本研究描述了一种 体外 用于评估三七白及散对乙醇诱导的胃上皮细胞损伤的保护作用及其在PI3K/AKT相关信号通路中作用的模型。
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本研究描述了一种 体外 用于评估三七白及散对乙醇诱导的胃上皮细胞损伤的保护作用及其在PI3K/AKT相关信号通路中作用的模型。
本研究旨在阐明三七白及散（SQBJ）对抗乙醇诱导的胃上皮细胞损伤的保护机制，并探讨其在胃溃疡（GU）中的潜在应用价值。采用网络药理学方法筛选SQBJ的活性成分（传统中药系统药理学数据库与分析平台[TCMSP]，口服生物利用度[OB]≥20%，类药性[DL]≥0.1），确定其作用靶点（通用蛋白资源数据库[UniProt]），收集与胃溃疡相关的靶点（GeneCards/OMIM/DrugBank），并通过基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析及分子对接分析共同靶点。对乙醇损伤的人胃上皮细胞系-1（GES-1）细胞给予SQBJ或PI3K抑制剂LY294002处理，采用CCK-8法确定SQBJ的最佳作用浓度。网络药理学分析鉴定出126个共同靶点，主要富集于PI3K/AKT/MAPK相关信号通路，并提示SQBJ主要成分可能与PI3K/AKT相关蛋白存在潜在相互作用。在乙醇刺激的细胞中，SQBJ通过减少炎症介质释放和氧化应激发挥保护作用，表现为细胞内活性氧和丙二醛水平降低。SQBJ恢复了线粒体膜电位和ATP含量，并减轻了与凋亡相关的B细胞淋巴瘤-2、活化型caspase-3及Bcl-2相关X蛋白表达水平的变化。此外，SQBJ还调节了PI3K/AKT和MAPK相关信号分子的表达。上述保护作用在联合使用LY294002后显著减弱，提示PI3K/AKT相关信号通路参与了SQBJ介导的细胞保护作用。本研究为SQBJ在胃溃疡中的潜在应用提供了体外机制依据，但仍需在乙醇诱导的胃溃疡动物模型中进一步验证。
胃溃疡（GU）是一种在全球范围内高度流行的胃肠道疾病，其特征为胃黏膜的局部炎症、糜烂和溃疡形成。根据2021年全球疾病负担（GBD 2021）分析的估算结果，消化性溃疡病（PUD）仍在全球范围内对数百万患者造成显著的临床和经济负担。尽管随着抗感染治疗方案和酸抑制质子泵抑制剂（PPIs）在临床上的广泛应用，PUD的整体患病率已有所下降，但这一下降趋势已趋于平缓，甚至在某些地区出现了反弹1。值得注意的是，酒精（乙醇）摄入是独立于幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H. pylori）感染和非甾体抗炎药（NSAID）使用之外的关键致病因素。长期过量饮酒会破坏胃黏膜屏障，加速溃疡发展，并可能增加胃部恶性肿瘤的易感性，从而使该问题成为一项严峻的国际公共卫生危机2。在发展中国家，由于饮酒量增加和生活方式改变等多种因素，酒精相关性胃黏膜损伤的发病率正在上升，迫切需要有效且安全的预防与治疗策略。
乙醇诱导的胃黏膜损伤的病理机制具有多因素、多层次的特点。乙醇与胃黏膜直接接触后，迅速破坏黏液-碳酸氢盐屏障，并引发细胞内活性氧（ROS）的失控性激增。这种氧化应激继而诱发脂质过氧化（以丙二醛MDA水平升高为标志），耗竭胃黏膜内源性抗氧化物质，包括超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH），最终导致线粒体功能障碍3。越来越多的证据表明，乙醇诱导的细胞内ROS主要来源于线粒体，且与线粒体内膜电位（Δψm）的崩溃以及三磷酸腺苷（ATP）合成受抑密切相关4。同时，氧化应激进一步激活由核因子-κB（NF-κB）介导的促炎级联反应，促使大量炎症介质释放，主要包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和C反应蛋白（CRP），从而形成“"氧化应激-炎症反应"”的恶性循环5。在此基础上，线粒体介导的内在凋亡级联被激活，表现为Bcl-2/Bax比例失衡以及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Caspase-3）的序贯性酶解活化，最终导致胃黏膜上皮细胞大量死亡和溃疡形成6。因此，同时靶向氧化应激、炎症反应和细胞凋亡这三个核心病理环节，是有效干预酒精性胃黏膜损伤的关键策略。
