这项回顾性病例对照研究评估了多囊卵巢综合征女性患者血清中的miR-146a、miR-642a、miR-2861及代谢标志物。研究观察到miRNA、脂肪因子、胰岛素抵抗、炎症和睾酮水平发生协调性改变，而联合生物标志物模型的鉴别效能优于单个标志物。
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这项回顾性病例对照研究评估了多囊卵巢综合征女性患者血清中的miR-146a、miR-642a、miR-2861及代谢标志物。研究观察到miRNA、脂肪因子、胰岛素抵抗、炎症和睾酮水平发生协调性改变，而联合生物标志物模型的鉴别效能优于单个标志物。
多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄女性中常见的内分泌及代谢性疾病，但循环微小RNA（miRNA）与营养相关蛋白之间的关系尚未完全阐明。本研究探讨了血清miR-146a、miR-642a和miR-2861与PCOS患者代谢及炎症标志物之间的关联。研究共纳入62名PCOS女性和71名健康对照者。采用实时荧光定量PCR法检测血清miR-146a、miR-642a和miR-2861水平，同时检测脂联素（ADPN）、瘦素（LEP）、视黄醇结合蛋白4（RBP4）、胰岛素抵抗稳态模型评估值（HOMA-IR）、白细胞介素-6（IL-6）和睾酮（T）水平。方法学验证包括样本处理条件、检测精密度以及不同分析方法间的一致性评估。与对照组相比，PCOS女性的miR-146a表达升高，而miR-642a和miR-2861表达降低；ADPN水平下降，而LEP、RBP4、HOMA-IR、IL-6和T水平升高。miR-146a与ADPN呈负相关，与LEP、RBP4、HOMA-IR、IL-6和T呈正相关；miR-642a与RBP4、HOMA-IR和IL-6呈负相关；miR-2861与ADPN呈正相关。方法学验证结果显示检测具有可接受的稳定性、精密度以及方法间一致性。联合三种miRNA与ADPN、LEP、RBP4、HOMA-IR、IL-6和T构建的模型曲线下面积达0.929，敏感性为82.26%，特异性为94.37%。这些结果表明，在PCOS中循环miRNA与代谢标志物存在协调性改变，支持进一步评估其联合用于诊断的潜力。
多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄期女性中最常见的内分泌及代谢紊乱疾病，其全球患病率估计在6%至20%之间。约70%的患者存在胰岛素抵抗，超过一半的患者超重或肥胖1。PCOS可导致排卵功能障碍、不孕、2型糖尿病、心血管疾病及其他长期并发症，从而严重影响生殖健康和生活质量2。尽管其发病机制尚未完全阐明，但目前普遍认为PCOS涉及多种因素，包括遗传易感性、慢性低度炎症、胰岛素信号通路异常以及卵巢局部微环境紊乱。在此背景下，识别能够反映疾病进展的特异性分子标志物，对于PCOS的早期诊断和精准干预具有重要意义3,4。
miRNA 是一类长度约为 22 个核苷酸的非编码 RNA。这些分子通过促进 mRNA 降解或抑制翻译来在转录后水平调控基因表达。因此，这些分子在多种细胞过程中至关重要，包括细胞生长、分化、炎症反应以及代谢调控5,6。先前的研究表明，PCOS 患者血清中 miR-146a、miR-642a 和 miR-2861 具有特征性的表达失调。miR-146a 的上调可能通过靶向调控 TLR4/NF-κB 通路介导慢性炎症反应7，而 miR-642a 和 miR-2861 表达降低则与胰岛素抵抗及卵巢颗粒细胞功能受损密切相关8,9。ADPN、LEP 和 RBP4 是与营养相关的蛋白质，在调节代谢平衡中发挥关键作用。这些蛋白水平的变化可直接影响脂质代谢、机体对胰岛素的敏感性以及炎症状态，被认为是 PCOS 中代谢异常分子基础的重要组成部分10,11。然而，大多数已发表的研究仅分别探讨了 miRNA 或营养相关蛋白与 PCOS 的关系12,13，两者之间的分子关联尚未得到系统阐明。
