测量药理学化合物对小鼠衰老模型中线粒体形态的影响

摘要

本方案描述了通过可植入式渗透压微型泵给药后，在衰老小鼠模型中检测药物对线粒体形态影响的方法。对小鼠肝脏进行三维（3D）超分辨率共聚焦成像，并建立了一套用于线粒体结构无偏分割、分类及定量分析的流程。

摘要

与衰老相关的分子损伤累积可能导致线粒体形态改变及代谢功能障碍，尤其在能量消耗较高的组织中更为显著。因此，能够改善代谢功能障碍并恢复健康“年轻”线粒体形态的药理学化合物，可能成为延长哺乳动物健康寿命（即个体寿命中不受衰老相关慢性疾病负担影响的阶段）的有效手段。本文描述了在老年小鼠体内进行皮下渗透泵植入的方法，以实现对疏水性药理学化合物的稳定递送。随后，对组织进行固定、冷冻切片、染色，并利用超分辨率共聚焦荧光显微镜成像。最后，介绍了一种用于线粒体结构三维分割、分类及定量测量的自动化分析流程。因此，这些方法可用于定量评估小鼠生命周期不同阶段中，多种组织内线粒体三维 结构的变化。此外，这些技术还有助于可重复地筛选出能够缓解衰老相关代谢功能障碍的小分子药物。

引言

线粒体是具有双层膜结构的细胞器，其空间和时间上的组织方式可与宿主细胞及组织当前的代谢需求相匹配¹。内膜向内凹陷形成的嵴结构，是通过非双层内膜磷脂（如心磷脂和磷脂酰乙醇胺）、位于嵴尖端的ATP合酶二聚体阵列、在嵴顶端结合心磷脂的GTP酶OPA1（Optic Atrophy 1）寡聚体，以及位于嵴连接处的线粒体接触位点与嵴组织系统（MICOS）复合物之间动态协调而形成并组织起来的¹。这些内膜结构将线粒体分隔为独立的功能单元²，并提供了更大的表面积，有利于产生线粒体跨膜电位的呼吸链复合物在其上组装¹。作为具有多种次级细胞功能的动态细胞器，线粒体参与调控凋亡信号传导³、Ca²⁺和活性氧稳态³以及脂质生物合成⁴，因此其形态结构对环境变化高度敏感，例如氧气供应减少⁵以及内质网释放Ca²⁺增加^6,7等条件均可影响其结构。

分子损伤的累积导致线粒体在衰老过程中的结构和功能发生变化⁸。Kühlbrandt 团队在多个模式生物中开展的开创性冷冻电子断层扫描（cryo-ET）研究证明，嵴密度与呼吸能力之间存在明确的相关性，并且随着年龄增长，嵴密度下降，同时伴随ATP合酶二聚体的减少^9,10。此外，线粒体体积的变化可能源于线粒体分裂与融合动态失衡¹¹、脂质积累增加¹²以及肿胀加剧¹³。在骨骼肌中，VO₂ max（最大摄氧量）是预测寿命的有力指标^14,15，其数值可根据肌原纤维间线粒体碎片化程度和嵴密度进行准确预测¹⁶。

毫不意外，线粒体在衰老过程中发生的结构和功能改变可能促进多种慢性疾病的发病机制^17,18,19,20。线粒体碎片化增加以及线粒体生物发生和形态的改变，与阿尔茨海默病和帕金森病均有关联²⁰。这些变化会导致氧化磷酸化复合物功能紊乱，损害质子驱动力的生成，并引起活性氧的过度产生^20,21,22。在与衰老相关的心脏功能障碍和心力衰竭中，线粒体碎片化增加、肿胀、空泡化以及嵴密度降低，均导致ATP生成减少^23,24。这些结构改变可能部分与线粒体Ca²⁺调控异常以及线粒体通透性转换孔活性增强有关^6,7,13,25。作为一种潜在的线粒体自噬调控因子，在衰老过程中通透性转换孔的过度开放反而可能具有破坏性，并导致不受控制的细胞死亡¹³。最后，已知与衰老相关的线粒体脂质代谢障碍和线粒体自噬功能缺陷也可能促进非酒精性脂肪性肝病的发展²⁶。特别是，已有研究表明，肝脂肪变性常伴随氧化应激增加以及环状线粒体结构的形成增多^3,27。

因此，人们对于开发靶向衰老相关线粒体功能衰退的治疗方法具有浓厚兴趣，以改善某些慢性疾病患者的生活质量。Forzinity（elamipretide）是一种可与脂质相互作用的肽类，能够减弱线粒体内膜表面电位²⁸，并提高线粒体ATP生成^29,30，最近成为首个获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗Barth综合征的线粒体靶向药物。Barth综合征是一种X连锁遗传病，其心磷脂重塑缺陷可导致心肌病、骨骼肌无力以及早亡³¹。尽管短期治疗在老年小鼠中未能产生可检测的肌肉生物学年龄变化³²，但elamipretide治疗已多次显示出对衰老相关功能指标的改善作用，例如心脏射血分数和整体纵向应变^32,33、肌肉疲劳与力量生成^33,34,35，以及虚弱状态³²。Urolithin A是一种由肠道产生的鞣花单宁代谢物，可诱导线粒体自噬³⁶，在临床研究中也显示出对有氧肌肉耐力和肌力的改善作用^37,38，此外在老年小鼠及诱导性心力衰竭的大鼠模型中对心脏功能障碍具有积极效应³⁹。二甲双胍是一种已知可作用于复合物I的抗糖尿病药物⁴⁰，也被认为可能部分模拟热量限制的效果^41,42。然而，尽管流行病学数据显示二甲双胍治疗与癌症风险降低及认知衰退延缓相关^43,44，其对非糖尿病患者健康寿命和寿命的影响仍 是一个未解问题⁴⁵。最后，使用烟酰胺核糖（nicotinamide riboside）——一种NAD+前体——进行治疗，可以上调线粒体生物合成和线粒体未折叠蛋白反应，从而改善能量生成^46,47,48,49，但在UM-HET3小鼠中的长期治疗并未显著影响小鼠的中位寿命或第90百分位寿命⁵⁰。

