用于唾液预处理以提升皮质醇检测效果的手持设备

摘要

本方案描述了一种可提高皮质醇检测效果的快速唾液预处理方法。采用手持式过滤装置去除黏蛋白及其他干扰物质，同时保留目标分析物。经预处理的唾液具有更佳的毛细流动性能，从而实现更一致且可重复的检测结果。

摘要

唾液皮质醇检测为基于血液的分析提供了一种无创替代方案。然而，由于唾液固有的黏稠性以及干扰成分的存在，其实际应用仍受到限制。特别是黏蛋白和唾液蛋白会阻碍毛细驱动流动，并影响后续侧向流动检测（LFAs）的可靠性，因此亟需有效且易于获取的前处理策略。本文介绍了一种用于即时检测皮质醇的手持式唾液前处理装置，称为SaliFilter。该装置采用过滤机制，可选择性去除高分子量的干扰成分，同时允许包括皮质醇在内的小分子通过。通过简单的手动加压操作，可在无需外部设备的情况下实现快速样本处理（约2分钟），适用于分散化检测场景。通过浊度测量、蛋白质定量和SDS-PAGE对装置性能进行了评估，结果证实其能高效去除黏蛋白和唾液蛋白。经处理的样本表现出增强的毛细流动性能，从而实现稳定可靠的侧向流动检测运行。定量分析显示信号重复性得到改善，在临床相关浓度范围内，皮质醇检测的检出限达到1.47 ng mL⁻¹。本方案建立了一种有效的唾液前处理方法，在不破坏待测物完整性的前提下，提高了分析的灵敏度与可靠性。该方法为基于唾液的诊断提供了实用且便携的解决方案，在即时检测和自我监测方面具有广泛应用前景。

引言

皮质醇是由肾上腺皮质分泌的一种糖皮质激素，是评估生理应激的关键生物标志物^1,2。它可在多种生物液体中检测，包括血清、血浆、尿液、组织间液和唾液，其中血液和唾液在临床实践中最为常用³。尽管基于血液的检测可提供可靠的定量信息，但其需要侵入性静脉穿刺操作及专业人员参与，限制了其在频繁或长期监测中的适用性^4,5,6。相比之下，唾液皮质醇检测是一种非侵入性且便捷的替代方法，适用于即时检测和自我监测应用^7,8。值得注意的是，唾液中皮质醇水平与血液浓度具有高度相关性，支持唾液作为可靠的替代样本⁹。然而，唾液固有的黏稠性以及干扰成分的存在显著影响分析性能，因此在分析前需要有效的预处理步骤^10,11,12。

已探索多种预处理策略以应对这些挑战。离心法被广泛用于去除黏蛋白、蛋白质和细胞碎片等大分子成分。然而，该方法需要使用体积庞大的实验设备并涉及多个处理步骤，限制了其在分散式检测环境中的应用^13,14。使用缓冲溶液稀释可降低样本黏度并改善流动性能¹⁵。但该方法同时会降低待测物浓度，从而影响分析灵敏度。因此，现有方法仍不足以满足即时检测的需求，因为在即时检测中，快速、无需设备的样本处理以及目标待测物的有效保留至关重要。

为了克服这些局限性，我们开发了SaliFilter，这是一种用于唾液预处理的手持式装置，专为即时检测皮质醇而设计。该装置采用过滤机制，可选择性去除高分子量的干扰物质，同时允许包括皮质醇在内的小分子通过¹⁶。该装置通过手动操作，无需外部仪器即可实现快速、便捷的样本处理。通过去除干扰成分，该方法改善了侧向流动检测中的毛细管流动，从而提高了分析的可靠性。本实验方案详细描述了该装置的制备方法及其在侧向流动检测前用于快速唾液预处理的应用流程。

方案

本研究使用了商业获取的去标识化人唾液混合样本。未招募人类受试者，无需机构伦理审批。

1. 唾液样本制备

1. 指导受试者在样本采集前至少30分钟内禁食禁饮。
2. 按照试剂供应商的说明制备唾液样本。
   注意：本研究使用市售的混合人源唾液进行方案级别的验证。
3. 使用前轻轻混匀唾液样本，以确保其均匀性。
4. 将唾液样本储存在4 °C条件下，并在供应商推荐的保存期限内使用。

