在异氟烷麻醉下对大鼠进行尾动脉采血，可实现低应激、可控地采集相对大量的血液样本。由于其恢复迅速且适用于重复采样，该方法特别适用于需要可靠生理参数的纵向研究。
本文内容
摘要
摘要
本方法描述了通过异氟烷麻醉大鼠的尾动脉进行采血的技术。使用异氟烷可最大限度减少动物的防御性动作，从而为实验动物和研究人员提供一种可控且低应激的操作过程。其他优势还包括：由于异氟烷作用时间短，动物在采血后可迅速恢复；可通过单次穿刺获取相对较大的血量；该技术适用于多次重复采血。此外，较快的动脉血流可能降低凝血相关假象的发生概率，尽管本研究未对此进行专门评估。相关结果是在一项药代动力学研究中确定的。所有动物均成功完成采血，采样成功率达到100%。采血后24小时未观察到显著的体重下降，动物恢复迅速，无明显痛苦表现或与操作相关的并发症。总体而言，该方法非常适用于需要可靠且可重复采血、同时将操作应激降至最低的实验场景。经过短暂的学习阶段后，该操作被证实可稳定地用于常规实验。然而，在实验设计和结果解读时，应考虑异氟烷麻醉对血气、代谢及内分泌参数可能产生的影响。
引言
采血是利用大鼠进行实验研究以评估生理学和药代动力学参数的关键技术。推荐的技术包括尾部切口、侧尾静脉采血、隐静脉采血、舌下静脉采血、颈静脉采血、眶后窦采血以及插管术1,2,3,4,5,6,7。然而，方法的选择取决于预期的实验结果，且每种方法均有其固有的局限性。
侧尾静脉采血和尾部切口采血可能获得的血量有限，而眶后静脉采血虽然效率较高，但侵入性更强，影响动物恢复1，并存在组织损伤4,8的风险以及伦理方面的顾虑。隐静脉采血需要固定动物并对穿刺部位进行剃毛2，这可能引起应激反应，进而影响实验结果。由于隐静脉较短且止血较快，反复从该静脉采血也具有挑战性。舌下静脉采血同样存在此类问题。虽然通过颈静脉穿刺可快速获取大量血液，但存在损伤肺部导致气胸的风险。此外，由于该静脉不可见，穿刺必须盲穿进行6。
在此背景下，既能最大限度减少动物痛苦又能确保样本质量的优化方法正变得日益重要。在异氟烷麻醉下进行尾动脉采血即为此类方法之一。使用短效吸入性麻醉剂可减少操作应激，并有助于实现可控的采样过程。此外，由于动脉血流速度快，动脉血采集有望提供高质量的血液样本，并降低因凝血导致的伪影风险。该技术特别适用于重复采样和纵向研究设计，因为动物恢复迅速，生理干扰最小。总体而言，该方法将技术可靠性与动物福利的改善相结合，因此非常适合需要精确且可重复血液测量的实验环境。
方案
所有涉及本方法的实验均经维也纳医科大学伦理委员会及奥地利教育、科学和研究部批准。
1. 准备
注意：在实施麻醉前，应准备好所有所需材料，以确保操作顺利高效。
- 用 3.2% 枸橼酸盐填充注射器（用量取决于所需参数），以防止血液凝固。
- 将氧气流速设置为 0.5 L/min，并通入诱导室和面罩中。
- 夹闭连接面罩的软管，确保诱导气体和氧气完全进入诱导室。
- 将大鼠从笼中取出并放入诱导室内。
- 关闭诱导室盖子，确保大鼠的尾巴或足部未被夹住。
- 将异氟烷浓度设为 3%（根据软管系统而定），并维持至动物出现自发运动消失及翻正反射消失。
- 轻轻前后摇动诱导室，以确认翻正反射已丧失。
- 夹闭连接箱体的软管，将气体和氧气重新导向面罩。
- 打开诱导室盖子，取出大鼠。
- 将大鼠仰卧置于加热垫（38 °C）上，鼻部置于面罩内（图 1）。
- 用水清洁大鼠尾部，并用纸巾擦干。
- 用酒精对尾部进行消毒。
- 通过夹捏大鼠后肢脚趾间部位，确认无趾间反射，即无回缩反应。
图1：大鼠体位。 大鼠仰卧，鼻部置于麻醉面罩中。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 血液采样
注意：动脉位于尾部的腹侧。最佳穿刺部位位于尾部中段与远端之间。动脉主要通过其解剖位置来识别，但在色素较浅的大鼠（例如 Sprague Dawley 大鼠）中，尾腹侧动脉偶尔可见为一条淡蓝色的微弱血管。在此情况下，通常可通过尾根部腹侧正中线的解剖位置轻易识别尾腹侧动脉。一旦识别，即可沿其走向向远端追踪至预定的穿刺部位。
