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研究文章

N6-甲基腺苷修饰Rab27A通过影响去卵巢小鼠模型中破骨细胞分化促进骨质疏松

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DOI：

10.3791/71964

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2026年8月11日

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1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

YTHDC1 促进 m6A 修饰的 Rab27A 向细胞质输出，而 IGF2BP2 在细胞质中稳定 Rab27A，从而增强破骨细胞分化并促进骨质疏松症的发生。

摘要

骨质疏松症新型疗法的开发已受到越来越多的关注。Rab27A 在破骨细胞分化过程中表达上调，而 N6-甲基腺苷（m6A）修饰已被证实是骨科疾病中一种重要的表观遗传调控机制。生物信息学分析预测 Rab27A 含有多个 m6A 修饰位点，并可与多种 m6A 相关蛋白相互作用。本研究通过去卵巢（OVX）小鼠模型，利用基因敲低实验评估 Rab27A 在破骨细胞分化及骨质疏松症中的作用。在 OVX 小鼠中，Rab27A 缺失缓解了骨质疏松症，并使骨形成比例从 14.73% 提高至 28.13%（P < 0.05）。Western blot 和定量 PCR 结果显示，Rab27A 敲低可降低破骨细胞标志物 TRAP、NFATc1 和 c-FOS 的蛋白及 mRNA 表达水平，从而抑制由巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子-κB 配体受体激活剂（RANKL）诱导的骨髓来源巨噬细胞（BMMs）向破骨细胞的分化。TRAP 染色进一步表明，在 M-CSF 和 RANKL 诱导后，Rab27A 缺失使 TRAP 活性显著从 24.1% 降至 12.9%（P < 0.01）。RNA 免疫共沉淀实验确认 Rab27A 与 m6A 读取蛋白 YTHDC1 和 IGF2BP2 存在相互作用。核质分离实验表明，YTHDC1 促进 m6A 修饰的 Rab27A 从细胞核向细胞质的转运。此外，q-PCR 和 Western blot 分析显示，敲低 YTHDC1 或 IGF2BP2 均可降低 Rab27A 的表达，并减少 TRAP、NFATc1 和 c-FOS 的表达，从而抑制 M-CSF 和 RANKL 诱导的破骨细胞分化。综上所述，这些研究结果表明，YTHDC1 介导的 m6A 修饰 Rab27A 的胞质转运以及 IGF2BP2 介导的其稳定性维持，共同促进破骨细胞分化，并在 OVX 小鼠模型中导致骨量丢失。

引言

骨质疏松症（OP）是一种常见的骨骼系统疾病，其特征是骨微结构退化和骨矿物质密度降低，导致全球范围内骨折风险升高1,2,3。骨质疏松性骨折最常发生在前臂、肱骨、髋部和脊柱，尤其在老年人群中更为普遍。此类骨折显著降低患者的生活质量，并给患者本人、家庭以及医疗保健系统带来巨大的身体、心理和社会经济负担3。因此，骨质疏松症的预防、管理和治疗仍是临床医学和公共卫生领域的重要任务。

已针对骨质疏松症开发出多种治疗策略，通常可分为两类：促骨形成药物和抗骨吸收疗法4,5。传统的抗骨吸收药物包括双膦酸盐、雷洛昔芬和雷尼酸锶，而较新的药物则包括地诺单抗、奥达那替布和沙拉西尼布。促骨形成疗法包括甲状旁腺激素（PTH 1–84），此外还有多种候选药物（如 MK-5442、AMG 785 和 BHQ 880）正处于临床研发阶段5。尽管这些治疗方法可能有效，但许多药物存在显著的不良反应、长期疗效有限或无法长期使用等限制4,6,7,8,9。例如，长期使用氨基双膦酸盐和地诺单抗可能损害正常的骨重建过程5。因此，寻找更安全且更有效的治疗靶点仍是骨质疏松症研究的重要目标。