2. RBCM包被膜的制备（图1A）

1. 根据先前报道的方案从全血中分离红细胞膜囊泡（RBCM）¹⁶。
   1. 使用 commercially obtained 的人全血（以 K2EDTA 抗凝）作为 RBCM 来源。
   2. 将全血在 800 × g 离心 5 分钟，去除血浆和白膜层后收集红细胞组分。
   3. 用预冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔手动混匀，将分离得到的红细胞沉淀洗涤三次。
   4. 将洗涤后的红细胞沉淀重悬于预冷的 0.25× PBS 中，孵育 30 分钟以诱导溶血。
   5. 将裂解后的悬液在 20,000 × g 离心 30 分钟，分离游离血红蛋白，并收集 RBCM 沉淀。
   6. 用 0.25× PBS 对收集的 RBCM 沉淀再洗涤三次，将呈淡粉色的 RBCM 沉淀储存于 −80 °C，待后续使用。
2. 准备一个孔径为 30 nm、直径为 13 mm 的聚醚砜（PES）膜。
3. 将 100 µL 浓度为 2%（w/v）的 RBCM 溶液滴加到 PES 膜的一侧，轻轻涂抹或逐滴分散，直至整个膜表面完全润湿。
4. 将膜在 50 °C 孵育 30 分钟，以确保均匀包被和干燥。
5. 将包被后的膜在室温下储存，并在制备后 15 天内使用¹⁷。
   注意：RBCM 包被的 PES 膜的详细表征已在我们之前的研究中描述¹⁶。

3. SaliFilter 装置的制备（图1B）

1. 将RBCM包被的膜放入指定的滤器 holder 中。
2. 通过牢固连接进样端和出样端组件来组装装置。
3. 将一个1 mL注射器连接到装置的进样口。
   注意：确保所有组件均紧密密封，以防止操作过程中发生泄漏。

4. 唾液预处理

1. 将500 µL唾液加入连接至SaliFilter装置的注射器中。
2. 施加轻柔的手动压力，使唾液样本通过膜（约2分钟）。
3. 从出口收集预处理后的唾液。
4. 立即使用预处理样本，或于4 °C保存直至进一步分析。

5. 唾液蛋白质的SDS-PAGE分析

1. 将15 µL样品与5 µL Laemmli上样缓冲液混合。
2. 将混合物加入8% SDS-PAGE凝胶的不同加样孔中。
3. 以150 V电泳40分钟。
4. 用考马斯亮蓝染色液染色2小时。
5. 用蒸馏水脱色过夜。
6. 使用智能手机或成像系统拍摄凝胶图像。

6. 使用侧向流动测定法（LFA）检测皮质醇

1. 将150 µL预处理后的唾液加入LFA试纸的样品垫上。
2. 让样品在试纸条上迁移10分钟。
3. 使用智能手机或成像系统拍摄检测结果的图像。
4. 在ImageJ中打开LFA图像，并使用图像 > 颜色 > 拆分通道，分离RGB通道。
5. 使用绿色通道图像进行检测线强度分析。
6. 选择一个100 × 10像素的矩形感兴趣区域（ROI），覆盖检测线，并将相同的ROI尺寸应用于所有试纸条图像。
7. 测量检测线ROI的平均强度值。选择相邻的空白膜区域，使用相同大小的ROI，测量背景强度。
8. 按下式计算归一化的检测线强度：归一化强度 = 检测线强度 − 背景强度。

7. 统计分析

1. 除非另有说明，定量数据以均值 ± 标准差（SD）表示。将误差线定义为 SD。
   注：在本研究中，所有报告的 N 值均代表使用商业获取的混合人唾液等分试样进行的技术重复。
2. 使用从 0–8 ng mL⁻¹ 皮质醇浓度获得的归一化检测线强度值进行线性回归分析，并根据拟合曲线计算决定系数（R²）。
3. 使用以下公式计算检测限（LOD）：LOD = 3.3 × SE / |slope|，其中 SE 为线性回归方程中 y 轴截距的标准误差，|slope| 为斜率的绝对值。使用斜率的绝对值，因为竞争性 LFA 产生负斜率。
   注：在本研究中，未进行推论性统计检验，也未应用显著性标准。