本文描述了从经药物化合物处理的老年小鼠中制备组织的方法，用于线粒体形态的超分辨率共聚焦成像。文中展示了在小鼠体内成功植入渗透压微型泵以实现持续给药的技术，并分析了肝脏中外膜结构在药物处理后的变化。最后，提供了一套分析流程，可对线粒体体积、表面积和球形度进行无偏、可重复的定量测量，并将线粒体分类为不同结构类型。因此，这些方法不仅适用于研究哺乳动物生命周期中线粒体形态的变化，也可用于鉴定可能缓解衰老相关代谢健康下降的药理化合物。

方案

所有涉及实验动物的操作均遵循实验室动物使用机构指南，并经布里格姆妇女医院和哈佛医学院机构动物护理与使用委员会根据协议编号 2016N000368 批准。其他各国研究人员若有意应用本方案，应咨询当地机构及监管机构，以确保符合适用的动物福利法规。

1. 皮下渗透泵植入

注意：动物手术应仅由经验丰富且经过培训的人员执行，并需极度谨慎以尽量减少动物的应激和/或痛苦。涉及实验动物的操作必须严格按照已批准的动物实验方案中所述内容进行。所有涉及动物使用的科学研究均须严格遵守“3R原则”——替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement）。本方案详细描述了皮下渗透泵植入术，该操作被归类为小型外科手术。腹腔内渗透泵植入术也可实施，但该操作更为复杂，属于大型外科手术。因此，除非有充分的科学依据支持腹腔内植入，否则建议采用皮下植入方案。

1. 渗透泵的填充
   注意：药物溶液的制备和渗透泵的填充应在生物安全柜中采用无菌技术进行。应根据所需的储液室体积和治疗给药时长选择合适的泵型号。本研究中使用的是型号2004（约200 µL储液室体积，可持续给药4周）。
   1. 在与渗透泵兼容的溶剂中配制药物溶液。参考 https://alzet.com/formulating-the-solution/。根据订购的渗透泵批次上列出的流速（µL/h），确定达到目标日剂量所需的药物浓度。
      注意：50% v/v DMSO 和 50% v/v PEG₃₀₀ 的混合溶液可稳定溶解疏水性化合物，并与渗透泵兼容。所有化合物和溶剂应尽可能使用药用级试剂。
   2. 使用0.22 µm针筒滤器对药物溶液进行过滤除菌，并在室温下保存。
   3. 将流控调节器插入泵中，并轻轻推入直至其进入微量离心管内。切勿将流控调节器完全推到底部。
   4. 将分析天平归零于空的微量离心管上，然后记录渗透泵的重量。
   5. 将填充管连接至1 mL注射器，并吸取至少1.5倍泵储液室体积的液体。通过拉动活塞、轻弹注射器并向上推动，排出气泡，直至填充管顶部出现液体。
   6. 保持泵直立，取出流控调节器。
   7. 将填充管从泵顶部开口插入，直至无法再深入为止。
   8. 保持泵直立，缓慢推动活塞。持续填充，直至溶液从出口端溢出。然后拔出填充管，并用无尘纸擦拭掉多余液体。
   9. 插入流控调节器，直至其帽端与泵顶部齐平。
   10. 将已填充的泵放回微量离心管中称重。计算溶液重量，并确认填充体积至少达到储液室体积的90%（重量差值以毫克计 ≈ 体积以微升计）。
   11. 取15 mL锥形管，加入5 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS），放入预填充的泵。用石蜡膜密封，并在37 °C下孵育所需时间以启动泵（根据渗透泵型号而定）。对于型号2004，孵育时间为40小时。
2. 美洛昔康的配制
   注意：该操作应在生物安全柜中采用无菌技术进行。美洛昔康是一种非甾体抗炎药（NSAID），不属于管制药品，但采购时可能需要持有管制药品许可证。
   1. 使用27G针头和3 mL鲁尔锁注射器，在5 mL无菌玻璃小瓶中用无菌PBS将5 mg/mL的美洛昔康原液稀释至1 mg/mL。应在当天配制，并在室温下保存。
3. 手术区域准备
   注意：无需在生物安全柜内进行渗透泵植入手术，且手术过程中也无法维持完全无菌状态。然而，手术区域仍应遵循严格的清洁标准和无菌操作规范。手术区域应保持整洁、无杂物，并尽量减少人员走动。理想情况下，应设有准备区（用于剃毛和消毒）和手术区（用于实施泵植入）。
   1. 使用70%乙醇彻底消毒手术区域，并用纸巾擦干。
   2. 开启玻璃珠灭菌器，并设定温度为250 °C，预热15–30分钟。
   3. 开启麻醉蒸发器，并将加热板设置为65%。设定动物体重，并将异氟烷浓度设为3.2%。
   4. 将一根温度探头用胶带固定在加热板表面，使加热板升温至35–37 °C。
   5. 取下蒸发器注射器。将绿色卡扣完全推入，连接异氟烷瓶并回拉活塞，以填充异氟烷。
   6. 将注射器重新连接至蒸发器，并启动预充程序。
   7. 在清洁的动物笼下方放置第二个加热板，用于术后恢复。将笼子一半置于加热板上，另一半置于其外。
4. 泵植入手术
   注意：所有外科器械应提前清洗并高压灭菌。在动物间重复使用器械时，可使用玻璃珠灭菌器进行灭菌，但仅适用于最多5只动物的批次。务必使用高压灭菌指示条，以验证灭菌条件是否达标。正确的个人防护装备（PPE）包括洁净实验服、外科口罩、无菌外科手套和头部覆盖物。接受手术的动物不应处于其他动物的视线范围内。
   1. 抓住小鼠尾根部，将其放入麻醉室。断开管路，开启异氟烷气流（3.2%）至麻醉室。在加热板上铺两张已灭菌的铺巾。
   2. 等待小鼠侧卧，并监测其呼吸。当呼吸变慢且放松时，停止向麻醉室供异氟烷。将管路连接至麻醉室，断开与鼻罩的连接，准备切换。开始向鼻罩输送异氟烷（2%）。
   3. 从小鼠麻醉室取出小鼠，将其鼻子插入加热板上的鼻罩中。在双眼涂抹眼用软膏。
   4. 将小鼠放在天平上称重，然后放回鼻罩。计算需注射的1 mg/mL美洛昔康体积。按5 mg/kg剂量计算时，将小鼠体重（克）乘以5，即为所需注射的美洛昔康微升数。
   5. 用70%乙醇喷洒1 mg/mL美洛昔康小瓶瓶盖，并用无尘纸擦干。然后使用0.3 mL胰岛素注射器抽取正确体积的美洛昔康，并排除所有气泡。
   6. 用一只手抓握/固定小鼠，使其头部向下倾斜。在腹部右下象限以30°–45°角、针尖斜面向上插入针头。回抽确认针头位置正确。
   7. 若无回抽液体，平稳下压活塞，将美洛昔康经腹腔注射。
   8. 将小鼠放回鼻罩和加热板上。使用手术剪对植入部位（背部中上部）周围150%的区域彻底剃毛。完成后，轻轻用吸尘器或刷子清除动物身上的毛发，并丢弃第一张铺巾。
      注意：彻底剃毛是实施无菌手术的必要条件。至少应确保切口区域完全无动物毛发残留。
   9. 调整小鼠位置，使其头部朝向术者。使用棉签交替涂抹聚维酮碘和70%乙醇，共进行3次消毒。务必从计划切口的中心开始，用棉签向外螺旋式涂抹。
   10. 用无菌带窗手术巾覆盖动物，并采用规范无菌技术佩戴外科手套。
   11. 在进行任何切口前，务必使用组织镊牢固夹捏双足，仔细检查足底反射。只有在多次按压后 均无反应时，方可继续操作。这表明动物已达到外科麻醉深度。
   12. 用组织镊提起肩胛中部皮肤，使用小型虹膜手术剪沿垂直于脊柱方向做1 cm切口。为获得直线切口，应使虹膜剪与小鼠呈90°角进行切割。
   13. 在切口内使用小型止血钳分离皮下组织，形成容纳泵的囊腔。确保泵的囊腔远离动物前部，并略微偏向一侧。使用止血钳松解切口四周的皮肤。
   14. 用组织镊打开切口，使用止血钳将泵插入囊腔。插入时应使流控调节器先入。
       警告：泵应充分远离切口，以避免切口周围皮肤受张力。若位置不当，可能导致伤口裂开。此外，泵可能在动物恢复期间发生移位。
   15. 使用组织镊轻轻提起皮肤，将切口两侧对齐。从切口一端开始，使用缝合夹施加器沿整个切口放置7 mm伤口夹（可能需要2–4个夹子）。
   16. 对于因间隙过小而无法使用额外伤口夹的部位，使用无菌涂抹棒涂抹少量组织粘合剂，并用组织镊捏合闭合。
   17. 轻轻牵拉并拉伸切口周围的皮肤，确认伤口已完全闭合。然后关闭鼻罩的异氟烷气流，并夹闭相应管路。将小鼠放入加热板上的恢复笼中。
   18. 持续监测小鼠直至其苏醒并能自由活动。频繁观察动物是否有痛苦或不适迹象，并在完全恢复前将其与其他小鼠隔离。
   19. 24小时后，通过腹腔注射再次给予5 mg/kg美洛昔康。（可选）为促进动物恢复，可提供Electro-Gel营养补充剂和/或把食物放在笼底。
   20. 10–14天后，再次使用异氟烷麻醉动物，涂抹眼用软膏，并使用夹子移除器取下伤口夹。
       注意：必须在此时间范围内移除夹子，以避免伤口夹被新生毛发覆盖。此外，所有渗透泵均有明确的使用期限。务必在使用期限结束前取出泵或实施安乐死。对于更长的治疗周期，可在同一只动物上连续进行多次泵植入手术。

