架而非内源性转录机制驱动的效应。

本文介绍了一种从成年小鼠垂体中分离促甲状腺细胞的逐步实验方案，该方法改编自先前在大鼠中建立的方法⁹，并针对小鼠垂体体积更小、促甲状腺细胞含量更低的特点进行了优化。我们引入了多项关键改进，以提高表达Tshb的细胞得率，并确保下游分析的可靠性。本方案利用促甲状腺细胞表面抗原CD90的表达特性，该分子是促甲状腺细胞中富集的一种表面标志物。CD90（亦称为THY1）是一种糖基磷脂酰肌醇锚定的膜蛋白^16,17，可通过与整合素β2配体（ITGB2）的异型相互作用介导邻近细胞间的信号传导。尽管CD90通常与免疫细胞和神经细胞群体相关，但既往转录组学研究已发现Thy1在促甲状腺细胞中显著富集。THY1依赖的细胞接触性信号通路存在于多种细胞类型中，包括造血细胞、T细胞、成纤维细胞、内皮细胞和神经元，参与调控细胞黏附、迁移、凋亡、肿瘤抑制以及纤维化等过程^18,19,20。

重要的是，大鼠前 pituitary 的单细胞转录组分析发现，Thy1 是促甲状腺激素细胞中表达水平最高的黏附相关基因之一⁵，提示 THY1 是促甲状腺激素细胞中富集的一种表面标志物。此外，公开可获取的小鼠 pituitary 单细胞核糖核酸（RNA）测序数据集表明，Thy1/CD90 在促甲状腺激素细胞中表达富集^22,23。然而，其表达并非完全局限于该谱系，在 PIT1 谱系细胞的某些亚群（包括生长激素细胞和催乳激素细胞）以及类祖细胞群体中也可检测到表达。单细胞转录组研究已证实，属于 PIT1 谱系的 pituitary 细胞之间存在显著的转录重叠，其中包括鉴定出一种共同的 PIT1 祖细胞群体，能够分化为生长激素细胞、催乳激素细胞和促甲状腺激素细胞²⁴。类似地，Thy1/CD90 并不能特异性地识别促甲状腺激素细胞群体，但可用于富集小鼠的促甲状腺激素细胞。基于上述发现，我们在分离策略中采用靶向 THY1 的抗体，可在甲状腺功能减退诱导的细胞扩增后有效富集促甲状腺激素细胞，从而支持包括评估 T3 激素反应在内的功能研究。

该方案首先给野生型C57BL/6小鼠饲喂低碘饮食，并在饮水中添加甲巯咪唑（MMI）和高氯酸钾（KClO₄）以抑制甲状腺功能²⁵。该处理可在一周内诱导显著的甲状腺功能减退，并扩大垂体前叶中表达Tshb的促甲状腺细胞群体。在甲状腺功能减退条件下，促甲状腺激素（TSH）分泌细胞会发生显著的生理和形态学适应性改变，包括细胞增生、肥大、胞质内出现大量空泡、明显的胞质突起以及溶酶体增大，这些变化反映了细胞对缺乏甲状腺激素（TH）反馈调节的适应^26,27,28。因此，诱导甲状腺功能减退可作为扩增促甲状腺细胞群体的一种策略。

在诱导甲状腺功能减退症后，小鼠使用异氟烷麻醉，并用无 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 HEPES 缓冲盐溶液进行心脏灌注，以在组织解离过程中最大程度地维持细胞活性。取出前垂体后，经温和的酶消化处理获得单细胞悬液，并与藻红蛋白-花青素 7 标记的抗 CD90.2 抗体孵育，通过荧光激活细胞分选（FACS）富集促甲状腺激素细胞。标记的细胞随后被收集至培养基中用于短期培养，或收集至 TRIzol 中用于 RNA 提取。为验证该富集策略的有效性，检测了分选后细胞群中 Tshb 信使 RNA 的表达水平，结果显示 CD90 阳性细胞中该基因表达显著富集。该方法适用于小鼠中多种下游应用，包括基因表达谱分析、转录组和表观基因组分析、高通量检测以及原代细胞培养，为研究促甲状腺激素细胞的功能及其对下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴调控的细胞与分子机制提供了有价值的平台。

方案

本方案描述了从小鼠垂体前叶中分离促甲状腺细胞的方法，这些小鼠在至少1周的甲状腺功能减退诱导后，经新鲜解剖获取垂体。所有动物实验均遵循机构及美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的指南。德克萨斯大学医学分部的机构动物护理与使用委员会已批准所有动物实验操作。

在实验中，雄性和雌性小鼠被合并使用，因为未观察到甲状腺促素细胞产量或下游分析存在性别依赖性差异。每次实验大约使用12只小鼠，但若按比例增加所有试剂体积，最多可处理多达20只动物的较大群体。

