本研究整合了公共数据集、配对组织验证、细胞迁移实验、靶向网络预测以及免疫特征分析，以评估miR-192-5p在结直肠癌中的作用。研究结果表明，TCGA/GDC表达数据与本地qRT-PCR结果之间存在差异，提示应谨慎解读其在诊断、预后、功能及免疫相关性方面的意义。
研究文章
结直肠癌中miR-192-5p的临床意义、免疫浸润特征及功能网络分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
结直肠癌（CRC）是一种异质性恶性肿瘤，其中微小RNA（microRNA）可能参与肿瘤进展及生物标志物的发现。本研究通过整合TCGA/GDC和GEO生物信息学分析、配对组织qRT-PCR验证、靶基因预测、免疫特征分析以及HT29细胞划痕愈合实验，系统评估了miR-192-5p在CRC中的临床意义、免疫关联性及其功能网络。对TCGA/GDC miRNA-seq数据的再分析纳入了616例肿瘤样本和11例正常COADREAD样本，结果显示肿瘤样本中数据库层面的hsa-mir-192信号显著高于正常样本（Mann-Whitney p = 9.96 × 10-8）。在11例配对TCGA病例中也观察到相同趋势（中位肿瘤-正常差异 = 3.13 log2[RPM + 1]，Wilcoxon p = 0.0029），而本地qRT-PCR在配对临床组织中的检测结果则支持成熟miR-192-5p在CRC组织中表达下调。基于TCGA的ROC分析显示肿瘤与正常样本之间具有较强的区分能力，但通过平衡重采样和留一正常样本排除分析证实，由于正常样本数量有限，该结果应谨慎解读。TCGA队列的临床病理学分析提示miR-192-5p表达与N分期和年龄相关，而T分期和M分期在汇总表中无显著性，总生存分析未显示显著的预后关联。基于TCGA RNA-seq的候选枢纽基因分析提供了探索性的表达、相关性和生存证据，但未证实miR-192-5p的直接靶向作用。免疫特征分析显示其相关性多为异质性且多数较弱。功能实验表明，转染miR-192-5p模拟物可抑制HT29细胞的伤口闭合。这些结果表明，miR-192-5p在生物学上与CRC相关，但其表达方向及临床解读依赖于检测平台，仍需进一步实验验证。
引言
结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因1,2。尽管结肠镜检查、粪便免疫化学检测、SEPT9甲基化检测、循环肿瘤标志物及分子谱分析已显著改善了CRC的检出率和临床管理3,4，但肿瘤生物学特性、治疗反应及患者预后仍存在显著异质性5,6,7。因此，有助于表征CRC生物学特征的生物标志物可能为风险分层以及更个体化治疗策略的开发提供重要支持8。
microRNA（miRNA）是一类长度约为19–24个核苷酸的小分子非编码RNA，主要通过转录后机制调控基因表达9。miRNA表达失调可影响癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡、免疫相互作用以及治疗反应10。已有研究报道，miR-192-5p在不同疾病和癌症中具有依赖于具体背景的作用方式，其功能可表现为促癌或抑癌，具体取决于组织类型、分子背景及实验体系11,12,13,14,15,16。在结直肠癌（CRC）中，先前的研究已在临床样本中发现miRNA表达谱的改变，并在结肠癌细胞中证实其对恶性表型的功能性调控作用12,14,15。然而，公共数据库分析结果在表达方向上并不总是一致，因此需谨慎评估miR-192-5p在CRC中的临床意义、靶基因调控网络及其与免疫的相关性。
本研究通过整合TCGA/GDC和GEO生物信息学分析、配对临床组织样本的qRT-PCR验证、体外迁移实验、候选靶基因预测、通路富集分析以及免疫特征相关性分析，对结直肠癌（CRC）中miR-192-5p的作用进行了评估。研究基于以下假设：成熟miR-192-5p在CRC组织中可能呈下调表达，并可能发挥肿瘤抑制作用。由于重新分析的TCGA/GDC miRNA-seq信号显示相反的表达趋势，因此研究结果应解释为探索性且依赖于检测平台的结果，而非单一确定性的表达模式。
方案
本研究遵循《赫尔辛基宣言》的规定进行。2021年10月21日获得内蒙古医科大学伦理委员会的批准。所有参与本研究的受试者均签署了书面知情同意书。
临床标本采集
收集了2017年12月至2020年2月期间接受根治性切除术的45例结直肠癌患者的癌组织及配对的癌旁非癌组织。所有患者术前均未接受放疗或化疗，且排除合并其他恶性肿瘤的患者。癌旁非癌组织取自距肿瘤边缘至少5 cm的区域。样本在手术切除后立即冷冻，并保存于液氮中，直至进行RNA提取。该队列包括27名男性和18名女性患者；13名患者年龄小于60岁，32名患者年龄大于或等于60岁。临床病理学变量包括肿瘤直径、TNM分期、分化程度、肿瘤血管瘤栓、淋巴结转移以及术前癌胚抗原（CEA）水平。
公开数据获取与预处理