2. 组织的固定、包埋与切片

1. 组织固定
   注意：所有动物操作均应由经验丰富的人员执行，以最大程度减少动物的应激和痛苦。每次使用后，安乐死舱室应进行清洁并彻底清空，以去除残留的二氧化碳。为减少应激，应尽可能在动物的原饲养笼内实施安乐死。最后，不得在空间上靠近其他小鼠或在其视线范围内实施安乐死。非存活性操作需要使用清洁的手术器械，但无需灭菌（即无需高压灭菌）。
   1. 将小鼠放入诱导舱，打开调节阀，使流量计达到目标流速（约为舱室体积每分钟的40%–70%）。
   2. 在整个过程中持续观察小鼠，确保无跳跃等痛苦迹象。监测呼吸活动是否停止，并在呼吸停止后继续维持CO₂气流至少2分钟。确保暴露于CO₂的总时间不少于5分钟。
   3. 取出小鼠，并采用颈椎脱位等二次安乐死方法。
   4. 使用23号针头将动物四肢固定在覆盖铝箔的聚苯乙烯泡沫板上。用70%乙醇喷洒湿润毛发。
   5. 在腹部基部附近做一小切口，沿腹中线向上切至颈部。沿同一切口打开体腔，并小心剪开肋骨。
   6. 从腹部基部开始做U形切口，并用23号针头将皮肤向上固定。
   7. 解剖出相关器官并置于预先加入5 mL 4%多聚甲醛（PFA）的15 mL锥形管中。在4 °C条件下于旋转器上固定24小时。
      警告：PFA溶液具有危害性，避免接触皮肤。操作时应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、腈类手套和护目镜。
      注意：若需从组织中灌注血液和/或希望进行灌注固定，请按照先前描述的方法进行心脏灌注⁵¹。在本实验所采用的浸入式固定中，固定剂可能需要一定时间才能扩散至组织内部，尤其对于较大组织块。这可能影响线粒体形态；此外，PFA固定还可能导致组织收缩⁵²。
   8. 24小时后，移除多聚甲醛溶液，并用10 mL 1× PBS冲洗组织。在室温下于旋转器上重复此步骤共3次，每次10分钟。
   9. 移除PBS，将组织浸入10 mL 30%蔗糖溶液中，在4 °C条件下于旋转器上孵育48小时。当组织完全沉底时，表明蔗糖已充分渗透。
      注意：为验证溶剂已成功递送至动物体内，可测量泵中剩余的药量。
2. 组织包埋
   注意：务必记录组织在模具中的位置和方向。
   1. 准备一个聚苯乙烯泡沫容器，装入干冰，并在其上方平放一块金属板。
   2. 将模具置于金属板上，加入最佳切割温度（OCT）包埋剂（组织包埋介质），填充至模具高度的2/3至3/4处。使用精细镊子将气泡赶至表面或角落。为加快冷冻速度，可将少量干冰颗粒直接贴附于模具外侧。
   3. 取适量组织包埋介质置于称量舟中，将组织混入其中，尽量避免带入蔗糖溶液。
   4. 当模具底部的包埋介质完全冻结（呈现完全不透明状态）后，将组织放入模具中，确保其不接触模具任何侧壁或表面。按所需位置和方向放置。
   5. 待包埋介质完全冻结后，再将模具转移至-80 °C超低温冰箱中。
      注意：（暂停点）包埋后的组织可在-80 °C保存至少3个月。
3. 组织切片
   注意：为减少批次间切片厚度的差异，所有需同时分析的组织应在同一次切片过程中完成。
   1. 从-80 °C超低温冰箱中取出包埋好的组织，放入装有干冰的聚苯乙烯泡沫容器中。
   2. 将冷冻切片机舱室温度和样本夹持器预冷至-24 °C和-25 °C。
   3. 在刀架上安装新的切片刀片，并插入防卷板。为便于清理，可在冷冻切片机舱室内铺上纸巾。
   4. 将样本夹头从冷冻切片机舱室中取出，并升温至室温。
   5. 使用剃刀小心地切去组织模具的每个角落，轻轻撬开以取出包埋介质块。
   6. 将组织块用力压入样本夹头，同时轻微来回扭转。待其牢固粘附后，将夹头放回冷冻切片机舱室中冷冻数分钟。
      注意：务必以正确方向将组织块安装在夹头上，以确保切片方向符合实验设计要求。
   7. 当组织块完全冻结于样本夹头后，将夹头装入夹头座并拧紧固定。移动冷冻切片机刀片，使其刚好位于组织块前方但不接触。
   8. 将修片厚度设为50 µm，开始修块，直至暴露出完整的组织横截面。
   9. 取消修片模式，将切片厚度设为20 µm。在此厚度下先切几片，再降低防卷板。缓慢而平稳地切割约80%–90%的切片后停止。
   10. 抬起防卷板。取一张带电荷的玻璃载片，将带电面按压到切片上，使其按所需位置贴附。
       注意：若抬起防卷板后切片发生卷曲，可用细毛刷将其展开。
   11. 将夹头从夹头座上取下，再从冷冻切片机中取出并升温至室温。将组织块从夹头上取下，放回原模具中。
   12. 用锡箔纸包裹模具，防止组织块脱落，然后放回-80 °C超低温冰箱。
   13. 将已贴片的组织切片置于-20 °C保存。
       注意：（暂停点）组织切片可在-20 °C长期安全保存。