成功的分离依赖于快速且一致的灌注、尽量缩短解剖时间、完全去除包膜（PL），以及原代细胞的高密度接种。建议在安乐死、灌注、垂体解剖与启动酶消化之间的总处理时间最长不超过6小时。细胞接种密度为每0.7 cm² 孔（即8孔玻璃腔室载玻片中一个孔的表面积）2.0–2.5 × 10⁵ 个细胞。为支持促甲状腺激素细胞的短期培养，细胞活力须至少达到95%。

用于制备单细胞悬液的所有试剂均在无菌条件下配制。操作台面使用70%乙醇进行消毒，解剖器械在使用前经高压灭菌，所有细胞培养准备工作均在生物安全柜中采用无菌技术进行。本方案适用于12只动物。当使用不同数量的小鼠时，所有试剂体积需按比例调整。所有试剂、耗材和设备请参见材料表。

在诱导甲状腺功能减退期间，小鼠饲养于20°C–24°C、相对湿度40%–60%的特定病原体排除环境中，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，可自由摄取食物和水。动物以每笼最多三只的方式群养于独立通风笼具中，笼内含有标准垫料和环境丰富化设施，包括筑巢材料和庇护所。通过检测肝脏碘甲腺原氨酸脱碘酶（Dio1）的表达水平确认甲状腺功能减退诱导是否成功。与甲状腺功能正常的对照小鼠相比，Dio1 信使RNA（mRNA）表达水平降低至少50%被视为甲状腺功能减退诱导成功的指标。

1. 在 C57BL/6 小鼠中诱导甲状腺功能减退症

注意：通过缺碘饮食和化学抑制甲状腺功能，在体内诱导甲状腺功能减退症，该过程需持续 7–10 天。实验设计见图 1A，甲状腺功能减退症诱导的验证结果见图 1B。

图 1。C57BL/6 小鼠甲状腺功能减退症的诱导。（A）用于在成年 C57BL/6 小鼠中诱导甲状腺功能减退症的实验流程示意图。小鼠在前垂体分离前，连续 7 天饮用含有 0.05% 甲巯咪唑（MMI）和 0.1% 高氯酸钾（KClO₄）的水，并同时喂食缺碘饮食。（B） euthyroid 和 hypothyroid 小鼠肝脏中 Dio1 信使核糖核酸（mRNA）表达的逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析。以亲环素 A（CyA）作为内参基因。数据以均值 ± 标准差（SD）表示（每组 n = 6）。采用 Student t 检验确定统计学显著性。**P < 0.001。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 制备 MMI/KClO₄ 饮用水
   1. 将 1 g MMI 和 2 g KClO₄ 溶解于 2 L 过滤水中。
   2. 在室温（20°C–25°C）下搅拌溶液 1 小时，直至完全溶解。
      警告：MMI 和 KClO₄ 为危险化学品。配制和操作过程中需佩戴手套、实验服及护目装备。
      注意：MMI 可抑制碘化物的有机化，而 KClO₄ 可通过钠-碘同向转运体阻断碘化物的摄取²⁵。每 2 天更换一次饮水溶液，以维持正确剂量，并减少来自垫料、食物残渣及微生物生长的污染。若未立即使用，应将溶液置于密闭避光容器中，在 4°C 下保存，最长可保存 14 天。
2. 诱导甲状腺功能减退
   1. 将 8 周龄的雄性或雌性 C57BL/6 小鼠在无碘饲养条件下，以每笼最多三只的方式分组饲养。
      注意：小鼠应饲养于特定病原体阴性环境中，温度为 20°C–24°C，相对湿度为 40%–60%，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗，自由摄食和饮水。使用独立通风笼具，内含标准垫料及环境丰富化设施（包括筑巢材料和庇护所）。在开始处理前，让动物适应环境 3 天。雄性和雌性小鼠应分开饲养。在本研究所描述的实验中， euthyroid 组包括六只雄性和六只雌性小鼠，分别饲养于不同笼中；hypothyroid 组也包括六只雄性和六只雌性小鼠，分别饲养于不同笼中。在细胞制备过程中，由于未观察到甲状腺促泌细胞产量或下游分析存在性别依赖性差异，可将同一处理组内的雄性和雌性小鼠 ALs 合并使用。
   2. 给予小鼠自由摄食无碘饮食，持续 7–10 天。
      注意：无碘饮食与 MMI/KClO₄ 处理应同时开始。
   3. 在整个处理期间，提供含 0.05% MMI 和 0.1% KClO₄ 的饮用水，自由饮用。
      注意：处理应持续至安乐死。在整个甲状腺功能减退诱导期间，每日监测体重、食物摄入量、饮水摄入量及临床表现。成功的甲状腺功能减退诱导通常表现为体重增长减缓，并出现活动减少或毛发 dull 等临床表现，与 euthyroid 对照组相比有明显差异。7 天和 10 天的诱导周期在甲状腺促泌细胞富集效率方面效果相当。