TCGA-COAD 和 TCGA-READ 的开放获取 miRNA-seq、RNA-seq 及临床数据来自基因组数据共享门户（Genomic Data Commons portal）。根据 GDC 样本类型确定原发性肿瘤和正常实体组织样本。在肿瘤与正常组织差异表达分析中排除了转移性和复发性肿瘤样本。对于 TCGA miRNA-seq 文件，本分析中检测到的数据库条目为 hsa-mir-192；表达值以 log2(RPM + 1) 形式分析，其中 RPM 表示每百万比对上的 miRNA 读段数。当存在配对样本时，同时进行非配对和配对的肿瘤-正常组织分析。使用 GEO 数据集 GSE89076 和 GSE156355 进行候选靶基因筛选。通过调整后 p < 0.05 且绝对 log2 倍数变化 ≥ 2 筛选 GEO 中差异表达基因。在整个稿件中对数据集名称的一致性进行了核查。
诊断、临床病理学及生存分析
采用受试者工作特征（ROC）分析评估 TCGA-COAD、TCGA-READ 以及合并的 COADREAD 队列中探索性肿瘤-正常组织分离效果。由于正常样本数量较少，进行了额外的敏感性分析，包括 5,000 次迭代的肿瘤-正常平衡重采样和留一正常样本分析。在临床病理学关联分析中，根据 TCGA 中 miR-192 表达水平的中位数将原发性肿瘤样本分为高表达组和低表达组。在样本量允许的情况下，对合并的 COADREAD 队列以及 COAD 和 READ 分别重复进行分析。采用 Kaplan-Meier 法结合 log-rank 检验和单变量 Cox 回归分析评估总生存期。为避免夸大预后结论，诊断、临床病理学和生存分析结果分别报告。
候选靶基因与枢纽基因分析
通过整合miRWalk预测结果与来自GSE89076和GSE156355的差异表达基因，筛选出候选靶基因。保留这三个数据源的交集用于后续探索性分析。使用STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，并基于Cytoscape的cytoHubba和MCODE分析，根据节点度数和模块连接性筛选枢纽基因。保留的枢纽基因（KIF20A、TPX2、CDCA5、CCNB1、CDK1、PLP1、NRXN1、GRIK3和KIF5C）进一步利用TCGA RNA-seq数据进行评估。肿瘤与正常组织间的表达差异、与TCGA中miR-192表达的Spearman相关性以及总体生存关联性被汇总为补充性探索分析。这些基因仅被视为候选靶点；生物信息学数据未推断其存在直接结合、挽救效应或下游蛋白水平的调控作用。
GO 与 KEGG 富集分析
对候选基因集和显著性网络模块进行了基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析。GO 条目被归类为生物过程、细胞组分和分子功能三个类别。富集结果中 p < 0.05 被视为具有统计学意义，解释为假设生成的通路信号，而非经过实验验证的机制。
RNA 提取与 qRT-PCR 分析
采用TRIzol试剂，根据制造商说明书从45例配对的结直肠癌（CRC）组织及其相邻非癌组织样本中提取总RNA。通过分光光度法测定RNA的纯度和浓度，选择A260/A280比值在1.8至2.1之间的样本用于逆转录。使用TransGen Biotech提供的miRNA逆转录系统及基于SYBR Green的miRNA qPCR试剂进行qRT-PCR检测。逆转录和qPCR扩增均按照试剂制造商的说明进行。每个qRT-PCR反应设置技术重复三次。以RNU6B作为内参对照。miR-192-5p引物序列为5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3'（正向）和5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'（反向）。RNU6B引物序列为5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'（正向）和5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'（反向）。在qPCR平台支持的情况下，通过熔解曲线分析评估扩增特异性。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。配对的肿瘤组织与相邻正常组织结果作为配对临床测量数据进行分析。
细胞培养与转染
人结直肠癌细胞系 HT29 来源于作者实验室的细胞库，并已通过鉴定，确认无支原体污染。HT29 细胞在 McCoy's 5A 培养基中培养，培养基中添加 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素，在 37 oC、5% CO2 的环境中孵育。当细胞融合度达到约 80% 时进行传代。miR-192-5p 模拟物及阴性对照寡核苷酸 con238 购自 Sangon Biotech（中国上海），用于瞬时转染。将 HT29 细胞接种于 6 孔板中，当细胞密度达到约 20–30% 时进行转染，寡核苷酸终浓度为 50 nM，采用基于脂质的转染方法，并按照试剂生产商的说明进行操作。转染试剂与寡核苷酸的比例及试剂用量均遵循作者实验室记录中所采用的生产商推荐方案。转染复合物在标准培养条件下与细胞共孵育，后续的转染成像和划痕愈合实验根据实验计划在转染后进行。本研究仅纳入了 HT29 细胞的数据。
伤口愈合实验