Rab蛋白是细胞内囊泡运输和细胞信号转导的关键调控因子，参与多种生物学过程，包括病毒感染、自噬以及细胞骨架的组织10。近年来，Rab家族蛋白在骨代谢和骨质疏松症中的作用受到越来越多的关注。已有研究报道，Rab44通过调控细胞内Ca2⁺信号并激活核因子κB配体受体激活剂（RANKL）处理的巨噬细胞中的活化T细胞核因子1（NFATc1），从而调节破骨细胞的分化11。破骨细胞是由巨噬细胞系前体细胞衍生而来的多核细胞，在骨吸收和骨骼稳态中发挥关键作用12,13,14,15,16,17,18,19。因此，阐明调控破骨细胞分化的分子机制，对于开发治疗骨质疏松症的新疗法至关重要。

Rab27A 是 Rab GTP 酶家族的重要成员，在分泌细胞和免疫细胞中广泛表达。它在囊泡运输、胞吐作用以及细胞内信号传导中发挥关键作用20,21,22,23,24,25,26,27。先前的研究表明，Rab27A 在气道炎症过程中调控嗜酸性粒细胞的脱颗粒，并在活化的巨噬细胞中控制与 NADPH 氧化酶活性相关的囊泡动员20.23。值得注意的是，越来越多的证据显示，Rab27A 的表达在破骨细胞分化过程中显著上调。Shimada-Sugawara 等人报道，骨髓来源巨噬细胞（BMMs）向破骨细胞分化的过程中，Rab27A 的表达增加，提示其在破骨细胞生成中可能具有重要作用28。综上所述，这些研究结果表明，Rab27A 可能通过调控囊泡运输和细胞内信号通路，影响破骨细胞的形成与功能28,29。

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物信使RNA和非编码RNA中最丰富的内部RNA修饰，作为RNA代谢和基因表达的关键调控因子。作为在哺乳动物中首次被鉴定的mRNA修饰，m6A已被证实参与多种生物学过程，包括RNA稳定性、剪接、转运和翻译。Wang等人的研究表明，通常发生在保守序列基序内的m6A修饰可被含有YTH结构域的蛋白质识别，从而参与调控mRNA的稳定性和代谢30。此外，m6A修饰还被发现参与多种生物学功能，包括基因组稳定性、转录调控、染色质组织、癌症进展以及免疫应答31。最近的研究也揭示了m6A信号在骨相关疾病和骨质疏松症中的重要作用32。

在m6A阅读蛋白中，YTHDC1作为核内阅读蛋白，调控RNA的加工及核输出，而胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）则在细胞质中稳定m6A修饰的转录本。Chen等人研究表明，YTHDC1促进m6A修饰的circNSUN2从细胞核输出，随后该分子与IGF2BP2相互作用，稳定HMGA2 mRNA，从而促进结直肠癌的转移33。这些发现提示，YTHDC1与IGF2BP2的协同调控可能代表了一种控制m6A修饰转录本命运的普遍机制。

本研究探讨了Rab27A mRNA中预测的m6A修饰位点，并分析了其与YTHDC1和IGF2BP2的相互作用。研究发现，YTHDC1促进m6A修饰的Rab27A转录本从细胞核输出，而IGF2BP2则在细胞质中与Rab27A相互作用并增强其稳定性。通过这一调控机制，Rab27A促进了破骨细胞的分化，并推动了骨质疏松症的发展。综上所述，研究结果揭示了一条此前未被认识的、依赖m6A的调控通路，该通路由YTHDC1、IGF2BP2和Rab27A共同参与破骨细胞分化过程。这些发现为骨质疏松症的分子发病机制提供了新的见解，并可能有助于开发靶向m6A介导的Rab27A调控的新型治疗策略。

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方案

所有动物实验均经西南医科大学附属医院动物保护与利用委员会批准（批准号：2024-Ethics-042）。所有实验均遵循ARRIVE指南、英国《1986年动物（科学程序）法》及其相关指南、欧盟指令2010/63/EU，以及美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物编号8023，1978年修订版）。小鼠被随机分配至各实验组，分组序列对研究人员设盲。所有数据采集与分析，包括组织学评估、显微计算机断层扫描（micro-CT）图像分析及统计学分析，均由不知晓分组情况的研究人员完成。分析中未排除任何动物或样本。本方案中使用的所有试剂、设备、软件及其他资源均列于材料表中。