2. 心脏灌注与动脉韧带解剖

注意：为最大限度保持组织活性并在垂体分离过程中保护细胞完整性，每只小鼠的操作时间应控制在约15分钟内。

1. 准备灌注和收集溶液
   1. 制备不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HEPES 缓冲盐溶液（HBSS）
      1. 将 667 mL 的 0.9% NaCl、20 mL 的 1 M HEPES 和 313 mL 的双蒸水（ddH₂O）混合，配制 1 L 自制的不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS。
      2. 将溶液高压灭菌，并于 4°C 保存至使用。
   2. 制备含肝素的不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS
      1. 向 50 mL 自制的不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS 中加入 27 µL 依诺肝素钠（100 mg/mL 储存液）。
   3. 制备收集培养基（CM）
      1. 将 440 mL DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）、50 mL 热灭活胎牛血清（FBS）、4 mM L-谷氨酰胺和 10 mL 1 M HEPES 混合，定容至 500 mL。
      2. 使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，4°C 保存，最长可保存 1 个月。
         注意：储存前应在生物安全柜中分装为 50 mL 等份，以减少污染风险。
      3. 使用前将 CM 预热至 20°C–25°C。
   4. 灭菌解剖器械
      1. 使用 75% 乙醇对剪刀、镊子、尖头镊、持针器、虹膜镊、手术勺和钝头探针进行灭菌处理。
         注意：乙醇灭菌后，需让器械在空气中完全干燥后再接触组织。
2. 进行心脏灌注
   1. 使用 100% 氧气输送的异氟烷对小鼠进行深度麻醉。先在麻醉诱导舱中以 5% 异氟烷诱导麻醉，随后通过鼻罩以 3% 异氟烷维持麻醉，同时持续监测并使用废气清除系统。
      警告：异氟烷麻醉操作应遵循机构安全指南，并使用适当的废气清除系统，以尽量减少吸入暴露风险。
   2. 通过夹捏脚趾测试，确认足底回缩反射消失，以判断麻醉完全。
   3. 用 75% 乙醇喷洒动物体表，并将其置于收集盘内的灌注台上。
   4. 固定四肢，暴露腹腔区域。
   5. 小心打开胸腔，避免损伤主要器官和大血管。
   6. 沿肋骨剪开，形成胸壁瓣，将瓣膜翻向头部，并用止血钳固定。
   7. 用夹子固定心脏，并将 23 号针头插入左心室心尖。
   8. 使用硅胶管将针头连接至蠕动泵。
   9. 开始以室温维持的含肝素且不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS 进行灌注。
   10. 灌注开始后立即切开右心房，以利于液体引流。
   11. 以 3 mL/min 的流速持续灌注 5 分钟。
       注意：通过观察肝脏明显变苍白，确认灌注成功。
3. 分离前叶（AL）
   1. 灌注结束后立即对小鼠断头。
   2. 使用精细解剖剪和镊子去除头皮和颅骨，暴露脑组织。
   3. 将手术勺插入脑组织与颅骨之间。
   4. 轻柔抬起脑组织，切断视交叉。
   5. 在体视显微镜下，使用精细镊子去除覆盖垂体的薄层脑膜（硬脑膜）。
   6. 小心解剖并弃除后叶（PL），如 图 2A 所示。
      注意：前叶（AL）为位于前端的较大粉红色组织；后叶（PL）为位于背侧的较小白色半透明组织。
   7. 使用钝头探针修剪周围结缔组织和残留的脑膜，以改善对前叶的暴露。
   8. 用钝头镊夹取前叶，并转移至含有 1.8 mL 收集培养基（CM）的 15 mL 聚丙烯管中。
      注意：将 12 只动物的前叶合并至同一收集管中。
   9. 所有解剖完成前，将样品置于室温保存。
      注意：组织采集至开始酶消化之间的时间不得超过 3 小时，以尽量减少细胞活力的损失。
4. 确认甲状腺功能减退诱导成功
   1. 从小鼠中采集少量肝脏样本（约 50 mg）。
   2. 通过实时逆转录聚合酶链反应定量检测肝脏中 Dio1 mRNA 的表达水平，并与未经处理的正常甲状腺功能对照组进行比较（图 1B）。
      注意：若肝脏 Dio1 表达水平较正常甲状腺功能对照组降低至少 50%，则定义为甲状腺功能减退诱导成功。Dio1 表达水平与循环甲状腺激素（TH）水平呈正相关²⁹；因此，Dio1 表达降低可证实甲状腺功能减退诱导成功。
5. 重复组织采集
   1. 重复步骤 2.2–2.4，直至收集到 12 只小鼠的前叶组织。
   2. 立即进入步骤 3。