本研究检测了多囊卵巢综合征（PCOS）患者中三种miRNA和六种核心生物标志物的表达水平，分析了这些标志物之间的相关性及其与临床生化指标的关联，并进一步探讨了miRNA是否可能通过与营养相关蛋白的关联参与PCOS的病理过程。本研究的结果可能丰富当前对PCOS分子基础的认识，为以营养和代谢调控为目标的治疗提供潜在靶点，并为PCOS的早期筛查、疗效监测和个体化管理提供实验室依据。
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伦理声明
本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并已获得赣州市中医院医学伦理委员会的批准（批准编号：GZSZYYKYLL20240092，日期：2024-12-20）。
本方案中使用的所有材料、试剂、检测试剂盒和设备均列于材料表中。
研究设计
本回顾性病例对照研究纳入了2024年6月至2025年8月期间在中国赣州中医医院妇科门诊确诊的62名多囊卵巢综合征（PCOS）患者，以及同期在该院健康管理中⼼接受检查的71名育龄期健康女性。对照组的选择旨在实现年龄层面的组间可比性；体质指数（BMI）未作为匹配变量，而是在基线特征中进行评估。
研究对象
纳入标准：多囊卵巢综合征（PCOS）组的纳入标准如下：（1）年龄 >18 岁；（2）根据2023年国际循证指南推荐的改良鹿特丹标准诊断为PCOS，在排除相关疾病后，需满足以下三项特征中的至少两项：排卵稀发或无排卵，定义为月经周期长于35天或每年月经次数少于8次；临床表现或生化指标提示高雄激素血症，其中生化高雄激素血症定义为血清总睾酮（T）浓度高于检测方法特异的参考值上限；多囊卵巢形态，定义为单侧卵巢中至少有20个卵泡，或在无法完整计数卵泡时卵巢体积至少为10 mL14；（3）完整的电子病历资料；（4）过去3个月内未接受激素替代治疗、降糖药物或免疫抑制剂治疗；（5）在入组时采集并保存于机构生物样本库中的空腹血清样本可获取。
对照组的纳入标准如下：（1）在同一时期参加健康体检；（2）月经周期规律；（3）经阴道超声检查显示卵巢形态正常；（4）无内分泌疾病、妇科疾病、不孕症或临床显著的肝肾功能障碍病史；（5）在检查当日采集并保存于机构生物样本库中的空腹血清样本可获取。
排除标准如下：（1）子宫内膜异位症、子宫肌瘤、卵巢肿瘤、盆腔炎性疾病或其他妇科疾病；（2）甲状腺功能异常、库欣综合征、高泌乳素血症、先天性肾上腺皮质增生症或其他可能导致排卵功能障碍或高雄激素血症的内分泌疾病；（3）严重的心脏、肝脏、肾脏或肺功能障碍，恶性肿瘤，自身免疫性疾病或血液系统疾病；（4）过去6个月内有妊娠、分娩或流产史；（5）过去3个月内使用过糖皮质激素、口服避孕药或其他影响葡萄糖或脂质代谢的药物；（6）精神疾病或认知功能障碍；（7）缺乏关键临床信息；（8）严重血清溶血，定义为血红蛋白浓度＞2.0 g/L，或存在脂血、黄疸、超过一次冻融循环，或样本储存过程中出现中断。通过检测促甲状腺激素、血清泌乳素和17-羟基孕酮水平分别排除甲状腺功能异常、高泌乳素血症和非典型先天性肾上腺皮质增生症；在适当情况下复查促卵泡激素水平，当临床提示时进一步排查库欣综合征或肾上腺肿瘤。所有临床样本均采用相同的分析前处理流程，且纳入主要分析的样本均未经历超过一次的冻融循环。
血清样本的采集与保存
清晨采集空腹静脉血（10 mL）至不含抗凝剂的试管中，在室温下静置凝固30分钟，随后在4 °C条件下以1,505 × g离心15分钟。将血清分装为每份200 µL，保存于−80 °C直至分析。所有临床样本均采用相同的分析前处理程序，且纳入主要分析的样本均未经历超过一次的冻融循环。
方法学验证的样本制备