结果

有效的唾液预处理需要去除会干扰下游分析性能的组分，包括黏蛋白和蛋白质。首先通过比较使用SaliFilter与商用唾液采集试剂盒处理后浊度的变化，来评估SaliFilter的过滤能力（图2A）。未经处理的唾液表现出较高的浊度，而经SaliFilter处理的样本明显澄清，表明其中的黏蛋白和悬浮成分被有效去除。相比之下，使用商用试剂盒处理的样本在澄清度上的改善有限。

通过测量280 nm处的吸光度定量评估蛋白质去除效果，结果显示过滤后蛋白质含量减少了约69%（图2B）。这一结果在Bradford法测定中得到进一步验证，经SaliFilter处理的样品颜色强度显著降低（图2C），对应总蛋白浓度减少约80%（图2D）。此外，SDS-PAGE分析显示处理后的样品中无可见蛋白条带，证实唾液蛋白被有效去除（图2E

讨论

基于唾液的诊断技术为血液分析提供了一种无创替代方案。然而，由于唾液固有的黏稠性以及黏蛋白和蛋白质等干扰成分的存在，其广泛应用受到限制。这些因素会干扰毛细管驱动的流动，影响包括侧向流动分析（LFA）在内的简单分析平台的性能，因此需要有效的样本预处理方法。

本研究中，我们证明了所提出的手持式过滤装置 SaliFilter 能有效去除高分子量的干扰物质，同时保留皮质醇等小分子目标分析物。RBCM 涂层作为在 PES 膜上形成的生物来源界面层，有助于去除唾液中黏蛋白和蛋白质等高分子量组分。通过消除干扰流动的成分，该装置实现了唾液样本无需复杂或依赖仪器的预处理即可直接用于侧向流动检测（LFAs）。该发现凸显了样本预处理在连接原始生物样本与简化诊断平台之间的关键作用。

传统的样本预处理策略（如离心和稀释）在即时检测环境中存在固有局限性。离心需要实验室基础设施和多个处理步骤，而稀释会降低分析物浓度，影响分析灵敏度。相比之下，本方法可实现快速、无需设备的样本处理，同时保持分析物的完整性，从而改善毛细管流动并提高分析可靠性。我们先前的研究

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工唾液	Solarbio, 中国	A7990
Bio-Rad 蛋白检测试剂染料	Bio-Rad, 美国	5000006	用于 Bradford 法蛋白测定
考马斯亮蓝	Abcam, 英国	ab119211	用于蛋白条带显色
皮质醇 ELISA 试剂盒	Abcam, 英国	ab154996
皮质醇 LFA	本实验室自制
加热板	Daihan Scientific, 韩国
氢化可的松（皮质醇）	Sigma-Aldrich, 美国	PHR1014
Laemmli 样品缓冲液	GenDEPOT, 美国	L1200-001	用于 SDS-PAGE 前的蛋白变性
膜夹持器	GVS Filter Technology	1220950	直径 13 mm 的夹持器
Mini-PROTEAN® Tetra Cell（适用于 0.75 mm 胶）	Bio-Rad, 美国	1658000	用于凝胶电泳
黏蛋白	Sigma-Aldrich, 美国	M2378
NanoDrop 2000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific, 美国		用于蛋白测定
PES 膜	STERLITECH, 美国	PES00313100	0.03 微米，13 mm PES 膜
磷酸盐缓冲液（PBS）	DUKSAN, 韩国	LB004
混合人唾液	Innovative Research Inc., 美国	IRHUSL5ML
RBCM	本实验室自制
PAGE 分离胶缓冲液	Bio-Rad, 美国	1610798	用于分离胶的配制
Salivette 皮质醇采样管	SARSTEDT, 德国	51.1534.500	唾液采集套件
PAGE 浓缩胶缓冲液	Bio-Rad, 美国	1610799	用于浓缩胶的配制
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, 美国	SSAL-601	唾液采集套件
注射器	koreavaccine, 韩国		1 mL 容量
TEMED	Bio-Rad, 美国	1610800	用于丙烯酰胺聚合