1. 构建卵巢切除术（OVX）模型

使用24只8周龄的雌性野生型C57BL/6小鼠建立骨质疏松模型。经过1周的适应性饲养后，将小鼠随机分为假手术组（Sham）或卵巢切除组（OVX）。OVX模型通过双侧卵巢切除术建立，方法如前所述34,35。假手术组小鼠仅进行卵巢暴露手术，但不切除卵巢。

对于股骨内基因递送，在OVX手术后7天，按照先前报道的方法36,37，通过髌骨通路将表达sh-Rab27A或sh-NC的慢病毒载体注入股骨。简言之，在麻醉条件下，使用22号针头将浓缩的慢病毒颗粒（1 × 106 转导单位/mL）注入股骨。每只小鼠注射20 µL慢病毒悬液。随后缝合切口，并在恢复期间对动物进行监测。

所有动物实验均在无特定病原体条件下进行。术后8周收集股骨样本。每组至少使用六只小鼠用于组织学分析以及RNA或蛋白质提取。

2. 体内 微型计算机断层扫描成像

采用微型计算机断层扫描（micro-CT）评估小梁骨形态。对每只小鼠的右胫骨进行扫描 体内 在14周龄时进行OVX手术前。随访扫描每周进行一次，直至22周龄。每组至少包含六只小鼠用于显微CT分析。

小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg 体重）进行麻醉。通过脚趾夹捏反射消失以及持续监测呼吸频率来确认麻醉效果，并在整个成像过程中维持麻醉状态。所有安乐死操作均依照批准的动物实验方案、机构动物福利指南以及实验室动物安乐死的国家规定进行。

24周龄时，小鼠在深度麻醉后通过颈椎脱位法处死，取双侧胫骨用于后续实验 离体 采用相同的成像方案进行扫描。扫描参数包括：体素尺寸为10.4 µm，电压为55 kV，电流为145 µA，视野为32 mm，每投影采样数为1500/750，积分时间为100 ms。

图像采用针对1200 mg HA/cm3模体校准的三阶多项式束硬化校正算法进行处理。在位于生长板近端1.0 mm处的股骨远端干骺端，定量分析骨体积分数（BV/TV）、小梁厚度（Tb.Th）和小梁数量（Tb.N）。

3. 质粒转染

生成了sh-Rab27A和sh-NC质粒并用于慢病毒的制备。根据制造商的说明，将慢病毒包装质粒与shRNA载体共同转染至HEK293T细胞中。在股骨内注射前，按先前所述方法测定病毒滴度36。实验共进行三次独立的生物学重复。

4. 苏木精-伊红（HE）染色

股骨样本用4%多聚甲醛固定24小时，用10% EDTA脱钙4周，用30%蔗糖/PBS进行冷冻保护，包埋于石蜡中，并切成5 µm厚的切片。组织切片经苏木精和伊红染色后，使用光学显微镜进行观察。每组至少分析六只小鼠。

5. 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色

按照制造商说明书对股骨切片进行TRAP染色38。使用TRAP染色实验检测骨髓来源巨噬细胞（BMMs）中的TRAP活性。成熟的破骨细胞定义为TRAP阳性、含至少三个细胞核的多核细胞。实验进行三次独立的生物学重复，每次均设三个技术重复。

6. 定量 PCR

使用TRIzol试剂按照制造商说明书提取总RNA。利用逆转录酶合成互补DNA，并采用SYBR Green荧光染料法进行实时定量PCR检测。实验共进行三次独立的生物学重复，每次均设有三次技术重复。

引物序列如下：

Rab27A：F，TTCCTGCTTCTGTTCGACCT；R，GGCAGCACTGGTTTCAAAAT

TRAP：F，TGTTGACAGCGGTCCATCTA；R，CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1：F，GGTGCTGTCTGGCCATAACT；R，GCGGAAAGGTGGTATCTCAA

c-FOS：F，TACTACCATTCCCCAGCCGA；R，GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1：F，GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG；R，TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2：F，GACTACCCCGACCAGAACTG；R，GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-actin：F，GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG；R，TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. 蛋白质印迹法