采用10份来自健康志愿者的混合血清样本，用于评估离心速度（1,505、3,000 和 4,000 × g，离心15分钟）、冻融次数（0、1、3 和 5 次循环）、储存温度（4 °C、−20 °C 和 −80 °C，储存7天）、储存时间（在 −80 °C 下储存1、3、6 和 12个月）以及溶血程度（血红蛋白浓度＜0.1、0.1–0.5 和 0.5–2.0 g/L）的影响。
实验室检测
所有实验室检测均由同一名经过培训的技术人员在标准化的环境条件下，按照预先规定的操作程序完成。血清miRNA采用qRT-PCR法进行定量；ADPN、LEP和RBP4采用夹心ELISA法测定；T和IL-6采用基于化学发光的免疫分析法测定；葡萄糖代谢相关指标则通过常规自动化实验室方法获得。
采用qRT-PCR法对血清miRNA进行定量
使用TRIzol试剂从200 µL血清中提取总RNA。由于存档的血清RNA样本无法获得分光光度法测定的RNA浓度及A260/A280纯度数据，因此通过观察熔解曲线是否呈现单一特异性峰以及三次技术重复结果的一致性来评估qRT-PCR检测的可接受性。经氯仿相分离、异丙醇沉淀及75%乙醇洗涤两次后，将RNA沉淀溶解于无酶水中。20 µL逆转录反应体系包含4 µL 5×缓冲液、1 µL逆转录酶、1 µL 10 µM茎环引物和5 µL RNA模板。反应条件为：16 °C反应30分钟，42 °C反应30分钟，85 °C反应5秒。逆转录产物储存于−20 °C。定量PCR使用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II试剂盒进行。每个20 µL反应体系包含10 µL 2× SYBR混合液、正向和反向引物各0.8 µL（10 µM）以及2 µL cDNA模板。扩增在Applied Biosystems 7500实时荧光定量PCR系统上进行，反应条件如下：95 °C预变性30秒；随后进行40个循环（95 °C 5秒，60 °C 30秒）；最后进行熔解曲线分析以确认扩增特异性。U6 snRNA作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miR-146a、miR-642a和miR-2861的相对表达水平。每个样本均设三个重复。本研究中使用的所有引物序列见表1。
血清蛋白标志物检测
采用双抗体夹心 ELISA 法测定血清 ADPN、LEP 和 RBP4 浓度，分别使用 Human Total ADPN/Acrp30 Quantikine ELISA Kit（分析灵敏度为 0.891 ng/mL，检测范围为 3.9–250 ng/mL）、Human Leptin Quantikine ELISA Kit（分析灵敏度为 7.8 pg/mL，检测范围为 15.6–1,000 pg/mL）和 Human RBP4 Quantikine ELISA Kit（分析灵敏度为 0.628 ng/mL，检测范围为 1.56–100 ng/mL）。每种检测均特异性针对相应的人源分析物，血清样本按制造商说明书进行稀释。在 450 nm 处测定吸光度，并利用四参数逻辑学标准曲线计算浓度。ADPN、LEP 和 RBP4 的批内或批间变异系数分别为 2.5% 或 3.2%、2.7% 或 3.4%、2.6% 或 3.3%。
睾酮（T）检测
采用罗氏 Cobas e601 全自动免疫分析仪，通过电化学发光免疫分析法测定血清睾酮（T）水平。
葡萄糖代谢和炎症指标检测
空腹血浆葡萄糖、空腹胰岛素和糖化血红蛋白（HbA1c）数值来自当天的常规临床检验记录，而非用于miRNA和代谢蛋白检测的存档血清分装样本。空腹血浆葡萄糖采用葡萄糖氧化酶法测定，空腹胰岛素采用免疫比浊法测定，HbA1c采用高效液相色谱法测定。胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）按以下公式计算：[空腹血浆葡萄糖（mmol/L）× 空腹胰岛素（mIU/L）]/22.5。血清白细胞介素-6（IL-6）采用化学发光免疫分析法测定。