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路是调控细胞寿命、增殖和程序性死亡的核心调节轴，在维持胃黏膜稳态中发挥关键作用。PI3K/AKT信号激活后，可磷酸化多个下游底物，抑制促凋亡因子Bad的活性，从而阻止破坏性细胞色素c从线粒体释放，维持线粒体膜电位（ΔΨm）稳态，促进细胞存活7。此外，PI3K/AKT级联与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）网络之间存在复杂的拮抗性串扰：PI3K/AKT的上调激活可通过抑制应激激酶（包括p38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和细胞外调节蛋白激酶（ERK））的活化，减轻炎症信号转导及凋亡级联反应8。多项研究表明，在胃黏膜损伤模型中，PI3K/AKT通路活性降低与炎症加重和细胞凋亡增加密切相关，而恢复该通路活性可显著改善黏膜损伤9。然而，目前尚缺乏针对PI3K/AKT在乙醇诱导的胃黏膜损伤中精确调控机制的系统性因果实验验证，尤其是其与MAPK通路之间的协同关系。
就现代药物治疗而言，质子泵抑制剂（PPIs）是临床管理胃溃疡（GU）的首选一线方案，但其长期使用已引发日益增多的安全性担忧。越来越多的研究将长期PPI使用与多种不良结局相关联，包括肾脏疾病、心血管事件、骨质疏松性骨折以及营养素缺乏（铁、镁和维生素B12） 艰难梭菌 感染，甚至胃癌风险升高10此外，大规模药物安全监测数据已证实，在停用质子泵抑制剂后会出现胃酸反跳性高分泌现象。11这些安全风险促使临床和基础研究领域积极探寻具有多靶点保护机制、副作用小且适合长期使用的替代疗法。特别是源自中药（TCM）的天然化合物制剂，因其整体治疗理念而受到广泛关注 "多组分、多靶点、多通路" 动作12.
三七白及散（SQBJ）是一种经典的中药复方制剂，由三七和白及组成 三七 和 白及 按1:1的质量比。 三七 以其活血化瘀、止血及消肿止痛的功效而闻名。其主要生物活性成分，包括三七皂苷R1和人参皂苷（Rg1、Rb1），具有显著的抗炎、抗氧化及黏膜修复作用。 白及 以其收敛作用为特征，可止血、消肿，并促进受损组织的再生。同时， 白及 多糖（BSP）作为其主要活性提取物，已被证实具有抑制JNK/p38 MAPK级联反应的作用，从而降低白细胞介素-1β（IL-1β）、TNF-α和IL-6的表达，并增强胃黏膜的抗氧化防御能力13大量文献证据已证实，联合使用 三七 皂苷（PNS）与BSP在酒精性胃溃疡模型中具有协同作用14，且与SQBJ相关的制剂在反流性食管炎和消化性溃疡的临床前研究中已显示出显著的黏膜保护作用15然而，目前尚无针对SQBJ胃黏膜保护作用背后信号通路机制的系统性体外实验验证，尤其是PI3K/AKT通路的核心作用及其与MAPK通路的调控关系。同时，SQBJ中关键化学成分与其功能受体之间的因果关联也尚未完全阐明。
为弥补上述不足，本研究采用整合网络药理学与in vitro实验验证的研究策略，以乙醇刺激的GES-1细胞系为实验平台，系统探究三七白及（SQBJ）对胃黏膜上皮细胞保护作用的潜在分子机制，重点关注氧化应激、炎症反应、细胞凋亡过程、PI3K/AKT相关信号通路及MAPK相关变化。首先，我们使用PI3K抑制剂LY294002初步评估PI3K/AKT信号通路的参与情况，发现抑制该通路可削弱SQBJ的保护作用，提示PI3K/AKT相关信号通路在SQBJ介导的细胞保护中发挥重要作用。其次，我们进一步探讨了PI3K/AKT相关变化与MAPK通路调控之间的关联，初步证实MAPK信号通路的变化可能与SQBJ对PI3K/AKT轴功能反应的调节有关。综上所述，本研究建立了在in vitro条件下评估SQBJ缓解乙醇诱导胃上皮损伤作用的分子框架，为深入探索中药复方制剂在酒精性胃黏膜损伤中的应用提供了初步依据。然而，仍需通过动物实验进一步验证这些细胞保护效应是否可在酒精诱导的胃溃疡实验模型中转化为in vivo的治疗效果（补充图S1）。
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本研究未涉及人类参与者、人体组织样本、临床标本或动物实验。网络药理学分析使用了公开可用且匿名的数据库资源，体外实验使用了商业化的GES-1细胞。因此，无需正式的伦理审批和知情同意。主要试剂、抗体、检测试剂盒、仪器、生产商、目录编号以及适用的研究资源标识符（RRIDs）的详细信息汇总于材料表中。
SQBJ水提物的制备与质量控制
中药材
三七（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）的根及根茎与白及（Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f.）的块茎购自一家商业化的中药供应商，并由资深中药师依据《中华人民共和国药典》（2025年版）进行鉴定。凭证标本（编号：SQBJ-20240301、PN-20240301、BS-20240301）保存于本机构的标本馆中。将上述两种药材粉碎后按质量比1:1混合，制得三七白及粉（SQBJ粉）。
SQBJ 水提物的制备
将 SQBJ 粉末以固液比 1:10（g/mL）加入去离子水，进行两次回流提取，每次 1 小时。随后，合并收集的提取液，并通过四层医用纱布过滤，以去除残渣。所得滤液在 60 °C 下减压浓缩，直至相对密度达到 1.05–1.10，再经真空冷冻干燥，得到 SQBJ 水提物粉末，最终提取率为 18.2% ± 0.6%。提取物粉末密封后于 −20 °C 保存，使用前用无血清 DMEM 培养基溶解，并经 0.22 µm 微孔滤膜过滤除菌，用于细胞实验。