图2．从小鼠前垂体制备单细胞悬液。（A）工作流程图，展示前叶（AL）的解剖、酶解离以及为荧光激活细胞分选（FACS）制备单细胞悬液的过程。该流程包括去除后叶、胶原酶消化、胰蛋白酶–乙二胺四乙酸（EDTA）消化，以及FACS分析前的过滤步骤。（B）正常甲状腺与甲状腺功能减退小鼠前垂体解离细胞的活率染料染色及自动细胞计数代表性图像。图中显示总细胞产量和活细胞浓度。比例尺 = 200 µm。（C）组织解离并为后续FACS分析做准备后，前垂体细胞直径的分布情况。请点击此处查看该图的放大版本。 

3. 小鼠AL制备单细胞悬液

注意：请在约60分钟内完成此操作，以从前部垂体组织中制备单细胞悬液。

1. 准备酶消化溶液
   1. 制备 2% 胶原酶溶液
      1. 将 100 mg 来自 Clostridium histolyticum 的胶原酶（>125 胶原酶消化单位/mg 固体）溶解于 4.9 mL ddH₂O 中。
      2. 加入 100 µL 1 M HEPES，终体积为 5 mL。
      3. 使用 0.22 µm 滤器对溶液进行灭菌。
      4. 将溶液分装为每份 200 µL，于 −30°C 保存，最长可保存 2 个月。
         注意：避免反复冻融。解冻后的胶原酶分装液不得重复使用。
   2. 制备 0.25% 胰蛋白酶–乙二胺四乙酸（EDTA）
      1. 将 1 mL 0.5% 胰蛋白酶–EDTA 与 1 mL 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS 混合。
      2. 将溶液于 4°C 保存至使用前。
         注意：稀释后的胰蛋白酶–EDTA 溶液应在配制当天使用。不得储存或重复使用稀释后的胰蛋白酶–EDTA 溶液。
2. 进行胶原酶消化
   1. 向收集的 AL 组织中加入 200 µL 2% 胶原酶溶液。
   2. 使用配备低吸附枪头的 P1000 移液器轻轻吹打混匀组织。
   3. 将悬液于 37°C 水浴中孵育 15 分钟。
      注意：孵育期间保持管盖关闭，以尽量减少污染。
   4. 孵育期间每 5 分钟轻轻敲击管壁一次。
3. 进行脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）消化
   1. 直接向悬液中加入 5 µL DNase I（1 U/µL），无需去除上清液。
   2. 轻轻敲击管壁 10 次以混匀溶液。
   3. 将悬液于 37°C 孵育 5 分钟。
4. 沉淀组织
   1. 于室温下以 100 × g 离心 5 分钟。
   2. 使用 1 mL 移液器小心去除上清液。
      注意：去除上清液时，保留约 50 µL 液体在沉淀上方，以尽量减少细胞损失。
5. 进行胰蛋白酶消化
   1. 向沉淀中加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶–EDTA。
   2. 于 37°C 孵育 10–15 分钟，直至无可见完整组织碎片残留。
      注意：孵育时间不得超过 15 分钟，以避免过度消化组织并降低细胞活力。
6. 终止酶消化并解离组织
   1. 加入 2 mL CM 以终止胰蛋白酶消化。
   2. 使用设定为 1 mL 的移液器，轻柔地上下吹打 10–20 次，直至无可见组织碎片残留。
      注意：机械解离过程中应使用低吸附移液枪头。合格的单细胞悬液应为均匀、低黏度的悬液，主要由单个细胞组成，可见聚集体或碎片极少（通过台盼蓝染色排除法显微镜检查，聚集体占比 ≤5%–10%）。
7. 收集单细胞悬液
   1. 于室温下以 100 × g 离心 5 分钟。
   2. 小心去除上清液。
   3. 立即进入第 4 步。
      注意：建议在制备单细胞悬液后 15 分钟内开始染色，并尽可能在 1 小时内完成细胞分选。在此期间应将细胞置于冰上，以尽量减少活力损失。