- 从近端向远端沿动脉走行进行操作。
- 将针头斜面向上放置。
- 以约 30 ° 角度插入针头（图 2）。
- 将针头向头侧推进，然后与尾部平行前进（图 2）。
- 将血液抽入注射器中（图 2）。
注意：若针头可顺利推进，则根据相关指南抽取所需血量。若血压过低无法采血，可将异氟烷浓度降低至 2.5%，并在不将针头退出穿刺点的情况下重复操作。每次后续采血时，新的穿刺点应位于前一次穿刺点的头侧。 - 拔出针头前，用棉签按压注射部位。
- 关闭气体麻醉装置，并检查穿刺部位。
注意：待出血停止后，将大鼠放回其饲养笼中。
图2：穿刺部位。穿刺部位位于尾部中段与远端三分之一之间的腹侧，针头应以30°角插入。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 血液处理
- 将采集的血液倒入试管中。
- 将血液置于冰上保存，直至离心。
结果
本方法论文中展示的数据来自一项药代动力学研究。仅纳入6至8周龄、体重在393 g至429 g之间的雄性Sprague Dawley大鼠。在第0天从尾动脉采集单次血液样本（0.3 mL）。在采血前立即记录体重，并在采样后24小时再次记录。动物迅速呼出麻醉气体，恢复迅速。此后不久即开始进食，且未表现出一般健康状况受损的迹象。在将大鼠从笼中取出进行后续采血时，未观察到其出现痛苦或恐惧的表现。此外，操作后数日内亦未观察到防御性行为。若操作得当，尾部未见血肿形成。在采血后即刻及随后数日内，动物均未表现出疼痛迹象，尾部采血部位触碰时亦无痛感。采血后24小时内未观察到体重下降。平均体重从第0天的409 g增至第1天的419 g，相当于平均体重增加了2.6% ± 1.1%，表明该采血操作耐受性良好（图3）。
图3：体重变化。大鼠（n = 12）采血前（d0）和采血后24小时（d1）的体重（g）。采血后未观察到体重下降。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文介绍的尾动脉采血技术特别适用于需要多次重复采血或采集相对较大血量的研究。与尾静脉采血相比，该技术可通过单次穿刺位点采集更多的血液体积，并在重复采血时具有实际优势，因为反复静脉穿刺可能导致血肿形成及静脉可及性下降，使后续操作更加困难。根据德国实验动物科学学会（Die Gesellschaft für Versuchstierkunde / Society of Laboratory Animal Science, GV-SOLAS）和欧洲实验动物科学联合会（Federation of European Laboratory Animal Science Associations, FELASA）的建议，单次采血量不应超过循环血量的10%，而每日重复采血则应限制在每24小时不超过循环血量的1%，且需在采血后安排适当的恢复期。本描述的技术能够可靠且可重复地达到上述推荐的采血量，因此适用于单次和重复性采血方案。
理想的采血技术应能在尽量减少操作应激的同时，提供足量适用于预定分析的血液，并确保样本质量。经眼后静脉丛和舌下静脉采血可能因组织损伤而导致凝血问题8,9，这将不利于凝血研究。类似地，滴注技术——例如 "挤奶" 尾静脉采血也可能导致采样诱导的凝血。与这些采样方法相比，通过尾部获取的动脉血似乎更不易发生过早凝固。这可能归因于快速的采集过程、无组织损伤以及血液与注射器内枸橼酸盐的即时接触，后者能有效防止凝血。其他技术，如颈静脉穿刺，则存在造成器官损伤的风险。1,6 推荐的导管插入程序需要全身麻醉，随后进行术后护理和伤口管理。必须定期冲洗导管以防止堵塞，且动物始终存在自行拔除导管的风险。