SQBJ水提取物的质量控制
为评估SQBJ水提取物的批间一致性和标准化程度，我们进行了定量测定，并结合高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析。 材料表 列出了有关HPLC系统的全面技术参数。根据各组成药材的化学成分特征，我们选取了四种代表性成分作为指标：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和 Militarine。然而，这种基于HPLC的质量控制策略主要反映了少数代表性成分，未能提供SQBJ中所有活性化合物的全面化学图谱。
采用反相C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）实现色谱分离。操作条件为柱温30 °C，流速1.0 mL/min，进样体积10 µL，检测波长203 nm。流动相由乙腈（A）和0.1%磷酸水溶液（B）组成，采用以下梯度洗脱程序：0–15 min，19% A；15–35 min，19%–35% A；35–55 min，35%–55% A；55–60 min，55%–19% A。详细的仪器与色谱柱信息见于 材料表.
对照品溶液的制备
为进行定量分析，我们采购了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和迷迭香酸的市售对照品，纯度均≥98%。准确称取各对照品，溶于甲醇，配制成每种成分终浓度均为50 µg/mL的混合对照品储备溶液。
样品制备：
精确称取SQBJ水提物干粉（50 mg），加入25 mL分析纯甲醇溶解。将混合液置于超声波清洗器中，在受控仪器参数下（功率：250 W；频率：40 kHz）超声处理30 min。待溶液恢复至室温后，经0.22 µm有机系滤膜过滤，即得最终分析用测试溶液。
含量测定结果：
三批连续批次的三七补 jelly 水提取物中核心特征成分的平均含量分别为：三七皂苷 R1 3.12 ± 0.11 mg/g，人参皂苷 Rg1 8.45 ± 0.23 mg/g，人参皂苷 Rb1 5.26 ± 0.18 mg/g，以及 Militarine 2.78 ± 0.09 mg/g，各成分含量的批间相对标准偏差（RSD）< 5%，表明该提取物具有良好的批间一致性。
伦理与合规声明
本研究未涉及动物实验，也未纳入人类临床样本、组织活检或活体受试者。网络药理学分析使用了公开可用的数据库，包括 TCMSP、UniProt、GeneCards、OMIM、DrugBank、STRING、Metascape、PubChem 和 RCSB PDB。从这些数据库获取的所有数据均为公开可访问且匿名化处理；因此，生物信息学分析完全无需正式的知情同意或额外的伦理审查。
目前 体外 实验采用 commercially available 人胃黏膜上皮细胞系 GES-1 进行。未使用原代人源细胞或患者来源的生物材料。该细胞系来源于经认证的细胞库，并依照机构生物安全及细胞培养指南进行操作。由于本研究仅涉及已建立的细胞系及公开可用的数据库，因此免于提交正式的机构伦理委员会审批。所有实验操作均遵循相关机构的实验室安全与科研合规要求。
网络药理学研究
活性成分靶点的鉴定与筛选
通过公开数据库获取了三七（Panax notoginseng）和白及（Bletilla striata）这两种三七白及复方（SQBJ）组成药材的活性成分。本研究中使用的所有数据库来源信息均为公开可获取，且不包含可识别的个人信息。以植物学名称作为检索词，我们从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中筛选出候选植物化学成分。为筛选符合条件的生物活性分子，采用口服生物利用度（OB）≥ 20% 和类药性（DL）≥ 0.1 作为筛选阈值。随后，我们确定了与这些候选成分相关的潜在下游基因靶点，并剔除无匹配有效基因靶点的成分。所有靶基因均通过通用蛋白质资源（UniProt）进行注释和标准化，并将参考数据库的检索范围严格限定于智人（Homo sapiens），从而获得最终的功能性SQBJ活性成分靶基因列表。
获取与病理相关的靶点
为了汇总与该疾病相关的基因，我们使用“"胃溃疡"”作为检索词，查询了三个公共数据库：GeneCards、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）和 DrugBank。随后整合跨平台的数据集，并剔除重复条目，从而建立一份标准化的胃溃疡相关靶基因列表。
成分、靶点与疾病的网络构建