将转染的 HT29 细胞接种于 6 孔板中，培养至形成融合的单层细胞。使用无菌的 200 µL 枪头制造线性划痕，并用 PBS 洗涤去除脱落的细胞。随后更换为无血清培养基，以减少在迁移评估过程中增殖相关的影响。分别在 0 h、24 h 和 48 h 拍摄伤口图像。该伤口愈合实验进行了三次独立的生物学重复，每个组别和时间点均测量多个显微视野。通过图像分析软件从显微图像中量化伤口宽度；原始测量所使用的软件具体版本在源记录中不可用。伤口愈合率的计算公式为：[(0 h 时的伤口宽度 - 特定时间点的伤口宽度) / 0 h 时的伤口宽度] × 100%。由于可用的稿件数据未包含独立的增殖对照实验，因此将伤口愈合结果解释为与细胞迁移相关，但不能完全排除增殖效应的影响。
免疫特征相关性分析
使用原发性肿瘤的RNA-seq数据重新评估了TCGA中miR-192表达水平与免疫相关特征之间的关联。共有425例具有匹配的miRNA和RNA-seq数据的肿瘤样本被纳入特征评分相关性分析。在经过错误发现率校正后，miR-192的表达水平与多个免疫特征呈统计学显著但较弱的负相关，包括滤泡辅助性T细胞（rho = -0.205，FDR = 0.00049）、活化树突状细胞（rho = -0.186，FDR = 0.00098）、调节性T细胞（rho = -0.185，FDR = 0.00098）、浆细胞样树突状细胞（rho = -0.169，FDR = 0.0027）和巨噬细胞（rho = -0.149，FDR = 0.0092）。正相关主要见于嗜酸性粒细胞（rho = 0.139，FDR = 0.0155）和Th17细胞特征（rho = 0.121，FDR = 0.0296）。这些结果表明，miR-192与免疫的关联具有异质性，且总体较弱，而非呈现一致的正向免疫浸润模式。
统计学分析
统计分析使用 GraphPad Prism 9.0、SPSS 25.0 和 R 软件 3.6.3 进行。连续变量根据情况以均值 ± 标准差或中位数与四分位间距表示。当肿瘤组织与相邻组织样本配对时，采用配对检验进行组织间的比较。若不满足正态性假设，则使用非参数检验。受试者工作特征曲线（ROC 曲线）、平衡重抽样和留一正常样本法用于探索性诊断区分；分类临床病理学特征的关联性采用卡方检验；生存分析采用对数秩检验和 Cox 模型；免疫分析及枢纽基因分析采用 Spearman 相关性分析。双侧 p < 0.05 被认为具有统计学显著性，免疫特征相关性结果同时报告假发现率校正。
结果
公共数据集和配对临床组织中的表达分析
使用GDC提供的TCGA-COAD和TCGA-READ miRNA-seq数据重新评估了miR-192的表达模式（图1）。在这些文件中，数据库层面的条目标注为hsa-mir-192，而非直接标注为成熟的hsa-miR-192-5p序列；因此，该公共数据库结果被解释为TCGA中miR-192的信号。在合并的COADREAD队列中，共分析了616个原发性肿瘤样本和11个实体组织正常样本。肿瘤样本中miR-192的表达高于正常样本（中位数分别为16.05与13.46 log2[RPM + 1]，Mann-Whitney p = 9.96 × 10-8）。在单独的COAD队列（455个肿瘤样本和8个正常样本，p = 9.89 × 10-8）和READ队列（161个肿瘤样本和3个正常样本，p = 1.94 × 10-5）中也观察到相同的肿瘤表达升高趋势。对11对配对样本的TCGA分析同样显示肿瘤组织中表达更高（肿瘤与正常样本的中位数差异为3.13 log2[RPM + 1]，Wilcoxon p = 0.0029）。这些结果与本地配对的qRT-PCR结果不一致，后者支持在结直肠癌（CRC）组织中成熟miR-192-5p的表达降低（图2）。
诊断效能与临床病理学关联
基于TCGA的ROC分析采用上述定义的肿瘤与正常样本区分标准进行重复（图3）。结直肠癌联合队列（COADREAD）的AUC为0.968，COAD单独队列为0.947，READ单独队列为0.994。进一步的平衡重采样结果显示，COADREAD的中位AUC为0.983，COAD为0.984，READ为1.000；然而，COADREAD的95%置信区间较宽（0.868–1.000），COAD的置信区间也为0.781–1.000，且READ仅包含3个正常样本。留一法正常样本分析也表明，ROC估计值对较小的正常组别较为敏感。因此，ROC结果仅作为肿瘤与正常样本分离的探索性证据保留，不足以作为临床诊断生物标志物的充分依据。基于TCGA中miR-192表达中位数的临床病理学关联分析显示，其与N分期（p = 0.019）和年龄（p = 0.004）存在显著关联，而T分期（p = 0.110）和M分期（p = 0.932）无显著性差异（表1）。
生存分析
总体生存分析未支持TCGA中miR-192表达水平在结直肠癌（CRC）中具有显著的预后关联性（图3）。在合并的COADREAD队列中，基于中位值分割的Kaplan-Meier比较无显著性差异（log-rank p = 0.857），单变量Cox回归分析也未显示显著关联（HR = 0.934 每log2表达单位，p = 0.374）。在COAD（log-rank p = 0.889；Cox p = 0.493）和READ（log-rank p = 0.807；Cox p = 0.716）中也得出了相同的结论。因此，现有数据不支持miR-192在结直肠癌中作为强预后生物标志物的主张。