从尾动脉采血需要短暂镇静，因为动物必须保持仰卧位，且穿刺过程具有疼痛性，容易引发防御性动作。使用异氟烷麻醉可最大限度减少防御性动作，使操作能够以受控且高效的方式进行。因此，采血过程可迅速完成，与通过尾静脉采血的技术相比，减轻了动物的整体负担，后者可能需要更长时间才能采集到所需血量。缺乏防御性动作也降低了重复针刺的可能性。重要的是，动物在过程中无意识感知，恢复迅速，通常在采样后很快恢复正常行为1。采血后，动物从异氟烷麻醉中迅速恢复，通常很快重新恢复正常行为。在本研究中，采血后24小时测得的体重较基线略有增加，表明该操作未对摄食造成不利影响，支持动物在短期内顺利恢复。
异氟烷已知会降低血压10,11，这可能导致静脉充盈减少，从而使静脉采血变得复杂。相比之下，不使用麻醉进行静脉采血需要对动物进行固定1,2，而固定可能引起显著的应激反应，并可能影响实验结果。此外，应激会引起血管收缩，也可能使血液采集更加困难。降低的血压也可能影响动脉采血；然而，根据我们的经验，通过调整异氟烷浓度即可有效控制这一问题，从而维持足够的血流以完成采样。
然而，异氟烷也已知会影响生理参数，特别是由于呼吸抑制导致的血气值变化12,13。异氟烷可影响呼吸功能和气体交换，可能改变动脉血氧和二氧化碳水平。多项研究表明，异氟烷还可改变代谢和内分泌参数，包括血糖、乳酸、胰岛素、皮质酮以及脂质代谢14,15,16。尽管如此，与其他多种麻醉方案相比，异氟烷在应激相关参数上的干扰较小，且具有诱导迅速、恢复时间短以及麻醉深度易于精确控制等优势，因此非常适合常规采血操作14。因此，在设计和解读实验时应考虑异氟烷的潜在影响，因为在麻醉状态下采集的动脉血样本可能无法准确反映基础生理状态。然而，对于药代动力学研究而言，与获得可重复血样并最大限度减少操作相关应激所带来的益处相比，这些影响通常意义较小。
另一个需要考虑的因素是实验人员对异氟烷的职业暴露。由于该系统并非完全密闭，在操作过程中存在麻醉气体暴露的风险。在层流罩下操作或使用适当的废气清除系统可减少暴露，但此类设备并非在所有实验环境中都可获得。
总体而言，所述技术是一种优于传统采血方法的有价值替代方案，兼具预期良好的样本质量、更低的应激反应以及更优的操作条件。该方法在动物福利和操作效率方面具有明显优势。其适用性最终取决于具体的研究问题，但在需要可靠血液参数和最小生理干扰的实验条件下尤为有利。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者希望 感谢 感谢Katharina Tillmann激励她发表此方法。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉系统 | Dräger | https://www.draeger.com/en-us_us/Productfinder/Anaesthesia/Anaesthesia-Machines#products | 气体麻醉 |
| 柠檬酸盐真空采血管（3.2% 枸橼酸钠） | Greiner Bio-One | 454332 | 抗凝剂 |
| Eppendorf 管 1.5 mL | Eppendorf | 3,01,25,150 | 血液储存 |
| 异氟烷液体（Isospire） | Dechra | 气体麻醉 | |
| 针头（25 G ´ 5/8"） | BD Microlance | 300600 | 采血 |
| 1 mL 注射器（结核菌素鲁尔接头） | Chirana | CHTUB01 | 采血 |
| Thermomaquet 2000 | Maquet | Thermomaquet 2000 | 加热系统 |
| Zelletten 纤维素棉片 5 cm ´ 4 cm | Lohmann&Rauscher | 止血 |
参考文献
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