我们确定了失笑槟甲（SQBJ）活性成分与胃溃疡之间的共同靶基因。随后，利用网络可视化软件构建了多层相互作用网络。为评估节点的重要性，采用综合拓扑评价算法计算每个节点的拓扑参数，包括度值和介数中心性。根据这些计算结果，我们鉴定了SQBJ在治疗胃溃疡中的活性成分及其关键功能靶点。
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建
将SQBJ与胃溃疡共有的鉴定出的共识靶点与STRING数据库进行交叉比对。查询时选择多蛋白分析模板，并将分析背景限定为Homo sapiens。蛋白质相互作用的筛选设定最低相互作用置信度为中等置信度（> 0.4）。
将得到的功能连接记录导出为TSV文件，随后导入专用的网络可视化软件进行PPI分析。根据计算得到的连接拓扑结构，通过排序每个节点的特定度值，评估了网络中的核心功能节点。
下游功能注释与通路映射
为了阐明共有交集节点的生物学功能，我们利用一个可在线访问的生物信息学注释工具，进行了基因本体（Gene Ontology, GO）功能富集分析以及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。功能分类将基因划分为三个经典类别：生物过程（biological process, BP）、细胞组分（cellular component, CC）和分子功能（molecular function, MF）。通过在线生物信息学绘图平台生成富集结果的气泡图和柱状图，以系统描绘SQBJ对胃溃疡治疗作用相关的主要生物过程和信号通路。
计算分子对接模拟
从公共化合物数据库下载了SQBJ核心活性成分的空间结构文件，并使用文件处理软件将其保存为MOL2格式。我们还通过查询蛋白质数据库（Protein Data Bank）获得了核心靶标蛋白的三维晶体结构。这些大分子结构经过预处理，去除原有的配体和水分子后，将得到的洁净模型保存为PDB格式。为了模拟受体-配体结合的热力学特性，采用标准的计算分子对接软件对核心活性成分与靶标蛋白进行对接验证。对接结果通过分子可视化软件进行优化与渲染。
细胞培养
GES-1 人源胃上皮细胞采用含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI-1640 培养基，在 37 °C、5% CO₂ 的湿润环境中培养。该细胞系为已建立的细胞系，初始细胞来自经过认证的细胞库。当细胞融合度达到 80–90% 时，用 PBS 洗涤两次，随后加入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下消化 2 分钟以使细胞脱落。为终止酶解反应，加入等体积的完全培养基。将所得细胞悬液在 1,000 × g 下离心 5 分钟，弃上清后将细胞沉淀重悬于新鲜完全培养基中，并按适当密度重新接种。细胞继续置于相同培养条件下孵育。在传代过程中，使用倒置相差显微镜观察细胞活力、形态及生长状态，并常规收集处于对数生长期的细胞用于后续分析。
乙醇诱导的GES-1细胞损伤模型的建立与处理
对数生长期的GES-1细胞以5 × 105 细胞/孔，置于6孔板中，或1 × 104 在96孔板中以每孔适量细胞接种，过夜培养使其贴壁。随后，将细胞暴露于不含添加剂的RPMI-1640培养基中含500 mmol/L乙醇的环境，持续4小时，以建立乙醇诱导的损伤模型。该条件的选择基于前期的浓度-效应和时间-效应预实验结果。在预实验中，250 mmol/L乙醇处理4小时仅引起轻度损伤，细胞活力维持在约78.6 ± 5.4%；而750 mmol/L乙醇处理则使细胞活力下降至32.8 ± 4.7%，提示细胞毒性过强。500 mmol/L乙醇处理4小时可使细胞活力降至54.7 ± 4.9%，造成可重复的中至重度损伤，同时保留足够数量的活细胞，适用于后续干预及机制研究。因此，选用500 mmol/L乙醇处理4小时作为模型建立条件。该条件用于模拟急性乙醇诱导的上皮细胞损伤。 体外 且不能完全再现胃黏膜的生理暴露模式 体内
在药理学干预实验中，选择三种浓度的SQBJ水提物（5、10和50 µg/mL），在乙醇攻击后立即给予处理。在PI3K抑制组中，细胞先用20 µmol/L LY294002预孵育30分钟，随后与乙醇及最优浓度的SQBJ共同处理。阳性对照组在乙醇暴露后立即给予20 µmol/L奥美拉唑。奥美拉唑作为参考性胃保护剂使用，而非剂量等效的对照药物。该浓度的选择基于初步的细胞毒性评估以及体外实验中常用的干预浓度范围，旨在为细胞保护提供药理学参考。对照组细胞在不含乙醇及其他添加物的完全培养基中维持培养。所有孵育均在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中进行。每个实验组至少包含三个重复孔，整个实验方案独立重复三次。
通过CCK-8法确定SQBJ的最佳浓度