使用添加了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞或组织。采用Bradford法测定蛋白浓度。取等量蛋白（20 µg）进行SDS-PAGE分离，随后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜上。膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时，然后在4 °C下与针对TRAP、NFATc1、c-FOS、Rab27A、YTHDC1、IGF2BP2或β-actin的一抗孵育过夜。洗涤后，膜在室温下与相应的二抗孵育1小时。采用标准检测方法显影蛋白条带。实验共进行三次独立的生物学重复。

8. 细胞培养

骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）按先前所述方法分离39。从小鼠股骨中分离的骨髓细胞在含10%胎牛血清、30 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和1%青霉素/链霉素的α-最低必需培养基中，于37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养过夜。收集非贴壁细胞，并在含30 ng/mL M-CSF的基质细胞无细胞体系中继续培养。培养3天后，收集贴壁细胞作为BMMs，并在含30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL 核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的条件下进一步培养72小时，以诱导破骨细胞分化。

9. RNA干扰（RNAi）

采用脂质体转染试剂，按照制造商说明书合成并转染小干扰RNA（siRNAs）。转染前，将细胞以每孔2 × 104个细胞的密度接种于6孔板中。实验共进行三次独立的生物学重复。

靶序列如下：

si-Rab27A：GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1：GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2：CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. 免疫荧光

细胞用4%多聚甲醛固定20分钟，再用0.1% Triton X-100透化10分钟。用5%牛血清白蛋白封闭30分钟后，细胞在4 °C下与一抗孵育过夜。

洗涤后，在室温下加入荧光染料标记的二抗孵育30分钟。用DAPI对细胞核进行复染，并通过共聚焦显微镜采集图像。实验共进行了三次独立的生物学重复。

11. 细胞核与细胞质分离

根据制造商说明书分离核组分和胞质组分。细胞在冰上裂解10分钟，于4 °C以500 × g离心3分钟。收集含有胞质成分的上清液，而含有细胞核的沉淀物则经洗涤后单独处理。

12. RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）

RNA 免疫沉淀（RIP）实验按照制造商说明书进行。简言之，细胞在冰上裂解 30 分钟。离心后，上清液与抗体及 Protein A/G 琼脂糖珠在 4°C 过夜孵育。洗涤后，通过蛋白质印迹分析免疫沉淀的蛋白质，通过定量实时 PCR 分析共免疫沉淀的 RNA。实验进行了三次独立的生物学重复。

13. Rab27A mRNA 稳定性检测

在IGF2BP2敲低后的指定时间点提取总RNA。随后进行逆转录和定量实时PCR。Rab27A mRNA水平以0 h时的si-NC组为对照进行标准化。实验共进行了三次独立的生物学重复。

14. 统计分析

所有实验均使用至少三个生物学重复独立进行。对于q-PCR、RNA干扰、TRAP染色、蛋白质印迹及其他基于细胞的检测，每个生物学重复包含三个技术重复，除非另有说明。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。

统计分析使用 GraphPad Prism 9.0 版本和 SPSS 软件进行。两组之间的比较采用双尾 Student t 检验。多组之间的比较采用双因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验以校正多重比较。当 P 值 < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。

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结果

Rab27A 沉默减轻骨质疏松症 体内.

为研究Rab27A在骨质疏松症中的作用，采用既往报道的方法建立卵巢切除（OVX）小鼠模型，并进行Rab27A基因敲低34,40。整体研究设计见图1。显微计算机断层扫描分析显示，与假手术对照组小鼠相比，OVX小鼠的骨密度、骨体积分数（BV/TV）、小梁厚度（Tb.Th）和小梁数量（Tb.N）均显著降低（图2A）。这些结果证实了骨质疏松症模型的成功建立。Rab27A基因敲低显著恢复了所有检测的骨结构参数，表明可缓解OVX诱导的骨量丢失及骨微结构恶化（图2A）。

组织学检查进一步支持了这些发现。苏木精和伊红染色显示，与假手术组相比，卵巢切除小鼠出现...