4. 荧光激活细胞分选染色

注意：为分离的垂体前叶细胞进行CD90阳性细胞的流式细胞分选（FACS）染色时，该操作应在约60分钟内完成。

1. 制备细胞悬液
   1. 向细胞沉淀中加入350 µL染色缓冲液，该缓冲液由含2% FBS和0.09%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS, 1×）组成。
   2. 使用配有低吸附枪头的P1000移液器轻轻吹打10次，使沉淀充分重悬，获得单细胞悬液。
   3. 将悬液转移至1.5 mL低吸附微量离心管中。
2. 测定细胞浓度和活力
   1. 从悬液中取出5 µL样品用于细胞计数。
   2. 将该样品与5 µL活率染料混合。
   3. 将10 µL混合液加入自动细胞计数仪中。
      注意：当活率染料排除法测定的细胞活力≥85%，且观察到碎片和细胞聚集体最少时，方可进行FACS分析。
   4. 确认正常甲状腺样本的总细胞浓度约为1 × 10⁷ 个细胞/mL，甲减样本为2 × 10⁷ 个细胞/mL（图2B）。解离后细胞大小分布见图2C。
3. 制备补偿对照
   1. 将50 µL细胞悬液转移至300 µL染色缓冲液中。
   2. 将混合液分装为三份，每份100 µL，分别置于三个独立的1.5 mL微量离心管中。
   3. 制备以下对照：(i) 未染色对照，(ii) 仅碘化丙啶（PI）染色对照，(iii) 仅藻红蛋白-花青素7（PE-Cy7）标记的CD90.2抗体染色对照。
4. 细胞染色
   1. 向300 µL细胞悬液中加入3 µL PE-Cy7标记的抗CD90.2抗体。
      注意：抗体浓度经前期滴定实验确定，最终1:100稀释度可在阳性与阴性细胞群之间实现最佳分离，同时最小化背景染色。
   2. 向CD90.2补偿对照管中加入1 µL抗体，使其最终稀释度为1:100。
   3. 将所有样品置于冰上避光孵育30分钟。
      注意：孵育期间每10分钟轻柔混匀一次，以确保染色均匀。
5. 洗涤染色后的细胞
   1. 向每管中加入1 mL预冷的染色缓冲液。
   2. 在室温下以210 × g离心5分钟。
      注意：如有条件，关闭离心机刹车，以减少减速过程中对细胞沉淀的扰动。
   3. 小心移除并弃去上清液。
6. 重悬染色后的细胞
   1. 将主细胞悬液重悬于300 µL染色缓冲液中。
      注意：在分选前立即加入碘化丙啶（PI），使其终浓度为1 µg/mL。
   2. 将每个补偿对照管中的细胞重悬于100 µL染色缓冲液中。
7. 过滤细胞悬液
   1. 在分选前，立即通过装有35 µm细胞筛网的流式管过滤细胞悬液。
8. 进行荧光激活细胞分选
   1. 立即进入第5步，使用荧光激活细胞分选仪对染色细胞进行分选。

5. FACS 门控与分选策略

注意：为通过流式细胞术分离出有活力的 CD90.2 阳性促甲状腺细胞，该操作应在约 60 分钟内完成。

1. 配置细胞分选仪
   1. 在细胞分选仪上安装 100 µm 喷嘴。
   2. 将鞘液压力设置为 20 psi。
      注意：使用室温保存的无菌 PBS 基鞘液。
2. 执行仪器质量控制
   1. 在样本采集前，按照制造商的说明运行仪器质量控制程序。
      注意：可在其他型号的细胞分选仪上使用等效的制造商推荐质量控制流程。
   2. 使用校准微球验证液滴延迟和液流稳定性。
3. 进行荧光补偿
   1. 采集单色补偿对照样本。
   2. 在设门和分选前进行荧光补偿。
      注意：使用未染色和单染对照样本计算补偿值。必要时手动验证并调整补偿矩阵。
4. 定义设门策略
   1. 利用前向散射和侧向散射参数排除碎片（图 3A、B）。
   2. 利用前向散射高度对前向散射面积以及侧向散射高度对侧向散射面积设门，以筛选单细胞（图 3A、B）。
   3. 通过设门选择碘化丙啶（PI）阴性细胞以排除死细胞。
   4. 设门选择 CD90.2 阳性细胞以富集促甲状腺细胞。
      注意：将 CD90.2 阳性细胞定义为在 CD90 检测通道中荧光强度大于 10³ 的事件（图 3C–F）。
5. 准备收集管
   1. 根据预期的下游应用准备收集管。
      注意：预先在低吸附收集管中加入 1 mL QIAzol 裂解试剂（用于 RNA 提取）或补充了 10% 去炭处理胎牛血清的 Medium 199 培养基（用于细胞培养应用）。
6. 分选 CD90.2 阳性促甲状腺细胞
   1. 将 CD90.2 阳性单细胞分选至收集管中。
   2. 收集用于 RNA 分析的细胞
      1. 直接将细胞收集到 1 mL 裂解试剂中。
      2. 涡旋振荡管子 1 分钟以裂解细胞。
      3. 立即在干冰上冷冻样本。
      4. 将样本储存在 −80°C，直至进行 RNA 提取。
   3. 收集用于原代培养的细胞
      1. 将细胞收集到补充了 10% 去炭处理胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的培养基中。
      2. 以每孔至少 2 × 10⁵ 个细胞的密度，将细胞接种至 8 孔玻璃腔室载玻片中，终体积为 200 µL。
      3. 在含 5% CO₂ 的湿润培养箱中，于 37°C 培养最多 72 小时。
         注意：良好的培养表现表现为 24 小时内可见细胞贴壁，贴壁效率约为 60%–80%，72 小时后细胞存活率 ≥70%–80%。
      4. 根据需要在培养基中添加 100 nM T3。
         注意：在细胞贴壁后开始 T3 处理，通常为接种后 24 小时，并持续处理至 72 小时取样。T3 储存液用 40 mM NaOH 配制，并设置相同终溶剂浓度的载体对照组。
         ​注意：使用去炭处理血清可维持甲状腺激素缺乏的培养环境，有助于提高实验性诱导的 T3 依赖性 Tshb 表达抑制的检测灵敏度。