将处于对数生长期的HGE/GES-1细胞以每孔1 × 104个细胞的密度接种于96孔板中，在标准条件下（37 °C、5% CO₂）使用完全RPMI-1640培养基过夜培养，以确保细胞贴壁。随后将细胞随机分为四组：溶剂对照组（仅完全培养基）、低剂量SQBJ干预组（5 µg/mL）、中剂量SQBJ干预组（10 µg/mL）和高剂量SQBJ干预组（50 µg/mL）；这三个浓度用于治疗性筛选，通过将SQBJ溶解于PBS中配制而成。所有处理组均设置至少三个复孔，且整个实验重复进行三次独立批次。在指定的处理时间结束后，每孔加入10 µL CCK-8试剂，随后在37 °C下孵育2小时。使用酶标仪测定450 nm处的光密度（OD）。细胞活力百分比按（处理组吸光度 / 对照组吸光度）× 100% 计算，从而确定后续实验中最有效的SQBJ浓度。
qPCR
对数生长期的 GES-1 细胞在 6 孔板中培养（每孔 5 × 105 个细胞），在含 5% CO₂ 的湿润培养箱中 37 °C 培养过夜，以促进细胞贴壁。随后，细胞暴露于预先确定的最佳浓度的 SQBJ 中，并在处理前（0 h）以及处理后 6、12、24 和 48 h 收集样本，以测定信号分子的动态响应。根据时间进程实验结果，选择 24 h 时间点用于后续机制实验，因为该时间点显示出最强的信号响应，同时保持了稳定的细胞活力。每个时间点设三个重复孔，整个实验独立重复 3 次。
我们使用一种专用提取试剂分离总RNA，并利用分光光度计测定提取物的浓度和质量。所有样本的A₂₆₀/A₂₈₀吸光度比值均介于1.8至2.0之间。采用含gDNA清除剂的反转录试剂盒，将1 µg总RNA反转录为cDNA。通过定量PCR系统，使用针对PI3K、AKT、p38、JNK、ERK以及内参基因GAPDH的引物进行实时PCR分析。PCR系统、试剂及引物合成服务的详细信息见于 材料表引物设计针对相应人类基因的特定区域。qPCR程序：95 °C下热启动活化30秒，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性5秒，60 °C退火/延伸30秒。目标基因mRNA表达量的计算采用相对定量PCR方法，基于2-ΔΔCt 方法
ELISA
上清液经收集后，在4 °C条件下以1,200 × g 离心10分钟，以去除细胞碎片。使用商用ELISA试剂盒，按照生产商提供的具体说明，检测炎症介质（CRP、IL-6、TNF-α）和氧化应激指标（SOD、MDA、GSH）的水平。这些目标物的浓度分布通过商业检测试剂盒，依照供应商的说明书进行验证。每个实验组包含三个重复孔，并在三批独立的细胞培养中重复实验，以确保实验数据的可重复性。简言之，将100 µL的标准品或澄清后的上清液加入预先包被的反应板孔中，于37 °C孵育90分钟。经过三次连续的洗涤步骤后，每孔加入100 µL特异性检测抗体，于37 °C孵育60分钟，随后再进行三次洗涤。接着加入100 µL底物溶液，避光反应15分钟后，加入50 µL终止液以阻断酶促反应。使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。根据相应的标准曲线插值计算各物质浓度。为减少因细胞数量差异或处理引起的细胞活力变化所导致的偏差，MDA、SOD、GSH、CRP、TNF-α和IL-6的检测结果均以BCA法测定的各分析样品的蛋白含量进行标准化校正，并以相对于对照组的相对值表示。
使用 DCFH-DA 荧光探针检测 GES-1 细胞内的活性氧
为了定量细胞内活性氧（ROS）水平，我们采用了可穿透细胞膜的荧光探针 DCFH-DA。收集细胞后，将其重悬于不含添加剂的 RPMI-1640 培养基中，加入 10 µmol/L DCFH-DA，在标准培养条件（37 °C，5% CO₂）下避光孵育 20 分钟。随后用无血清培养基洗涤三次，以去除未结合的探针，然后通过流式细胞术检测荧光强度，激发波长为 488 nm，发射波长为 525 nm。相对 ROS 水平以各处理组的平均荧光强度表示，并根据平行孔中通过 CCK-8 法测定的活细胞数量进行归一化，结果以相应对照组为基准进行相对表达。
线粒体膜电位（ΔΨm）的测定
我们使用商业化的JC-1检测试剂盒评估线粒体膜电位（ΔΨm）的变化。简言之，收集细胞后将其重悬于新鲜配制的JC-1工作液中——该工作液由试剂盒提供的JC-1染料与染色缓冲液等体积混合而成，细胞终浓度为1 × 106 个细胞/mL。在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中避光孵育20分钟后，以离心方式收集样本（800 × g，5分钟），并用1 mL冰浴的JC-1染色缓冲液洗涤一次。随后通过流式细胞术检测荧光信号。
JC-1 聚集体（表明线粒体膜电位 ΔΨm 完整）通过 FL2 通道在 488 nm 激发波长和 590 nm 发射波长下进行监测；而 JC-1 单体（表明 ΔΨm 耗散）则通过 FL1 通道在 488 nm 激发和 525 nm 发射条件下进行追踪。ΔΨm 以红/绿荧光信号比值表示；比值下降提示线粒体去极化。
细胞内ATP水平的测定