候选靶基因与功能富集
通过整合miRWalk预测结果与GEO数据集GSE89076和GSE156355中的差异表达基因，进行了候选靶基因分析。该筛选鉴定出93个候选基因用于后续的网络和富集分析（图4）。蛋白质相互作用分析保留了KIF20A、TPX2、CDCA5、CCNB1、CDK1、PLP1、NRXN1、GRIK3和KIF5C作为探索性枢纽基因（图5）。TCGA RNA-seq敏感性分析显示，KIF20A、TPX2、CDCA5、CCNB1和CDK1在肿瘤组织中的表达高于正常组织，而PLP1、NRXN1、GRIK3和KIF5C在肿瘤组织中的表达较低。与TCGA中miR-192表达的相关性分析结果不一：CDCA5、CCNB1和CDK1呈正相关，而PLP1、NRXN1和KIF5C呈负相关。富集分析突出了与细胞色素P450介导的药物代谢、细胞色素P450介导的异源物代谢、视黄醇代谢、谷氨酸能突触相关术语以及突触前结构组织相关的代表性条目（图6）。这些发现支持枢纽基因网络具有生物学相关性，但并未证实miR-192-5p的直接靶向作用。
细胞迁移实验
为评估 miR-192 上调的功能效应，将 HT29 细胞转染 miR-192 模拟物。荧光显微镜证实，在 miR-192-5p 模拟物转染组和阴性对照转染组中转染成功（图7）。在划痕愈合实验中，转染 miR-192 的 HT29 细胞在 24 小时和 48 小时的迁移率均低于未转染的 HT29 细胞和阴性对照转染细胞（图8）。在 24 小时，miR-192 转染组的迁移率为 9.75 +/- 2.43%，而未转染组为 15.69 +/- 3.47%，阴性对照组为 15.45 +/- 3.92%（P = 0.010）。在 48 小时，miR-192 转染组的迁移率为 20.04 +/- 2.54%，而两个对照组分别为 26.84 +/- 7.65% 和 27.98 +/- 6.78%（P = 0.021）。这些结果表明，miR-192 上调可抑制 HT29 细胞在体外的迁移能力。
免疫特征相关性分析
使用原发性肿瘤的RNA-seq数据重新评估了TCGA中miR-192表达与免疫相关特征之间的关联（图9）。共有425个具有匹配的miRNA和RNA-seq数据的肿瘤样本被纳入特征评分相关性分析。miR-192的表达与多种免疫细胞特征呈弱负相关，包括Tfh细胞（rho = -0.205，p = 2.15e-05）、活化树突状细胞（rho = -0.186，p = 0.00011）、Treg细胞（rho = -0.185，p = 0.00013）、浆细胞样树突状细胞（rho = -0.169，p = 0.00046）、巨噬细胞（rho = -0.149，p = 0.0020）、中央记忆T细胞（Tcm细胞，rho = -0.136，p = 0.0050）、NK CD56bright细胞（rho = -0.132，p = 0.0065）以及效应记忆T细胞（Tem细胞，rho = -0.129，p = 0.0078）。嗜酸性粒细胞（rho = 0.139，p = 0.0040）和Th17细胞（rho = 0.121，p = 0.0129）特征则显示弱正相关。因此，miR-192在结直肠癌（CRC）中的免疫关联性具有异质性，不应被一概描述为在所有免疫浸润中均呈正相关。
数据可用性
本研究中分析的公共数据集可从 GDC/TCGA 数据门户和基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取，登录编号分别为 GSE89076 和 GSE156355。本研究产生的干实验分析与再分析结果详见 补充表 1。支持 qRT-PCR 和伤口愈合分析的基础实验数据，包括原始 qRT-PCR Ct 值、伤口宽度测量结果、原始显微镜图像及相关实验数据，均提供于 补充文件夹 1 中。
图 1：TCGA 中 miR-192 的泛癌表达概览。 横轴显示肿瘤类型的缩写，纵轴显示 miR-192 的相对表达水平。蓝色表示正常组织，红色表示肿瘤组织。统计学显著性标注如下：* = p < 0.05，** = p < 0.01，*** = p < 0.001；NS = 无显著性差异。 请点击此处查看该图的高清版本。
图2：结直肠癌数据集及配对组织中 miR-192/miR-192-5p 的表达情况。（A）TCGA/GDC miRNA-seq 分析显示，与正常样本相比，结直肠癌肿瘤样本中数据库水平的 hsa-mir-192 信号更高。（B）配对局部组织样本的 qRT-PCR 分析显示，与相邻非癌组织相比，结直肠癌组织中成熟 miR-192-5p 的表达水平较低。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：基于TCGA hsa-mir-192表达水平的探索性诊断与生存分析。 （A–C）Kaplan-Meier生存曲线。生存分析未支持其具有显著的预后相关性。（D）TCGA队列中肿瘤与正常组织区分的ROC曲线。由于正常样本数量较少，AUC值应谨慎解读。