3. 免疫荧光染色

1. 取出冷冻切片，在37℃下干燥10分钟 °在培养箱中。
2. 洗去切片上多余的组织包埋介质。
   1. 配制 1 L 的 1× 含0.1% v/v Triton X-100的PBS（PBS-T）
   2. 用 PBS-T 填充 3 个染色缸。
   3. 将载玻片放入载玻片架中。浸入染色缸中染色10分钟，重复操作，共3次。
3. 对组织进行染色封闭。
   1. 轻轻敲击每张载玻片，使其在精细擦拭纸上干燥。将载玻片平放于载玻片盒中，组织面朝上。
   2. 配制20 mL的封闭液，其中含1× PBS、0.3% v/v Triton X-100 和 5% w/v 牛血清白蛋白（BSA）
   3. 将1 mL封闭液用移液器加至每张载玻片上，确保组织完全覆盖。
   4. 室温孵育1小时。
4. 用一抗孵育组织。
   1. 轻轻敲击每张载玻片，使其接触一张精细擦拭纸以吸干液体。再用另一张精细擦拭纸轻轻吸除组织切片间残留的液体。
   2. 配制 Tom20 兔源抗体 1:200 的稀释液 α-小鼠抗体置于封闭液（200 µL 每片
   3. 在载玻片盒底部放置纸巾，并用清水将其完全浸湿。
   4. 将载玻片平放于载玻片盒中，组织面向上。用移液器加入200 µ将稀释的一抗溶液 L 加至每张载玻片上，确保组织完全覆盖。
   5. 将石蜡膜切成与待用盖玻片大小相近的片状，每张载玻片准备1片石蜡膜。
   6. 将每片石蜡膜放置于每张载玻片上，使抗体稀释液均匀覆盖组织切片。盖上载玻片盒，于4℃孵育 °C 过夜。
5. 一抗孵育后，洗涤载玻片。
   1. 用 PBS-T 填充 3 个染色缸。取出载玻片并去除石蜡膜碎片。
   2. 将载玻片放入载玻片架中。浸入染色缸中染色10分钟，重复操作，共3次。
6. 将切片在二抗中孵育。
   注意：为确认线粒体的特异性标记，需从每组中至少制备一张仅用二抗染色的切片。
   1. 轻轻敲击每张载玻片，使用精细擦拭纸吸干。再用另一张精细擦拭纸轻轻吸除组织切片间残留的液体。
   2. 制备1:200稀释的山羊 α-兔 Alexa Fluor 568 抗体和 5 µg/mL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）置于封闭液（200 µ每片L
   3. 将载玻片平放于载玻片盒中，组织面向上。用移液器加入200 µ将稀释的二抗各 L 加至每张载玻片上，确保组织完全覆盖。
   4. 将石蜡膜切成与待用盖玻片大小相近的片状，每张载玻片准备1片石蜡膜。
   5. 在每张载玻片上放置一片Parafilm，以使抗体稀释液均匀覆盖组织切片。盖上载玻片盒，于室温孵育4 h，或于4 °C孵育过夜。 °C 过夜。
7. 洗涤盖玻片。
   注意：使用塑料镊子夹取和操作盖玻片
   1. 一次将盖玻片放入盛有热水和玻璃器皿清洁剂（如 Contrad 70）的烧杯中。用一层帕拉膜封住烧杯。
   2. 在浴式超声仪中超声处理30分钟。
   3. 用热水反复冲洗数次，再用双蒸水冲洗数次。最后一次双蒸水冲洗时进行超声处理15分钟。
   4. 将盖玻片置于70%乙醇中保存。准备封片时，将盖玻片从70%乙醇中取出，在通风橱中自然晾干。
8. 二抗孵育后，洗涤载玻片。
   1. 用 PBS-T 填充 3 个染色缸。取出载玻片并去除石蜡膜碎片。
   2. 将载玻片放入载玻片架中，浸入染色缸内 10 分钟，重复操作共 3 次。
   3. 轻轻敲击每张载玻片，使用精细擦拭纸吸干液体。再用另一张精细擦拭纸轻轻吸除组织切片间残留的液体。
9. 安装盖玻片。
   1. 在载玻片上加入2–3滴均匀分布的抗荧光淬灭封片剂。
   2. 为避免产生气泡，取一块清洁的 #1.5 盖玻片，以 45 度角夹持° 沿载玻片长轴方向倾斜盖玻片，轻柔缓慢地将其覆于载玻片上。所有载玻片均重复此操作。
   3. 将载玻片在室温下避光孵育18–60小时。
   4. 将载玻片置于 4 °避光保存。
      注意：（暂停点）载玻片可在固化后立即成像，或在4℃保存条件下于1个月内成像。 °C. 无需密封边缘。务必使用#1.5或#1.5H盖玻片，因为其他厚度可能导致球面像差并降低图像质量。不要使用含DAPI的封片剂，因为DAPI具有较宽的激发和发射光谱。固化时间取决于样本厚度；此处为48 h。