通过使用ATP检测试剂盒定量细胞内ATP含量来评估线粒体功能。采用荧光素酶-荧光素生物发光反应检测ATP含量，其与线粒体活性呈正比。简言之，收集细胞后将其重悬于预冷的ATP裂解缓冲液中，并在冰上裂解5分钟。随后在4 °C下以12,000 × g 离心5分钟，取20 µL上清液转移至96孔不透明白色微孔板中。接着，向每个孔中加入100 µL新配制的ATP检测工作液（按照说明书将荧光素酶试剂与荧光素底物混合而成）。使用发光微孔板检测仪立即测定所产生的发光信号。为获得相对ATP水平，将原始发光值根据各上清液的总蛋白浓度进行归一化处理，该蛋白浓度由商用BCA蛋白定量试剂盒测定，从而校正细胞数量差异。
通过Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡
根据制造商说明，使用商业化的Annexin V-FITC/PI细胞死亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。洗涤后，将细胞沉淀重悬于Annexin V-FITC结合缓冲液中，调整细胞密度至1 × 106 个细胞/mL（每样本195 µL）。随后，每个独立的离心管中加入5 µL Annexin V-FITC和10 µL PI染色液。轻轻涡旋混匀，室温避光孵育15分钟。孵育结束后，通过流式细胞仪检测凋亡细胞。利用相应的荧光通道区分活细胞（Annexin V⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁻）以及晚期凋亡/坏死细胞（Annexin V⁺/PI⁺）。根据上述设门策略，定量分析各组中凋亡细胞的百分比。
蛋白质印迹（Western blot）
膜在4 °C下与针对Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、AKT、p38 MAPK、JNK、ERK1/2和GAPDH的一抗孵育过夜。抗体的选择依据其在人源样本及蛋白质印迹应用中的验证信息。所有在抗体数据库（Antibody Registry）或RRID门户中有记录的抗体均标注了RRID编号。目标蛋白水平以GAPDH为内参进行归一化。经过标准洗涤步骤后，印迹膜与HRP标记的二抗在室温下孵育1小时。使用ECL化学发光底物溶液检测蛋白条带。采用数字图像分析软件对蛋白质印迹条带的灰度值进行定量分析。
免疫荧光染色
在指定处理前，将 GES-1 单层细胞接种于 24 孔板中的玻璃盖玻片上。处理结束后，于室温下使用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟，随后用含 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液进行膜通透处理 10 分钟，并在 37 °C 下用 5% 牛血清白蛋白封闭 30 分钟。将盖玻片转移至含有针对 AKT、p38、JNK 和 ERK 的一抗溶液中，于 4 °C 过夜孵育。经三次 PBS 洗涤后，样本在室温下避光孵育荧光标记的抗兔二抗 1 小时。使用 DAPI 复染 5 分钟以显示细胞核。随后将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封片，并采用共聚焦激光扫描显微镜观察目标蛋白的亚细胞定位。所有免疫荧光图像均使用 20× 物镜在相同的成像参数下采集。所有代表性免疫荧光图像均添加对应 50 µm 的比例尺。
统计学分析
定量值以均值 ± 标准差（SD）表示，数据来自至少三次独立的实验，每次实验中每个样本均进行三重复验证。统计学分析通过专业的数值分析工具进行。为了确定多个队列之间的显著差异，我们采用单因素方差分析（ANOVA），并结合Tukey事后检验进行组间比较。以双尾P值 < 0.05作为具有统计学意义的阈值。
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基于生物信息学解析四君子汤治疗胃溃疡的作用机制
为探究四君子汤（SQBJ）可能通过哪些机制对胃溃疡（GU）发挥药理作用，我们首先预测了其主要生物活性成分所对应的作用靶点。利用 R 语言编程，对这些生物活性成分对应的靶点进行提取并去除重复条目，最终获得 411 个候选靶点。随后，通过查询 GeneCards 和 OMIM 数据库获取与胃溃疡相关的疾病靶点，共筛选出 1,643 个独特的疾病特异性靶点（补充文件 1）。将疾病靶点与 SQBJ 成分的靶点取交集，得到 126 个共同的关键靶点（图 1A）。基于这些共有靶点，进一步进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络拓扑分析（图 1B）及其可视化展示（图 1C），识别出一个由高度互连蛋白组成的中心模块，提示该模块在 SQBJ-GU 靶点网络中具有核心调控作用。通过 GO 功能富集分析（图 1D）将这些靶点归类至核心...