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：候选靶基因筛选与蛋白质相互作用分析。 （A）Venn图显示了miRNA靶基因预测结果与GSE89076和GSE156355数据集中差异表达基因之间的重叠部分。（B）93个候选基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络。节点代表基因，边代表预测或人工审编的基因关联关系。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：从候选靶点网络中筛选枢纽基因。 （A,B）通过模块筛选鉴定出的网络模块。（C）基于网络连接度的枢纽基因排序。（D）整合模块和基于度的筛选后保留的候选枢纽靶点。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：候选基因及显著性网络模块的GO和KEGG富集分析结果。 气泡图总结了具有代表性的富集生物学功能和通路。富集分析结果为探索性发现，需通过实验进一步验证。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：HT29细胞转染图像。（A）代表性HT29细胞。（B）转染miR-192-5p模拟物的HT29细胞的荧光图像。（C）转染阴性对照con238的HT29细胞的荧光图像。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：HT29细胞的伤口愈合实验。（A）未转染的HT29细胞、转染miR-192-5p模拟物的HT29细胞以及转染con238的HT29细胞在0 h、24 h和48 h的代表性划痕图像。（B）24 h和48 h时伤口愈合率的定量分析，以百分比表示。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：TCGA中miR-192表达水平与结直肠癌肿瘤样本免疫相关特征评分的相关性。分析结果显示免疫关联具有异质性，存在多个微弱的负相关关系，而嗜酸性粒细胞和Th17细胞特征主要表现为正相关。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 特征 | TCGA miR-192 低表达 | TCGA miR-192 高表达 | p 值 | 方法 |
| n | 308 | 308 | ||
| T 分期，n (%) | 0.11 | Chisq.test | ||
| T1 | 9 (1.5%) | 11 (1.8%) | ||
| T2 | 44 (7.2%) | 59 (9.6%) | ||
| T3 | 209 (34.1%) | 211 (34.4%) | ||
| T4 | 43 (7%) | 27 (4.4%) | ||
| N 分期，n (%) | 0.019 | Chisq.test | ||
| N0 | 156 (25.5%) | 190 (31%) | ||
| N1 | 88 (14.4%) | 63 (10.3%) | ||
| N2 | 61 (10%) | 54 (8.8%) | ||
| M 分期，n (%) | 0.932 | Chisq.test | ||
| M0 | 214 (39.9%) | 234 (43.7%) | ||
| M1 | 41 (7.6%) | 47 (8.8%) | ||
| 年龄，中位数 (IQR) | 66 (56, 75) | 69 (60, 77) | 0.004 | Wilcoxon |
表1： TCGA miR-192 表达水平分组与结直肠癌（CRC）临床病理特征的关联性。 高表达组和低表达组根据TCGA中miR-192表达水平的中位数进行划分。在汇总的表格中，N分期和年龄具有显著性差异，而T分期和M分期则无显著性差异。
补充表 1：本研究生成的干实验重新分析结果。该工作簿包含 TCGA/GDC 表达比较、平衡 ROC 敏感性分析、留一正常样本分析、临床病理学关联分析、生存分析、枢纽基因表达与相关性汇总以及免疫特征相关性结果。请点击此处下载此文件。
补充文件夹 1：支持 qRT-PCR、细胞转染和伤口愈合实验的原始实验数据。这些文件包括原始的 qRT-PCR Ct 值、流式细胞术/转染数据、伤口宽度测量结果，以及用于本文所述分析的代表性显微镜图像。请点击此处下载该文件。
讨论
本研究通过整合公共数据集分析、本地组织验证、靶向网络预测、免疫特征分析以及体外迁移实验，评估了miR-192-5p在结直肠癌（CRC）中的临床和生物学意义。分析采用了经验证的TCGA样本定义，在可能的情况下区分了结肠腺癌（COAD）与直肠腺癌（READ），使用log2(RPM + 1)的miRNA值，区分了配对与非配对比较，检验了ROC曲线的稳健性，并增加了枢纽基因RNA测序的敏感性分析。核心发现是，公共TCGA/GDC数据库中miR-192的信号与本地成熟的miR-192-5p qRT-PCR结果在表达方向上相反，这强调了必须区分数据库层面的前体miRNA注释与成熟miRNA的实际测量结果9,11。