图3．FACS设门策略及促甲状腺细胞富集的验证。（A,B）用于分离活的单个前垂体细胞的逐级设门策略。设门包括：利用前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）排除碎片；利用前向散射高度（FSC-H）对FSC-A以及侧向散射高度（SSC-H）对SSC-A区分单细胞；排除碘化丙啶（PI）阳性的死亡细胞。（C–F）代表性FACS图，显示使用藻红蛋白-花青素7（PE-Cy7）标记的抗CD90.2抗体鉴定并富集CD90.2阳性与CD90.2阴性细胞群。（G–I）对分选后细胞群进行逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）验证促甲状腺细胞的富集情况。缩写：FSC-A，前向散射面积；SSC-A，侧向散射面积；FSC-H，前向散射高度；SSC-H，侧向散射高度；PI，碘化丙啶；PE-Cy7，藻红蛋白–花青素7；NT，未处理。 请点击此处查看该图的放大版本。

6. 通过实时聚合酶链式反应分析CD90阳性细胞与CD90阴性细胞中Tshb mRNA的基因表达

注意：为定量分析分选后细胞群体中 Tshb mRNA 的表达水平，该实验步骤需在约 5 小时内完成。

1. 收集用于RNA提取的分选细胞
   1. 将等量的CD90阳性细胞和CD90阴性细胞（2.5 × 10⁵ 个细胞）分别收集到含有1 mL裂解试剂的1.5 mL离心管中。
2. 裂解细胞
   1. 剧烈涡旋样品1分钟，以彻底裂解细胞，随后将样品置于冰上。
      注意：如需延迟操作，可将裂解后的样品在−80°C下保存。
3. 提取总RNA
   1. 根据RNA提取试剂盒说明书提供的步骤提取总RNA。
      注意：在洗脱前，使用无RNase的DNase I进行DNase消化处理，以去除残留的基因组脱氧核糖核酸（DNA），具体操作遵循试剂盒说明书。
   2. 使用分光光度计测定RNA浓度。
      注意：用于互补DNA（cDNA）合成的RNA样品，其A260/A280比值应约为1.8–2.1，A260/A230比值应大于1.8。
4. 合成cDNA
   1. 根据第一链cDNA合成试剂盒说明书，以100 ng总RNA为起始材料合成cDNA。
      注意：cDNA合成过程中使用oligo(dT)引物。
   2. 按照表1配制模板-引物混合液。
   3. 轻轻混匀试剂，并短暂离心，使液体沉降至管底。
   4. 在65°C下变性模板-引物混合液10分钟。
   5. 立即在冰上冷却样品。
   6. 按照表2配制逆转录反应体系，最终体积为20 µL。
      注意：建议通过将表2中各试剂体积乘以样品总数，并额外增加10%的体积以补偿移液误差，预先配制总反应体系（主混合液）。
   7. 轻轻混匀反应体系，避免涡旋，短暂离心。
   8. 在50°C下孵育反应体系60分钟。
   9. 在85°C下灭活反应5分钟。
   10. 将样品置于冰上冷却。
   11. 立即进行逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），或将cDNA在−30°C下保存备用。
       注意：在无核酸酶条件下，cDNA可在−30°C下保存长达6个月。避免反复冻融。
       注意：cDNA合成步骤应在配备加热盖的热循环仪中进行，以减少蒸发。
5. 配制RT-qPCR反应体系
   1. 按照表3配制RT-qPCR反应体系。
6. 加样至RT-qPCR板
   1. 向96孔板的每个孔中加入9 µL RT-qPCR反应体系。
   2. 加入1 µL cDNA模板，该模板对应于由5 ng起始总RNA逆转录生成的产物。
   3. 轻轻混匀样品，并短暂离心。
7. 进行RT-qPCR
   1. 根据SYBR Green主混合液说明书进行RT-qPCR。
      注意：采用初始变性步骤：95°C 2分钟，随后进行40个循环（95°C 5秒，60°C 30秒）。在每个延伸步骤结束时采集荧光信号。通过从65°C到95°C、以0.5°C递增的熔解曲线分析，确认扩增产物的单一性。
8. 对Tshb表达量进行归一化处理
   1. 采用ΔCt法，将Tshb的表达量归一化至亲环素A（CyA）的表达水平。
      注意：在分析前应验证CyA的稳定性，确保其在各实验组间的Ct值变异最小。
9. 计算相对基因表达量
   1. 采用2^−ΔΔCt法，计算CD90阳性细胞相对于CD90阴性细胞中Tshb的相对表达量。
      注意：RT-qPCR分析使用八个生物学重复样本，每个样本进行两次技术重复反应（图3G–I）。