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本研究的主要目的是评估SQBJ（一种由多种中药组成的经典复方制剂）是否能够 三七 和 白及在GES-1细胞模型中，SQBJ对乙醇诱导的胃黏膜上皮损伤具有细胞保护作用，该作用涉及PI3K/AKT相关信号通路，并与炎症介质、氧化应激指标、线粒体功能障碍及凋亡事件的减少相关。本研究的主要发现如下：网络药理学分析鉴定出PI3K/AKT–MAPK轴可能是SQBJ治疗胃溃疡（GU）的潜在作用机制核心；在乙醇刺激的GES-1细胞中，10 µg/mL的SQBJ提取物以剂量依赖性和时间依赖性方式恢复细胞活力，抑制炎症和氧化应激生物标志物，维持线粒体膜电位（ΔΨm）和ATP生成，并通过调控Bcl-2/Bax/caspase-3通路抑制细胞凋亡；上述效应可被PI3K抑制剂LY294002显著削弱，表明PI3K/AKT相关信号通路在SQBJ介导的乙醇损伤GES-1细胞保护作用中具有贡献性作用。
网络药理学结果揭示了SQBJ与GU之间存在126个交集靶点，其中PI3K/AKT和MAPK信号通路显著富集。这种多靶点预测框架与中药网络药理学的新兴范式一致
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作者声明无利益冲突。
本研究由江苏省中医药科学技术发展计划项目—一般项目（2023）资助，项目编号：MS2023118。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1062L |
| ATP 检测 | 增强型 ATP 检测试剂盒 | Beyotime | S0027 |
| 缓冲液 | PBS | Solarbio | — |
| 细胞消化试剂 | 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200072 |
| 细胞系 | GES-1 人胃黏膜上皮细胞 | 中国科学院细胞库 | SCSP-533 |
| 细胞活力检测 | CCK-8 试剂 | — | — |
| 共聚焦显微镜 | LSM 880 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 880 |
| 培养基 | RPMI-1640 | Gibco | — |
| ELISA 试剂盒 | 人 CRP ELISA 试剂盒 | R&D Systems | DCPR00 |
| ELISA 试剂盒 | 人 IL-6 ELISA 试剂盒 | R&D Systems | DTAM00D |
| ELISA 试剂盒 | 人 TNF-α ELISA 试剂盒 | R&D Systems | — |
| 流式细胞仪 | FACSCalibur / FACSCanto II | BD Biosciences | — |
| 中药材 | 白及（Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f.）块茎 | 安国中药材市场 | 凭证标本编号 BS-20240301 |
| 中药材 | 三七（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）根及根茎 | 安国中药材市场 | 凭证标本编号 PN-20240301 |
| 中药材 | 三七白及散粉末 | 实验室自制 | 凭证标本编号 SQBJ-20240301 |
| HPLC 色谱柱 | ZORBAX SB-C18 色谱柱 | Agilent Technologies | 4.6 mm × 250 mm, 5 μm |
| HPLC 系统 | 1260 Infinity II HPLC 系统 | Agilent Technologies | 1260 Infinity II |
| 免疫荧光二抗 | Alexa Fluor 594–标记抗兔 IgG 抗体 | Invitrogen | A11012 |
| 倒置显微镜 | CKX41 倒置相差显微镜 | Olympus | CKX41 |
| 化学发光仪 | Infinite 200 PRO 酶标仪 | Tecan | Infinite 200 PRO |
| 膜 | PVDF 膜 | Millipore | IPVH00010 |
| 酶标仪 | iMark 酶标仪 | Bio-Rad | iMark |
| 线粒体膜电位检测试剂盒 | JC-1 检测试剂盒 | Beyotime | C2006 |
| 细胞核染色剂 | DAPI | Beyotime | C1002 |
| 在线平台 | 在线生物信息学绘图平台 | 生物信息学在线分析平台 | 在线平台 |
| 在线平台 | 基于网页的富集分析平台 | Metascape | 在线平台 |
| 氧化应激检测 | GSH 检测试剂盒 | Beyotime | S0052 |
| 氧化应激检测 | MDA 检测试剂盒 | Beyotime | S0131 |
| 氧化应激检测 | SOD 检测试剂盒 | Beyotime | S0109 |
| PI3K 抑制剂 | LY294002 | MCE | S1105 |
| 阳性对照药物 | 奥美拉唑 | MCE | HY-B0053 |
| 一抗 | AKT | Cell Signaling Technology | 4691 |
| 一抗 | Bax | Cell Signaling Technology | 5023 |
| 一抗 | Bcl-2 | Cell Signaling Technology | 15071 |