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讨论

破骨细胞分化在骨重建、骨吸收、骨折修复及骨骼稳态中发挥着关键作用12˒15˒17˒18˒42˒43。破骨细胞活性过度增强是骨质疏松症的主要诱因之一，因此识别调控破骨细胞分化的信号通路成为重要的研究目标。多种靶向破骨细胞功能的抗吸收疗法已显示出临床疗效6,44,45。例如，地诺单抗（denosumab）与降低骨折发生率及良好的安全性相关6，而组织蛋白酶K抑制剂ONO-5334在去卵巢非人灵长类动物中显示出对骨矿物质密度和骨强度的有益作用44。本研究发现了一种此前未被识别的依赖m...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益或利益冲突。

致谢

本工作由彭州市人民医院与西南医科大学科技战略合作项目（项目编号：2023PZXNYD01）资助，授予唐莲。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% 多聚甲醛Thermo Fisher ScientificA5818101组织和细胞固定
Alexa Fluor 488 二抗Thermo Fisher ScientificA-11001免疫荧光用荧光二抗；RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 二抗Thermo Fisher ScientificA-11035免疫荧光用荧光二抗；RRID: AB_2534093
牛血清白蛋白 (BSA)MerckA2153封闭试剂
Bradford 蛋白定量试剂盒MerckB6916蛋白质定量
C57BL/6JSlac 小鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司—雌性，8 周龄；RRID: MGI:2159769
c-FOS 抗体Abcamab222699Western blot 一抗；RRID: AB_2891049
共聚焦激光扫描显微镜 (SP8)Leica MicrosystemsSP8免疫荧光图像采集；RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571免疫荧光核复染剂；RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500G组织脱钙试剂
伊红SolarbioG1100组织学胞质染色剂
胎牛血清 (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701细胞培养添加剂
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0统计分析软件；RRID: SCR_002798
苏木精Cell Signaling Technology#14166组织学核染色剂
IBM SPSS StatisticsIBMWindows 版本统计分析软件；RRID: SCR_016479
IGF2BP2 抗体Proteintech11601-1-APWestern blot 和免疫荧光一抗；RRID: AB_2122672
倒置光学显微镜 (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8组织学图像采集；RRID: SCR_026672
慢病毒滴度定量试剂盒Takara Bio631235慢病毒滴度测定
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015质粒转染试剂
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA 转染试剂
M-CSFMedChemExpressHY-P7085破骨细胞分化因子
微型计算机断层扫描系统Scanco MedicalVivaCT80骨形态计量学分析
M-MLV 逆转录酶PromegaM1701cDNA 合成
NFATc1 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-7294Western blot 一抗；RRID: AB_2152503
PARIS 试剂盒Thermo Fisher ScientificAM1556核质分离
青霉素/链霉素Thermo Fisher Scientific15140122细胞培养用抗生素添加剂
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659定量实时 PCR
蛋白酶抑制剂混合物Thermo Fisher Scientific78429防止蛋白质降解
Protein A/G 琼脂糖微珠MerckIP05免疫共沉淀
PVDF 膜Thermo Fisher Scientific88520Western blot 蛋白转印膜
Rab27A 抗体Abcamab55667Western blot 和免疫荧光一抗；RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425破骨细胞分化因子
实时 PCR 系统Applied BiosystemsABI7900HT定量实时 PCR 仪器
RIPA 裂解缓冲液Thermo Fisher Scientific78501蛋白质提取缓冲液
RNA 免疫共沉淀 (RIP) 试剂盒MilliporeRIP-12RXNRNA 免疫共沉淀实验
SDS-PAGE 试剂Thermo Fisher ScientificBT041210BOX蛋白质电泳
shRNA 质粒RiboBio—RNA 干扰介导的基因沉默
小干扰 RNA (siRNA)GenePharma—RNA 干扰介导的基因沉默
SRAMP在线资源—m6A 修饰位点预测工具；RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)在线资源—RNA 相互作用预测数据库；RRID: SCR_016303
TRAP 抗体Abcamab2391Western blot 一抗；RRID: AB_303034
TRAP 染色试剂盒Merck387A破骨细胞活性检测
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111细胞通透化试剂
TRIzol 试剂Thermo Fisher Scientific15596026CN总 RNA 提取
YTHDC1 抗体Abcamab122340Western blot 一抗；RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651细胞培养基
β-Actin 抗体MerckA5441Western blot 上样对照；RRID: AB_476744

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