这种差异不应仅用样本量不均来解释。TCGA正常组虽小，但非配对、配对、仅COAD以及仅READ的分析均显示TCGA/GDC中肿瘤表达更高的趋势一致。多种因素可能造成此现象，包括样本来源、测序平台与qRT-PCR平台的差异、数据库层面的hsa-mir-192注释与成熟hsa-miR-192-5p实际检测之间的差异、RNA处理方式、肿瘤纯度、相邻组织定义以及人群特征等。关于生物标志物解读和肿瘤异质性的类似问题已在结直肠癌（CRC）研究中被多次强调5,6,7,8。因此，研究结果支持在结直肠癌中对miR-192-5p的表达进行依赖于具体背景和检测平台的解读，而非简单地认定其具有单一、普适的表达方向。
对诊断分析结果也应谨慎解读。尽管基于 TCGA 的 ROC 分析得到了较高的 AUC 值，但该比较中肿瘤样本数量远多于正常样本，合并的 COADREAD 队列中仅有 11 个正常样本。平衡重采样后仍显示出较高的中位 AUC 值，但由于每次平衡比较均受限于较小的正常样本组，其置信区间较宽。因此，ROC 结果支持在 TCGA/GDC 数据中进行探索性肿瘤-正常样本分离，但不足以确立 miR-192-5p 作为临床诊断生物标志物。这一解释与探索性生物标志物信号和经临床验证的诊断或预后生物标志物之间的一般区别一致4,8。
生存分析未显示 miR-192 表达与 COADREAD、COAD 或 READ 的总生存期之间存在显著关联。在当前分析中，miR-192 可能与某些选定的临床病理学变量相关，但现有数据不足以支持其作为强有力预后生物标志物的结论。这一区分至关重要，因为预后生物标志物需要有证据表明，该标志物状态在不同具有临床意义的情境下，能够独立且可重复地与临床结局相关联8。
体外伤口愈合实验提供了功能性证据，表明 miR-192 的上调可抑制 HT29 细胞的迁移能力。该结果与 miR-192 在结直肠癌（CRC）细胞中可能具有肿瘤抑制功能的作用一致，并与局部 qRT-PCR 的结果方向相符。先前的研究也支持 microRNA（miRNA）在调控上皮-间质转化、细胞命运决定及迁移相关表型中的作用，其中包括与 miR-192 相关的信号通路15,16,17。然而，目前的功能性数据仍不完整。要支持 miR-192 作为机制性肿瘤抑制因子的模型，还需进一步的湿实验验证，包括在至少一种其他 CRC 细胞系中重复转染实验、伤口愈合实验中的增殖对照、Transwell 迁移与侵袭实验、对选定靶基因的双荧光素酶验证、靶 mRNA 及蛋白表达水平的检测，以及挽救实验。
枢纽基因分析应被视为一种假设生成手段。TCGA RNA-seq 数据补充分析显示，保留下来的枢纽基因在肿瘤与正常组织之间表现出显著的表达差异，但这些基因与 miR-192 的相关性结果不一。多个细胞周期相关基因（包括 CDCA5、CCNB1 和 CDK1）与 miR-192 呈正相关而非负相关，这不符合简单的 miRNA 直接靶向抑制模型。相反，PLP1、NRXN1 和 KIF5C 则表现出负相关。这些结果支持了该网络的生物学相关性，但也表明在缺乏荧光素酶实验、蛋白水平验证及挽救实验的情况下，无法得出直接靶向的结论。这种谨慎的解读与计算机模拟靶向网络分析的探索性质相一致10,11。
免疫分析进一步支持谨慎解读。肿瘤RNA-seq免疫特征评分显示，miR-192的表达与多种免疫特征呈负相关，主要与嗜酸性粒细胞和Th17细胞特征呈正相关。大多数相关性较弱，即使在经过假发现率校正后仍如此。由于免疫特征分析方法是从整体表达数据中推断通路或细胞状态的富集情况，这些发现应视为探索性结果，需通过正交免疫谱型分析方法进行验证13。
本研究存在若干局限性。首先，本地验证队列规模相对较小，且来自单一中心。其次，公共数据集分析与本地qRT-PCR验证采用了不同的平台和检测水平。第三，TCGA数据库中的正常miRNA-seq样本数量较少，限制了诊断推断的可靠性。第四，枢纽基因与免疫分析均为计算预测，尚需实验验证。第五，目前可用的功能实验仅限于HT29细胞的伤口愈合数据。这些局限性表明，本研究应被视为一项整合性的探索性分析，而非确凿证据，尚不能证实miR-192-5p是结直肠癌（CRC）中经过验证的诊断性、预后性或机制性生物标志物6,8。
综上所述，miR-192-5p 在生物学上与结直肠癌（CRC）相关，但其表达模式和临床解读较为复杂。TCGA/GDC 分析显示，CRC 肿瘤样本中 miR-192 信号较高，而本地配对组织队列的 qRT-PCR 结果则显示成熟 miR-192-5p 表达水平较低。ROC 分析提示肿瘤与正常组织之间存在探索性的区分能力，但受限于 TCGA 正常组样本量较小。未观察到与总生存期的显著关联。枢纽基因（hub-gene）和免疫分析提供了具有假设生成意义的证据，HT29 伤口愈合实验数据表明，miR-192-5p 上调可能降低细胞迁移能力。在将 miR-192-5p 视为结直肠癌中经过验证的诊断性、预后性或机制性生物标志物之前，仍需进一步的独立队列研究和针对性的湿实验验证。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢内蒙古医科大学肿瘤分子诊断实验室提供的技术支持。本研究由盐城市卫生健康委员会科研项目（项目编号：YK2023101）资助，该项目同时支付了文章处理费。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25%+2:60 胰蛋白酶-EDTA | 生物工业公司 | 03-054-1 | 细胞消化/传代 |