试剂	体积	终量/终浓度
总RNA	可变	100 ng
锚定寡核苷酸(dT)18引物（50 pmol/µL）	1 µL	2.5 µM
PCR级水	可变	调节至总体积13 µL
总量	13 µL	—

表1：互补脱氧核糖核酸合成用模板-引物混合物的配制。 用于配制互补脱氧核糖核酸（cDNA）合成所用模板-引物混合物的试剂、体积及最终用量。每个反应体系包含100 ng总核糖核酸（RNA）、一种锚定的寡聚(dT)18引物，以及调整至终体积为13 µL的聚合酶链式反应（PCR）级水。所报告的2.5 µM浓度是指在加入逆转录反应组分之前，13 µL模板-引物混合物中的引物浓度。

试剂	体积	终量/终浓度
Transcriptor 逆转录酶反应缓冲液 (5×)	4 µL	1×
Protector RNase 抑制剂 (40 U/µL)	0.5 µL	20 U
脱氧核苷酸混合物 (每种 10 mM)	2 µL	每种 1 mM
Transcriptor 逆转录酶 (20 U/µL)	0.5 µL	10 U
模板-引物混合物（表 1）	13 µL	—
总量	20 µL	—

表2：用于互补脱氧核糖核酸合成的反转录反应体系。 用于第一链互补脱氧核糖核酸（cDNA）合成的试剂、体积及终浓度。最终反应体系体积为20 µL。所注明的脱氧核苷三磷酸浓度（每种1 mM）指在完整反应体系中的终浓度。

试剂	体积	终量/终浓度
PowerTrack SYBR Green Master Mix (2×)	5 µL	1×
Tshb 正向与反向寡核苷酸引物（见材料表）	0.5 µL	400 nM
PCR级水	3.5 µL	调节至9 µL反应体积
反应体系小计	9 µL	—
cDNA模板	1 µL	5 ng
最终反应体积	10 µL	—

表3：逆转录定量聚合酶链式反应反应体系的配制。 用于促甲状腺激素β亚基（Tshb）信使核糖核酸（mRNA）逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）扩增的试剂、体积及终浓度。在加入模板前，反应体系体积为9 µL。扩增前立即加入1 µL互补脱氧核糖核酸（cDNA）模板，使最终反应体积达到10 µL。

结果

将12只8周龄的C57BL/6小鼠（6只雄性和6只雌性）通过饮用含MMI和KClO₄的水并同时饲喂缺碘饮食处理1周，以诱导甲状腺功能减退症（图1A）。通过检测甲状腺功能正常小鼠和甲状腺功能减退小鼠肝脏中1型Dio1 mRNA的表达水平，以确认甲状腺功能减退模型建立成功²⁹。与甲状腺功能正常对照组相比，甲状腺功能减退小鼠肝脏Dio1 mRNA表达水平下降约60%，证实甲状腺功能减退模型成功建立（图1B）。

从鼠AL制备单细胞悬液的工作流程示意图见图2A。在甲状腺功能减退条件下，由12只小鼠合并AL组织制备的单细胞悬液产量约为2 × 10⁷ 个细胞/mL，而在甲状腺功能正常条件下约为1 × 10⁷ 个细胞/mL（图2B）。使...