4. 超分辨率成像

注意：本方案使用基于 ZEISS Axio Observer Z1 构建的 ZEISS Airyscan2 点扫描 LSM 980 共聚焦显微镜，配备两个多碱光电倍增管（PMT）、一个 32 通道 GaASP 光谱探测器、环境控制舱，以及 Plan Apo 63×/1.4 油浸微分干涉差（DIC）III 物镜。 

1. 设置图像采集。
   1. 添加单个 Airyscan SR 通道，并选择合适的荧光染料。
   2. 选择 10" plate 以及适当的发射带通滤光片。
      注意：该 10" plate 是此显微镜专用的，因为它还配备了红外（IR）探测器。
   3. 选择合适的激光器。通过点击 SR 将 奈奎斯特采样标准 设为 2（像素大小应调整为 0.05 µm）。
   4. 点击 live 并对 Airyscan 探测器进行校准（选择实时校准功能）。当信号强度集中在探测器图标中心且探测器显示为绿色时，点击 stop。
      注意：如果所有设置正确，软件左侧会显示一条消息：“"Airyscan settings are successfully optimized"”。
   5. 再次点击 live，并调节 激光强度，以获得良好的信号且无饱和像素（点击范围指示器）。优化完成后点击 stop。
      1. （可选）若要在不调节激光功率的情况下增强信号，可提高 增益。
2. 执行数据采集。
   1. 点击 z-stack，并确认 步进大小 设置为 0.1 µm（若不是，则进行调整）。
   2. 点击 live，设定 z-stack 的上下边界。
   3. 点击 start experiment。
   4. z-stack 采集完成后，转到图像下方的 Airyscan 选项卡，点击 process 3D。不同重复样本和处理组之间应保持此处使用的去噪维纳滤波参数一致。
   5. 保存处理后的 Airyscan z-stack。
      注意：若使用两个 Airyscan SR 通道，需确保显微镜在每帧之间切换通道。

5. 建立用于量化线粒体形态的自动化分析流程

注意：本方案描述了使用 ZEISS arivis Pro 软件 4.1.2 开发用于线粒体形态三维定量分析的自动化图像分析流程。

1. 使用 arivis 转换工具 将 Airyscan 处理后的 .czi 文件转换为 .sis 格式。
   注意：如果完整图像较大，且在参数优化过程中处理时间过长，可裁剪图像中一个具有代表性的较小区域作为工作参考，用于优化设置。该裁剪区域应同时包含孤立良好的线粒体和密度较高的区域，以准确代表整个图像视野。在裁剪图像上实现满意的分割后，即可将优化后的流程应用于完整的图像集。此方法可显著节省时间，并在不降低流程质量的前提下更方便地调整所有参数。
2. 建立并优化流程。
   1. 在软件中打开一幅代表性图像（例如来自对照组的图像）。
   2. 选择 Tom20 免疫荧光通道 作为分析的输入通道。
   3. 在分割前进行去噪处理。此处使用了颗粒增强算法，直径设为 5.42，强度设为 0.5。
      注意：颗粒增强滤波器是一种结构保持型去噪算法，旨在放大紧凑、近似球形或细长的物体，同时抑制背景噪声。该算法通过在指定空间尺度（直径）上增强局部强度实现，特别适用于线粒体，因为线粒体在暗背景下表现为明亮、孤立的颗粒或管状结构。若直径参数设置过小，会增强噪声；若设置过大，则会使相邻物体模糊成一体。强度参数控制增强程度，高值可增强信号放大效果，但若设置过高可能引入伪影。建议从默认值开始，同时在代表性感兴趣区域上目视检查输出结果进行调整。arivis Pro 中提供了多种去噪方法。高斯平滑是一种简单快速的选项，可均匀降低高频噪声，但可能模糊精细结构细节。中值滤波在去除椒盐噪声的同时更有利于保持边缘锐利。当目标是检测离散的荧光物体时，推荐使用颗粒增强法（本研究采用），因为它选择性地放大符合指定尺寸范围的结构信号。对于信噪比较低或背景异质性显著的图像，可能需要更强的去噪处理。建议在同一代表性图像上测试两到三种方法，并比较后续分割质量。
   4. 使用 Blob Finder 算法 对单个线粒体进行分割，该算法可在三维空间中检测物体。
   5. 调整分割参数，包括 物体大小 和 敏感性阈值，并通过目视检查检测到的物体与去噪后图像的重叠情况，以确保分割准确。本研究中使用的参数如下：直径为 0.244 µm，概率阈值为 25%，分裂敏感度为 22.22%，归一化设置为第一个起始点。
      注意：分割参数取决于图像分辨率和体素大小。本研究中，图像尺寸为 1354 × 1354 像素，XY 像素大小为 0.049 µm，体素大小为 0.049 × 0.049 × 0.100 µm³。
3. 执行特征提取与质量控制。
   1. 提取每个检测到的物体的形态学参数，包括体积（µm³）、表面积（µm²）和球形度（具有相同体积的球体的表面积 / 线粒体的表面积）。
   2. 将分割后的物体导出为 TIFF 文件，用于视觉验证。
   3. 在 FIJI 或 arivis 中打开导出的文件，并将其与原始图像叠加，以目视检查分割的准确性。
   4. 将定量测量结果以单个电子表格文件的形式导出，每个样本一个文件。
4. 应用流程。
   1. 保存已优化的流程。示例流程见 补充文件 1。
   2. 将该流程应用于本研究中所有实验组的其他图像。
   3. 如有需要，可迭代优化分割参数，以确保在所有实验组中保持一致的性能。
   4. 最终确定后，以批处理模式将该流程应用于本研究中的所有图像。
5. 进行数据分析
   1. 将导出的数据导入 RStudio（版本 4.3.2）进行统计分析。
   2. 若尚未安装，请安装以下软件包：readxl、dplyr、tidyr、purrr、ggplot2、ggpubr、patchwork、scales、randomForest、caret、umap、factoextra、RColorBrewer、mclust、outliers 和 tidyverse。
   3. 上传脚本（补充文件 2），用于合并所有数据集、过滤数据（见下文）、绘制体积、表面积和球形度值，并分析每个样本中线粒体亚型的比例。
   4. （可选）根据体积对分割后的线粒体进行过滤，以排除分割伪影和噪声。
      1. 为确定合适的过滤条件，需目视检查体积分布。
         注意：所有样本在极小体积（低于 0.0003 µm³）处均出现明显峰值，符合分割噪声而非真实线粒体的特征。
      2. 为确定下限，评估候选阈值（0.0009、0.003、0.005、0.007 和 0.01 µm³）下的颗粒保留情况。颗粒数量在 0.003 µm³ 以下时下降最为剧烈，表明大多数噪声颗粒集中在此范围内。目视检查确认 0.003 µm³ 对应于噪声峰的右边缘。
      3. 对于上限，分布自然衰减至远低于 10 µm³；设置此限值以排除如过度分割的线粒体网络等大型伪影物体。最终过滤保留体积在 0.003 至 10 µm³ 之间的颗粒。
         注意：该脚本计算每个样本中所有检测到的线粒体的中位数值，并将这些中位数作为分析单位。此方法可校正同一生物样本内各个线粒体之间的非独立性。