| 10% 过硫酸铵 | Solarbio 科学 & 科技有限公司 | A8090 | SDS-PAGE 试剂 |
| 10% 十二烷基硫酸钠 | Solarbio 科学 & 有限公司 | SIS1070 | SDS-PAGE 试剂 |
| 4x 蛋白上样缓冲液 | Solarbio 科学 & 有限公司 | P1016 | 蛋白质样品制备 |
| -80 °C 超低温冰箱 | 青岛海尔生物医疗股份有限公司 | https://www.haiermedical.com/ | 样本储存 |
| 抗Myc支原体清除试剂 | 武汉普诺赛生命科学 & 有限公司 | P-CMR-001 | 支原体去污染 |
| ARL2、BATF2、MEN1 和 β-actin 引物组 | 中国上海 Sangon Biotech Co., Ltd. | 定制合成 | mRNA qPCR 引物 |
| 自动酶标仪 | PerkinElmer，美国 | VICTOR Nivo | 吸光度测量 |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | 蛋白质定量 |
| 生物安全柜 / 洁净工作台 | 青岛海尔生物医疗股份有限公司 | https://www.haiermedical.com/ | 无菌细胞培养 |
| 细胞计数板 / 血细胞计数器 | 上海侨菁生化试剂仪器有限公司 | http://www.shqiujing.net/ | 细胞计数 |
| 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | Biosharp | BS350B | 细胞增殖/细胞毒性检测 |
| 细胞培养瓶、培养板、离心管和移液器吸头 | Corning | https://www.corning.com/in/en.html | 常规细胞培养耗材 |
| 细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒 | 中国大连美仑生物技术有限公司 | https://www.chemicalbook.com/ShowSupplierProductsList13366/0_ZH.htm | 流式细胞术细胞周期/凋亡分析 |
| CO2 细胞培养箱 | 青岛海尔生物医疗股份有限公司 | https://www.haiermedical.com/ | 细胞培养 |
| con238 阴性对照寡核苷酸 | 中国上海， Sangon Biotech Co., Ltd. | 定制合成 | 转染对照 |
| Cytoscape 软件 | Cytoscape 联盟 | https://cytoscape.org/ | 网络模块与枢纽基因可视化 |
| 数字恒温磁力搅拌器 | 常州赛普实验仪器厂 | https://czxtyq.en.alibaba.com/ | 溶液配制 |
| 电热恒温鼓风干燥箱 | 南京沃环科技产业有限公司 | https://www.wtsensor.com/about-wt/aboutwt/ | 干燥/灭菌支架 |
| 电泳系统 | 伯乐生命科学公司 | Mini-PROTEAN 3 电泳槽 | 凝胶电泳 |
| 电转移系统 | Hoefer | TE77XP | 蛋白质转移 |
| 胎牛血清 | 生物工业公司 | 04-001-1ACS | 细胞培养添加剂 |
| 流式细胞仪 | ACEA Biosciences | NovoCyte | 流式细胞术 |
| 荧光倒置显微镜 | 宁波舜宇仪器有限公司 | https://www.sunny-instrument.com/zh-cn | 细胞与伤口成像 |
| GDC/TCGA 门户 | 美国国家癌症研究所 | 开放获取数据库 | 公共miRNA-seq、RNA-seq及临床数据 |
| GEO数据库 | 美国国家生物技术信息中心 | GSE89076 和 GSE156355 | 公共基因表达数据集 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 版本 9 | 统计分析与作图 |
| 高速冷冻离心机 | 中国上海沪湘仪离心机仪器有限公司 | https://www.bioridgecentrifuge.com/ | 样品制备 |
| HT29 细胞 | 作者实验室细胞库存 | 不适用 | 人结直肠癌细胞系 |
| 图像分析软件 | ImageJ | 不适用 | 伤口宽度量化 |
| 成像系统 | 天能科技 & 有限公司 | Tanon-5200 | 凝胶/印迹成像 |
| IncuCyte S3 动态细胞观察与功能分析系统 | 北京森思万通科技有限公司 | IncuCyte S3 | 活细胞成像/功能分析 |
| 智能恒温水浴锅 | Leica | HI1210 | 温度控制孵育 |
| 慢病毒及感染试剂 | 上海吉凯基因化学有限公司 | https://synapse.patsnap.com/organization/04ffbf33ff2a6311226a8fa05498cec4 | 稳定细胞转导 |