方法学验证
替代方法的比较旨在确定主要测量结果是否对检测平台具有稳健性，而并非用于生成组间主要结果。在上述不同处理条件下，检测了三种miRNA和五种生物化学标志物的表达水平，并计算各指标的变异系数，公式为 CV = （标准差/均值）× 100%。 A CV <15% 被视为在不同样本处理和储存条件下评估检测结果稳定性的可接受标准。日内精密度通过在同一天内对同一批混合血清样本进行10次重复测定进行评估，而日间精密度则通过连续五天每天测定一次来确定。针对每个指标，计算其均值、标准差及相应的变异系数（CV）。在分析一致性检测中，使用主要检测方法和罗氏（Roche）基于化学发光的免疫分析平台，对验证样本中的五种生化分析物 ADPN、LEP、RBP4、IL-6 和 T 进行测定。采用 Bland–Altman 分析法计算95%一致性界限。所有临床 miRNA 检测均使用主要的 qRT-PCR 检测方法，而 miScript SYBR Green PCR Kit 仅在分析一致性实验中作为正交方法使用；两种 qRT-PCR 系统之间的 Pearson 相关系数被计算。
Statistical analysis
数据分析采用统计软件进行。所有连续变量首先使用 Shapiro-Wilk 检验进行正态性检验。符合正态分布的数据以均数 ± 标准差表示。 ± 标准差。两组间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，随后采用 LSD-t 检验进行两两比较。不符合正态分布的数据以中位数（四分位距）[M (P25, P75)] 表示。两组间比较采用 Mann-Whitney U 检验，多组间比较采用 Kruskal-Wallis H 检验。分类数据以频数和百分比表示。我们使用 χ2 test or Fisher’采用χ²检验或Fisher精确检验进行组间比较。根据数据分布情况，使用Pearson相关分析或Spearman秩相关分析评估变量间的相关性。作为探索性分析，在非肥胖（BMI < 28 kg/m²）和肥胖（BMI ≥ 28 kg/m²）PCOS亚组中，分别重复计算各miRNA与六种代谢标志物之间的Pearson相关性。 <28 kg/m2) and obese (BMI ≥28 kg/m2）PCOS 亚组。使用 Fisher’相关系数采用费舍尔r-z转换进行比较，所得亚组间p值经本杰明-霍赫伯格错误发现率程序校正。 p 采用 Benjamini-Hochberg 错误发现率校正法对 p 值进行校正。–Hochberg 错误发现率程序进行校正。我们使用受试者工作特征（ROC）曲线和曲线下面积（AUC）评估诊断性能。此外，我们使用逻辑回归模型分析了联合检测。所有检验均为双侧检验，且 p < p < 0.05 被认为具有统计学意义。
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研究人群的基线特征
本研究共纳入62名多囊卵巢综合征（PCOS）患者和71名健康对照者。两组在年龄、种族构成及其他基线特征方面具有可比性（p > 0.05）。相比之下，PCOS组的月经周期显著长于对照组（p < 0.001），这与PCOS的典型临床表现一致（表2）。
血清miRNA表达水平
血清miRNA分析显示，多囊卵巢综合征（PCOS）患者与健康对照组之间的表达谱存在明显差异。在PCOS组中，采用2−ΔΔCt法计算的miR-146a相对表达值为2.15 ± 0.49，较对照组升高了35.22%（p < 0.05； 图1A）。miR-642a和miR-2861的相应相对表达值分别为0.56 ± 0.12和0.46 ± 0.10，均低于对照组（p ...