结果

上述方案已在20月龄雄性UM-HET3小鼠中实施（图1）。通过2004型渗透压微型泵⁵³，向小鼠给予溶剂（对照组）或化学重编程混合物（处理组）。随后，对肝脏进行切片，并在Airyscan2共聚焦显微镜下成像，再对z轴堆栈图像使用分析流程进行处理。

使用 ZEISS arivis Pro 软件 4.1.2 对 3D 荧光图像进行处理和分析。在对线粒体进行分割之前，应用粒子增强算法对图像进行去噪，并去除背景、离焦光、自发荧光和/或非特异性结合产生的荧光。粒子增强可选择性地放大特定直径范围内的信号。去噪后，采用 Blob Finder 算法在 3D 空间中对单个线粒体进行分割，该算法基于定义尺寸范围内局部强度最大值来检测目标。最后，目标分割将每个 2D 切片简化为二值图像。

为了说明分割工作流程，图2展示了对照样本和处理样本在处理流程各个阶段的代表性光学切片。原始荧光图像显示了未经处理的Tom20信号，其中包含特异性线粒体荧光以及不需要的背景信号、离焦光和自发荧光。在应用颗粒增强去噪处理后，背景信号显著降低，剩余荧光被限制在离散且边界清晰的结构中（图2）。这使得线粒体边界的呈现更加清晰，有助于实现精确的分割。

Blob Finder 分割的结果以绿色显示。为确认 z 轴层叠图像被准确分割，将去噪后的二维切片与其对应的分割二值图像进行叠加（图2）。若分割过程已充分优化，则应观察到线粒体荧光信号与二值化对象之间具有强且一致的共定位。若分割过程存在过分割（即将单个线粒体分割为多个对象）或欠分割（即将多个线粒体合并为一个对象）的情况，需调整分割参数。对插图的目视检查证实了高质量的分割效果：检测到的对象与去噪后的 Tom20 荧光信号精确共定位，未见任何过分割、对象尺寸过大、空间上相邻的线粒体被不当合并为单一对象，或在无 Tom20 信号区域产生虚假对象的现象。此类高保真分割效果在对照组和处理组样本中均稳定实现，表明在 ZEISS arivis 软件中优化的分析流程参数在各实验组间具有稳健性和普适性。综上，这些结果验证了所采用的分割方法，并支持由此获得的形态学测量数据的可靠性。

可对分割出的物体测量线粒体参数，如体积、球形度和表面积（图3）。为考虑每个生物样本中检测到的线粒体数量较多以及细胞内各个细胞器之间的非独立性，采用每个样本的中位数值作为统计比较的基本单位。组间差异通过Wilcoxon检验进行评估。与对照组相比，处理组样本表现出显著更高的线粒体体积和表面积，表明化学重编程可诱导线粒体形态发生显著重塑。

最后，可将分割出的线粒体分类为不同的亚型^54,55（图4）。采用肘部法⁵⁶确定k-均值聚类^57,58的最优聚类数量（图4A）。随后，使用k = 4个聚类，通过均匀流形近似与投影（UMAP）降维方法对对照组和处理组的线粒体随机子样本进行作图（图4B），并根据线粒体亚型（左图）和处理分组（右图）进行着色。最后，绘制了对照组和处理组中各线粒体亚型的比例（图4C）。在处理组中，片段化线粒体的比例减少，但网络状或伸长型线粒体的比例未发生显著变化。

图1：实验方案概览。通过皮下植入渗透压微泵，对小鼠进行药物或对照溶剂处理，持续时间最长可达6周（1）。处理结束后，固定小鼠组织，经蔗糖浸润后包埋于OCT包埋剂中，并进行冷冻切片（2）。随后使用抗Tom20抗体及Alexa Fluor 568标记的二抗对组织切片进行染色（3）。在Airyscan2点扫描共聚焦显微镜上采集超分辨率z轴层扫图像（4），并将去噪处理后的z轴层扫图像导入arivis软件进行分割，以定量分析线粒体形态（5）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：线粒体分割与形态学分析的自动化流程。
来自对照组（上排）和处理组（下排）样本的代表性单层光学切片图像。Tom20 免疫荧光信号以灰色显示（左侧）。同一图像经去噪处理后仍以灰色显示，随后展示分割结果，其中检测到的线粒体结构以绿色高亮显示。合并图像显示了去噪信号与分割结构之间的重叠情况。插图为指定区域的高倍放大视图，用于展示去噪效果及分割的准确性。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：对照组与处理组线粒体形态学特征。箱线图显示每样本中位数的中位数 ± 四分位距（每组 n = 10）。每个圆点代表一个生物学样本，其值为该样本内检测到的所有线粒体的中位数值。体积和表面积以 log₁₀ 刻度显示。组间比较采用 Wilcoxon 秩和检验。显著性水平：ns p ≥ 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。 请点击此处查看该图的高清版本。