讨论

本文所述基于CD90的FACS方案提供了一种可重复的方法，用于从成年小鼠垂体组织中富集原代促甲状腺细胞，同时保持其激素反应性。该方法解决了促甲状腺细胞生物学及下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴调控研究中长期存在的技术局限。以往对促甲状腺细胞调控的研究主要依赖TαT1细胞系；然而，TαT1细胞的基础Tshb表达水平极低，且不能稳定表现出典型的T3介导的抑制效应，限制了其生理相关性^14,15,20。在非促甲状腺细胞系（如HEK293、COS、GH3或JEG3细胞）中使用Tshb报告基因构建的异源系统引入了非生理性的调控环境，可能因非内源性增强子-启动子相互作用而产生实验假象¹⁵。近期建立的垂体类器官和干细胞/前体细胞聚集体系统可模拟垂体发育与分化的多个方面；然而，这些方法无法直接分离成熟的促甲状腺细胞群体，因而不能用于后续的生化或转录分析^1...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 滤膜	Corning	430769	用于收集培养基的灭菌
0.22 µm 注射器滤器	Pall Life Sciences	PN4602	用于胶原酶的灭菌
0.5% 胰蛋白酶–EDTA	Gibco	15400-054	用于细胞解离
1.5 mL 低吸附微量离心管	Invitrogen	AM12450	用于流式细胞分选（FACS）染色
15 mL 聚丙烯管	Falcon	352097	用于前叶收集和细胞解离
23 号针头	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	用于心脏灌注
8 孔玻璃培养腔载玻片	Millipore	PEZGS0816	用于流式细胞分选后培养
Accudrop 校准微珠	BD Biosciences	345249	用于流式细胞分选（FACS）过程中的液滴延迟校准
抗小鼠 PE-Cy7 抗 CD90.2 抗体	Invitrogen	25-0902-82	用于流式细胞分选（FACS）染色
自动细胞计数仪	DeNovix	s-10700	用于细胞计数
活性炭处理胎牛血清	Gibco	12676029	用于流式细胞分选后促甲状腺细胞培养
来自溶组织梭菌的胶原酶	Sigma-Aldrich	C9263	用于细胞解离
收集盘	标准实验室解剖托盘	N/A	用于心脏灌注
自配无 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HEPES 缓冲盐溶液（HBSS）	N/A	N/A	用于灌注和细胞解离
亲环素 A（CyA）寡核苷酸引物 正向	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	用于逆转录定量 PCR（RT-qPCR）
亲环素 A（CyA）寡核苷酸引物 反向	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	用于逆转录定量 PCR（RT-qPCR）
DMEM，1×	Gibco	11965-092	用于收集培养基
DNase I 溶液	Promega	M6101	用于细胞解离
依诺肝素钠注射液	Sandoz	0781-3119-64	用于灌注
胎牛血清（FBS）	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	用于收集培养基
流式细胞术染色缓冲液	Invitrogen	00-4222-26	用于流式细胞分选（FACS）染色
止血钳	Fine Science Tools	13008-12	用于胸腔稳定
HEPES，1 M	Gibco	15630-080	用于收集培养基
HEPES，1 M	Teknova	H1035	用于 HBSS 配制
缺碘饮食	Envigo	TD.95007	用于体内诱导甲状腺功能减退
眼科镊	Fine Science Tools	11065-07	用于垂体解剖
异氟烷	Piramal Critical Care	66794-017-25	用于麻醉
L-谷氨酰胺	Gibco	35050-061	用于收集培养基
Medium 199	Gibco	11150-059	用于流式细胞分选后培养
甲巯咪唑（MMI）	Sigma-Aldrich	M8506-100G	用于体内诱导甲状腺功能减退
MicroAmp 快速 96 孔反应板	Applied Biosystems	4346907	用于逆转录定量 PCR（RT-qPCR）
青霉素–链霉素	Gibco	15140122	用于流式细胞分选后培养
蠕动泵	Fisher Scientific	GP1000	用于心脏灌注
高氯酸钾（KClO4）	Sigma-Aldrich	241830-500G	用于体内诱导甲状腺功能减退
PowerTrack SYBR Green 主混合液	Applied Biosystems	A46109	用于逆转录定量 PCR（RT-qPCR）
碘化丙啶	eBioscience	00-6990-50	用于流式细胞分选（FACS）过程中的活力染色
QIAzol 裂解试剂	Qiagen	79306	用于 RNA 提取
硅胶管	Cole-Parmer	EW-96410-13	用于心脏灌注
体视显微镜	Nikon	SMZ-745T	用于前叶解剖
StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems	4376600	用于逆转录定量 PCR（RT-qPCR）
手术勺	Fine Science Tools	10090-13	用于暴露垂体时抬升脑组织
Transcriptor 第一链 cDNA 合成试剂盒	Roche	4379012001	用于 cDNA 制备
台盼蓝	Thermo Fisher Scientific	T10282	用于细胞计数
Tshb 寡核苷酸引物 正向	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3′	用于逆转录定量 PCR（RT-qPCR）
Tshb 寡核苷酸引物 反向	Integrated DNA Technologies	5′-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3′	用于逆转录定量 PCR（RT-qPCR）
水浴锅	Fisher Scientific Isotemp Water Bath	15-462-5Q	用于酶解消化