| 手动移液器 | Gilson | PIPETMAN P | 液体处理 |
| McCoy's 5A 基础培养基 | 中国武汉普罗赛尔生命科学 & 有限公司 | PM150710 | HT29 细胞培养基 |
| 医用离心机 | 珠海制造商未指明 | 3200 | 样品制备 |
| 医用冰箱-冰柜 | 青岛海尔生物医疗股份有限公司 | https://www.haiermedical.com/ | 试剂/样品储存 |
| Meilunbio 固定剂 超敏ECL化学发光底物 | 中国大连美伦生物技术有限公司 | MA0186 | 免疫印迹检测 |
| 小型离心机 | 北京德朗科技有限公司 | https://www.dlabsci.com/ | 样品制备 |
| miR-192-5p 和 U6 引物组 | 中国北京天根生化科技有限公司 | 定制合成 | miRNA qPCR 引物 |
| miR-192-5p 模拟物 | 中国上海，桑谷生物技术有限公司 | 定制合成 | 瞬时转染 寡核苷酸 |
| miRcute 增强型 miRNA 第一链 cDNA 合成试剂盒 | 中国北京天根生化科技有限公司 | KR211 | miRNA 逆转录 |
| miRcute 增强型 miRNA 荧光定量检测试剂盒（SYBR Green FP） | 天根生化科技有限公司，中国北京 | FP411 | miRNA qPCR |
| miRWalk | 公共数据库 | 网络数据库 | miRNA-靶基因预测数据库 |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | HATF00010 | 蛋白质转移膜 |
| 脱脂奶粉 | Solarbio Science & 有限公司 | D8340 | 免疫印迹封闭试剂 |
| 配对的结直肠癌组织及相邻非癌组织 | 作者所属机构 | 不适用 | 临床样本 |
| PCR管 | Corning | PCR-02-C | PCR/qRT-PCR 反应体系的建立 |
| 青霉素-链霉素溶液 | 生物工业公司 | 03-031-1B | 细胞培养抗生素 |
| PerfectStart Uni RT&qPCR试剂盒 | 中国北京，TransGen Biotech Co., Ltd. | AUQ-01 | mRNA 逆转录与qPCR |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 生物工业公司 | 02-023-1A | 细胞洗涤缓冲液 |
| 预染蛋白质分子量标准 | Fermentas | 26619 | 蛋白质分子量标记物 |
| 纯水制备系统 | 中国莫尔 | 暂无内容 | 纯水制备 |
| 嘌呤霉素 | Phygene | PH1143 | 转导细胞的筛选 |
| R 软件 | R 统计计算基金会 | 版本 3.6.3 | 统计分析与生物信息学 |
| 快速转移缓冲液 | Crisbio | 不适用 | 蛋白质电转移 |
| 实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems (ABI)，美国 | 暂无内容 | qRT-PCR 检测 |
| RIPA 裂解缓冲液 | Solarbio 科学 & 有限公司 | R0020 | 蛋白质提取 |
| 无RNase的微量离心管 | Corning | 3208 | RNA 操作 |
| 无血清细胞冻存液 | 新细胞 & Molecular Biotech Co., Ltd. | C40100 | 细胞冷冻保存 |
| SPSS Statistics | IBM | 版本 25 | 统计分析 |
| 稳定化抗体稀释液 | Solarbio Science & 科技有限公司 | 不适用 | 一抗/二抗稀释 |
| 无菌移液器吸头 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | TP-10-C | 伤口愈合划痕工具 |
| STRING 数据库 | STRING 联合组织 | 网络数据库 | 蛋白质相互作用网络分析 |
| TEMED | Solarbio 科学 & 有限公司 | T8090 | SDS-PAGE试剂 |
| TransZol Up | 中国北京，全式金生物技术有限公司 | ET111-01 | RNA提取 |
| Tris-HCl 缓冲液，pH 6.8 | Solarbio 科学 & 有限公司 | T1020 | SDS-PAGE 浓缩胶缓冲液 |
| Tris-HCl 缓冲液，pH 8.8 | Solarbio Science & 科技有限公司 | T1010 | SDS-PAGE 分离胶缓冲液 |
| Tween-20 | Solarbio Science & 科技有限公司 | T8220 | 免疫印迹洗涤试剂 |
| 立式压力蒸汽灭菌器 | 上海波迅医学生物仪器有限公司 | BXM-30R | 灭菌 |
参考文献
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