图 4：线粒体亚型的无监督形态计量学分类。（A）肘部法则图，显示基于随机选取的 10,000 个线粒体亚群计算得到的簇内总平方和（WSS）随簇数（k）变化的情况。在 k = 4 处的拐点被选为下游分析的最佳簇数。（B）（左）线粒体形态计量特征的 UMAP 降维图（n = 20,000 个随机采样的线粒体），按指定亚型着色。共识别出四种形态上不同的亚型：碎片化型（体积小，球形度高）、伸长型（长度长，球形度低）、网络化型（体积大，形状不规则）和中间型。（右）按实验组别（对照组 vs. 处理组）着色的 UMAP 投影图，显示各组在形态空间中的分布情况。（C）每一样本中各线粒体亚型在不同实验组中的比例。每个数据点代表一个生物学样本（每组 n = 10）。箱线图显示四分位距和中位数，须线延伸至 1.5 倍四分位距。使用 Wilcoxon 秩和检验比较组间亚型比例，并采用 Benjamini-Hochberg 方法对 p 值进行多重比较校正。ns p ≥ 0.05，****p < 0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1：arivis 软件示例流程。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：用于量化线粒体形态和亚型群体的 R 脚本。请点击此处下载该文件。

讨论

成功实施本方案最关键的两个步骤是：（i）渗透泵植入过程中切口的闭合，以及（ii）准确的分割。对于前者，需特别注意创建一个足够容纳泵体但又不会过大导致泵体滑向动物体侧的皮下囊袋。闭合切口时，应确保泵体放置位置足够远离切口，以免对周围皮肤造成张力，从而引发伤口裂开。在开始动物恢复前，务必从各个方向牵拉闭合切口周围的皮肤，以确认伤口已充分闭合。伤口夹具有应用和移除快捷的优点，是优选方式；然而，若无法妥善闭合切口，可改用间断缝合。对于后者，准确的分割要求持续将分割结果与去噪后的图像进行比对，直至两者具有足够的图像相似性。对照组与处理组动物的Z层扫描图像必须采用相同的采集参数获取，并尽可能在同一次成像过程中完成。同样，所有图像的处理步骤也必须使用完全相同的参数进行。直径分割参数定义了待检测目标的预期尺寸，一个良好的起始点是通过单个光学切片手动检查若干目标后测得的线粒体平均宽度。概率阈值控制目标被接受所需的最低检测置信度。较低的值可提高灵敏度，检测到更多目标，但其中可能包含部分假阳性目标；相反，较高的值可提高特异性，但可能导致信号较弱的目标丢失。建议的起始范围为25%–30%。最后，分裂敏感度决定相互接触或重叠的目标被分离为独立个体的强度。较低的分裂敏感度会将聚集的线粒体保留为单个融合目标，而较高的分裂敏感度则可能导致细长或分支状线粒体被过度分割成碎片。在典型的线粒体形态学研究中，15%–30%之间的数值较为合理。若仍难以实现准确分割，可使用Mitochondria Analyzer进行分割。⁵⁹ 在 FIJI 中⁶⁰最近还描述了一种使用 Huygens Professional 软件和自定义 Python 脚本对细胞和组织中线粒体形态进行半自动化定量分析的流程。⁶¹.

一个局限性在于Airyscan2共聚焦显微镜的分辨率极限，其在XY方向约为150 nm，在Z轴方向约为350 nm。这限制了对线粒体嵴的高分辨率成像，因为单个嵴之间的距离通常为~40–120 nm^62,63,64。相比之下，受激发射损耗显微技术（STED）的横向分辨率可达~20–50 nm，能够清晰区分单个线粒体嵴^62,63,64。近年来已开发出多种STED染料，可用于活细胞和固定细胞中线粒体内膜的有效染色与成像^63,64,65。鉴于嵴形态的分析可能揭示线粒体生物能量健康的状况¹⁰，因此这类数据具有重要价值。然而，线粒体形态在哺乳动物组织与细胞培养之间存在显著差异（下文将深入讨论），目前尚无可用于组织样本中线粒体内膜染色以进行STED成像和嵴结构分析的方法学。

在完整组织中定量线粒体形态相较于细胞培养系统具有独特的挑战。在培养细胞中，线粒体通常分布于细胞质内，形成彼此分离良好、重叠极少的网络结构。然而，在组织切片或整体封片样本中，细胞排列密集，且细胞边界不清晰。若需进行单细胞水平的分析，则应引入额外的荧光标记，用于标记质膜或特定细胞类型的标志物，并在图像分析流程中增加相应的分割步骤，以在定量线粒体形态前明确定义各个细胞的边界。第二个重要差异在于，培养细胞中的线粒体常形成连续且相互连接的网状结构，易于观察和解释；而在组织中，这种模式极为罕见。例如，肝组织切片中的线粒体呈现为点状、杆状及束状结构，遍布整个细胞质⁶⁶。相比之下，培养中的肝细胞则表现出明显的管状形态及清晰的网络结构⁶⁶。同样，在比较平滑组织中的线粒体与培养的平滑肌细胞中的线粒体时，其形态和网络模式也存在显著差异⁶⁷。由于三维结构以及不同细胞类型间线粒体分布的特异性差异，这些组织中的线粒体往往呈现为离散、密集排列的点状结构或短片段，而非延伸的网络结构。因此，在比较组织与细胞培养之间的形态学特征时，需谨慎解读数据，因为二者之间的差异可能部分源于成像环境的不同，而非真正的生物学变异。