| 一抗 | Cleaved Caspase-3 Asp175 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| 一抗 | ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| 一抗 | GAPDH | Abcam | ab8245 |
| 一抗 | JNK / SAPK-JNK | Cell Signaling Technology | 9252 |
| 一抗 | p-AKT Ser473 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| 一抗 | p-ERK1/2 Thr202/Tyr204 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| 一抗 | p-JNK Thr183/Tyr185 | Cell Signaling Technology | 4668 |
| 一抗 | p-p38 MAPK Thr180/Tyr182 | Cell Signaling Technology | 4511 |
| 一抗 | p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199 | Cell Signaling Technology | 4228 |
| 一抗 | p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 8690 |
| 一抗 | PI3K p85 | Cell Signaling Technology | 4257 |
| 引物 | AKT 正向引物 | — | — |
| 引物 | AKT 反向引物 | — | — |
| 引物 | ERK 正向引物 | — | — |
| 引物 | ERK 反向引物 | — | — |
| 引物 | GAPDH 正向引物 | — | — |
| 引物 | GAPDH 反向引物 | — | — |
| 引物 | JNK 正向引物 | — | — |
| 引物 | JNK 反向引物 | — | — |
| 引物 | p38 正向引物 | — | — |
| 引物 | p38 反向引物 | — | — |
| 引物 | PI3K 正向引物 | — | — |
| 引物 | PI3K 反向引物 | — | — |
| 蛋白酶抑制剂 | PMSF | Beyotime | ST506 |
| 蛋白检测 | BCA 蛋白检测试剂盒 | Beyotime | P0010 |
| 蛋白裂解缓冲液 | RIPA 裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 公共数据库 | DrugBank | DrugBank Online | 在线数据库 |
| 公共数据库 | GeneCards | 魏茨曼科学研究所 | 在线数据库 |
| 公共数据库 | 在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM） | 约翰斯·霍普金斯大学 | 在线数据库 |
| 公共数据库 | PubChem 化合物数据库 | 美国国家生物技术信息中心 | 在线数据库 |
| 公共数据库 | RCSB 蛋白质数据库 | RCSB PDB | 在线数据库 |
| 公共数据库 | STRING 蛋白质相互作用数据库 | STRING 联盟 | 在线数据库 |
| 公共数据库 | 中药系统药理学数据库与分析平台 | TCMSP | 在线数据库 |
| 公共数据库 | 通用蛋白质资源（UniProt） | UniProt 联盟 | 在线数据库 |
| 实时荧光定量 PCR 系统 | CFX96 实时荧光定量 PCR 系统 | Bio-Rad | CFX96 |
| 逆转录试剂盒 | 含 gDNA 消除剂的 PrimeScript RT 试剂盒 | Takara Bio | RR047A |
| RNA 提取试剂 | TRIzol 试剂 | — | — |
| 活性氧探针 | DCFH-DA | Beyotime | S0033 |
| 二抗 | HRP 标记抗兔 IgG 抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 |
| 软件 | Cytoscape | Cytoscape 联盟 | 3.9.1 |
| 软件 | GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 9.5.1 |
| 软件 | 图像分析软件 | 美国国立卫生研究院 | ImageJ |
| 软件 | ImageJ | NIH | ImageJ |
| 软件 | 分子对接软件 | AutoDock Tools | 版本未指定 |
| 软件 | 分子格式转换软件 | OpenBabel | 版本 2.3.1 |
| 软件 | 分子可视化软件 | PyMOL | 版本 2.3.1 |
| 软件 | 网络可视化软件 | Cytoscape 联盟 | 版本 3.9.1 |
| 软件 | R 统计软件 | 统计计算 R 基金会 | 版本未指定 |
| 软件 | 统计分析软件 | GraphPad Software | 版本 9.5.1 |
| 添加剂 | 胎牛血清 | Gibco | — |
| 添加剂 | 青霉素–链霉素 | Gibco | 15140122 |