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采用标准化的血清生化检测和定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR），本研究分析了62名多囊卵巢综合征（PCOS）患者和71名健康对照者的血清样本。我们发现PCOS患者中存在一种特征性的微小RNA（miRNA）和营养相关蛋白表达失调模式，并且两者之间存在显著的转录后关联。所有实验均经过严格的方法学验证。检测系统的精密度、稳定性和不同方法间的一致性均达到高质量实验室所要求的标准，支持本研究结果的可靠性。
多囊卵巢综合征（PCOS）的生化特征包括慢性低度炎症和胰岛素抵抗，这种异常的代谢微环境是营养相关蛋白表达紊乱的重要驱动因素15,16。作为人体最大的内分泌器官，脂肪组织通过自分泌、旁分泌和内分泌作用分泌多种调节全身代谢稳态的营养相关蛋白17。本研究中，PCOS患者的血清脂联素（ADPN）水平低于对照组，而瘦素（LEP）和视黄醇结合蛋白4（RBP4）水平升高。可能的解释是，ADPN通过激活AMPK通路促进葡萄糖摄取和脂肪酸氧...
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作者声明无利益冲突。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| -80 °C 超低温冰箱 | Thermo Fisher (USA) | Forma 900 | 血清样本的长期低温保存 |
| 脂联素（ADPN）ELISA 试剂盒 | R&D Systems (USA) | DY1065 | 血清 ADPN 浓度的定量检测 |
| 全自动生化分析仪 | Beckman Coulter (USA) | AU5800 | 空腹血糖、胰岛素和糖化血红蛋白的检测 |
| 全自动酶标仪 | Tecan (Switzerland) | Infinite M200 Pro | ELISA 实验中 450 nm 吸光度的测定 |
| 血糖检测试剂盒 | Beckman Coulter (USA) | A11A01 | 采用葡萄糖氧化酶法检测血清空腹葡萄糖 |
| Cobas e601 化学发光免疫分析仪 | Roche (Germany) | Cobas e601 | 电化学发光法检测血清睾酮和 IL-6 |
| 无酶冷冻保存管 | Axygen (USA) | MCT-150-C | 血清样本分装，-80 °C 超低温保存 |
| Eppendorf Research plus 移液器 | Eppendorf (Germany) | Research plus 0.5-1,000 μL | 血清吸取、RNA/试剂移液、样本分装 |
| 糖化血红蛋白（HbA1c）检测试剂盒 | Beckman Coulter (USA) | A11A03 | 采用高效液相色谱法检测血清 HbA1c |
| IL-6 检测试剂盒 | Roche (Germany) | 5200057190 | 血清白细胞介素-6 的定量 |
| 胰岛素检测试剂盒 | Beckman Coulter (USA) | A11A02 | 采用免疫比浊法检测血清空腹胰岛素 |
| 瘦素（LEP）ELISA 试剂盒 | R&D Systems (USA) | DY398 | 血清 LEP 浓度的定量检测 |
| 低温高速离心机 | 湘仪仪器（中国） | TDZ5-WS | 按指定离心力对样本进行离心 |
| miScript SYBR Green PCR 试剂盒 | Qiagen (Germany) | 218073 | miRNA 检测方法一致性的验证 |
| PrimeScript RT 反转录试剂盒 | TaKaRa (Japan) | RR036A | miRNA 反转录合成 cDNA |
| 实时荧光定量 PCR 仪 | Applied Biosystems (USA) | 7500 | miRNA qRT-PCR 扩增及荧光检测 |
| 视黄醇结合蛋白 4（RBP4）ELISA 试剂盒 | R&D Systems (USA) | DY6005 | 血清 RBP4 浓度的定量检测 |
| SPSS 统计软件 | IBM (USA) | 25 | 数据正态性检验、组间比较、相关性分析及 ROC 分析 |
| SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒 | TaKaRa (Japan) | RR420A | miRNA 荧光定量 PCR 扩增 |
| 睾酮（T）检测试剂盒 | Roche (Germany) | 5200067190 | 血清睾酮水平的定量 |
| TRIzol 总 RNA 提取试剂 | Invitrogen (USA) | 15596026 | 从血清样本中提取总 RNA |
| 无抗凝剂真空采血管 | BD Biosciences (USA) | 367812 | 采集空腹肘静脉血用于血清分离 |
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