本方案的一个亮点是能够利用光学显微镜对组织中的线粒体结构进行定量测量。尽管已有其他方法可用于从超分辨率光学显微镜图像中量化线粒体形态，但其中许多方法仅适用于培养细胞。此外，与其他分析方法相比，本文所介绍的分析流程完全自动化，可同时量化线粒体的尺寸和亚型比例，且操作者无需具备丰富的编程经验即可成功实施。扫描/透射电子显微镜（SEM/TEM）和冷冻电子断层成像（cryo-ET）此前已被用于在二维和三维条件下对组织中的线粒体结构进行成像^10,68,69。然而，对于前者，样品在固定、脱水和包埋后，其天然结构的保存可能存在一定问题^70,71。此外，使用FIJI⁶⁰手动测量线粒体参数有时是TEM图像分析的首选方法⁷²，但该方法工作量大，且可能引入样本偏差。不过，近年来已有研究报道了基于深度学习的自动化方法，用于从TEM图像中定量分析线粒体形态^73,74。本方法的一个优势在于，一旦分析流程建立，即可批量处理图像，几乎无需人工干预。对于后者，高压冷冻技术可在接近天然状态下保存组织结构⁷⁵。然而，cryo-ET的样品冷冻、切片、研磨、数据采集和数据处理均需要 extensive training 和高度先进的设备。相比之下，超分辨率共聚焦显微镜相对更易获取，且成功实施所需的培训和资源较少。

通过在老年小鼠体内植入渗透压泵，可安全地评估不同药理学化合物对衰老相关生理功能衰退的影响。此外，本文所述方法可广泛适用于多种不同器官。已有充分研究表明，代谢功能的衰老相关衰退会促进疾病发生，其根源之一是线粒体功能障碍，这也是公认的衰老特征之一⁷⁶。此外，线粒体结构决定其生物能量产能能力和代谢状态，这一点已得到广泛认可^77,78。因此，利用本文所述方法定量评估化合物在小鼠衰老过程中对线粒体结构的影响，有助于发现能够延长人类健康寿命的潜在治疗手段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Airyscan2 点扫描共聚焦显微镜	ZEISS	配备 Airyscan2 的 LSM 980	蔡司点扫描共聚焦显微镜 LSM 980，基于蔡司 Axio Observer Z1 构建，配备两个多碱光电倍增管、一个 32 通道 GaAsP 光谱探测器、环境控制舱和 Plan Apo 63 物镜×配备1.4倍油镜DIC III物镜。本研究所用显微镜还配有两台外部近红外探测器，以及以下激光线：405、458、488、514、561、594、639和730 nm。
铝箔	Essendant	BWK7112
分析天平	Mettler Toledo	MR204
防滚玻璃板	凝胶公司	LGI70
Arivis Pro 软件	ZEISS	版本 4.1.2
超声波清洗机	Branson Ultrasonics	71020-MT
牛血清白蛋白	研究产品国际公司	A30075
15 mL 离心管	CELLTREAT	229411
带电载玻片	Globe Scientific	1358W
剪切移除器	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD50
Contrad 70	Decon Labs	1003
棉签	Puritan Medical	25-8061WC
冷冻切片机	Leica Biosystems	CM3050 S
冷冻切片机刀片	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	准备至 5 mg/mL 的 ddH₂O 溶液2O，分装，于-20℃保存 °避光保存
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650
EasyDip 载玻片染色系统	电子显微镜服务	71388-01
电泳凝胶	Bio-Serv	EGS-1
包埋模具，22 毫米 ´ 22 mm ´ 20 mm	Polysciences	18646A-1
乙醇，200 proof	Decon Labs	V1001
带孔无菌手术巾	Dukal	20001
精细镊子	Fine Science Tools	11445-12
玻璃珠灭菌器	VWR	75999-324
山羊抗兔 Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
加热垫	绒毛膜绒毛取样术	215313
止血钳	世界精密仪器公司	501705
浸油 Immersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
诱导室	世界精密仪器公司	EZ178
胰岛素注射器，0.3 mL	BD	328431
虹膜手术剪	Sklar外科手术器械	47-1135
异氟烷	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Luer-Lok 1 mL 注射器	BD	309628
Luer-Lok 3 mL 注射器	BD	309657
Luer-Lok 50 mL 注射器	BD	309653
美洛昔维特（美洛昔康）	Patterson Veterinary	07-894-8524
1.5 mL 微型离心管	CELLTREAT	229443
显微镜载玻片盒	Heathrow Scientific	15994E
显微镜载玻片盖玻片，#1.5，22 毫米 ´ 50 mm	电子显微镜服务	72204-04
非CO2 培养箱	Benchmark Scientific	H2200-H
非穿孔无菌手术单	Dukal	20-002
OCT包埋剂	Sakura Finetek USA Inc	4583
眼用软膏	Patterson Veterinary	07-888-2572
渗透压微型泵	Alzet	2004
Parafilm	贝米斯	PM999
4% w/v 多聚甲醛	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS，1´	赛默飞世尔科技	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
PES 注射器滤器，0.22 µm	CELLTREAT	229747
聚维酮碘 10% USP 棉签	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass 抗荧光淬灭剂	Invitrogen	P36980
兔抗 Tom20 抗体	Novus Biologicals	NBP2-67501
剃刀刀片，0.22 毫米	VWR	55411-050
旋转器/旋转架	Labnet	H5500
RStudio	统计计算 R 项目	版本 4.3.2
量程	Fisher Scientific	S72422
SomnoSuite 低流量麻醉系统	Kent Scientific	SS-01
蒸汽灭菌指示条	Crosstex	SIS-250
无菌玻璃小瓶，5 mL	赛默飞世尔科技	ST5
无菌针头，0.5"，23 G	BD	305145
无菌针头，0.5"，27 G	BD	305109
灭菌袋	Cardinal Health	92510
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378	配制30% w/v的溶液于1´ PBS
手术剪	3M	9680
外科手套	Cardinal Health	2D73DP75
组织镊	Sklar外科手术器械	47-1447
上皿天平	Cole-Parmer	EW-55000-14
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Vetbond 组织粘合剂	3M	1469SB
称量船，85 mL	Heathrow Scientific	1420B
伤口缝合夹施加器	Alzet	0009974
7 mm 伤口夹	Alzet	0009971
Zen 软件	ZEISS	Zen Blue 版本 3.7.97.09000