本方案描述了一种利用梯度TCR刺激方法系统性激活小鼠初始CD8+ T细胞的系统性方法，可实现对不同TCR信号强度下CD8+ T细胞增殖、活化及细胞因子产生的全面分析。
方法文章
TCR信号强度与时程在小鼠原代CD8+ T细胞活化与分化中的作用：一种标准化的体外研究方法
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
T 细胞受体（TCR）信号的强度和持续时间是决定 CD8⁺ T 细胞活化、增殖和功能分化的关键因素。然而，目前仍缺乏能够系统性比较不同 TCR 信号输入如何影响 T 细胞命运的标准化体外模型。本研究介绍了一种可重复的体外激活原代小鼠 T 细胞的方法，该方法采用包被于培养板的抗 CD3 抗体和可溶性抗 CD28 抗体，并补充白细胞介素-2（IL-2），通过调节抗 CD3 抗体浓度（信号强度）和刺激时间（信号持续时间），系统研究其对 T 细胞活化结果的影响。我们详细描述了从 C57BL/6 小鼠中分离初始 T 细胞的方案，并在一系列抗 CD3 抗体浓度（0.1–10 µg/mL）和刺激时间（6–48 h）条件下进行刺激。通过流式细胞术分析早期 TCR 诱导的信号通路，以内源性磷酸化核糖体蛋白 S6（p-S6）作为 mechanistic target of rapamycin complex 1（mTORC1）活性的读出指标；并进一步评估下游事件，包括表面活化标志物（CD69、CD25、ICOS、PD-1）、通过紫罗兰增殖示踪染料（CTV）稀释检测的细胞增殖，以及效应分子表达（Granzyme B、TNF-α），以反映功能分化状态。本方法提供了清晰、分步的可视化操作指南，有助于研究人员解析特定 TCR 信号参数如何引导 T 细胞命运决策。该策略不仅支持 T 细胞活化与分化的机制研究，还为过继性免疫治疗中的 T 细胞预处理及体外致敏实验提供了优化平台。通过结合视频演示与详细的方案叙述，本方案将提升 T 细胞免疫学研究中的方法透明度与可重复性。
引言
T细胞对于抵御病原体和肿瘤的保护性免疫反应至关重要。初始T细胞通过维持静息状态以确保其长期存活和持续存在1。在抗原刺激下，T细胞退出静息状态，经历克隆扩增并分化为效应细胞2。T细胞受体（TCR）信号转导是启动和调控适应性免疫反应的核心过程3。当特异性识别抗原呈递细胞（APC）表面所呈递的肽-主要组织相容性复合物（pMHC）分子时，将触发一系列信号事件，从而驱动T细胞的克隆扩增和功能分化4,5,6。
TCR 刺激的强度由抗原亲和力、亲合力和浓度等关键因素决定，在调控 T 细胞活化的程度、效应功能的获得以及向不同效应或记忆 T 细胞亚群分化的命运中起着关键作用7,8,9。目前用于研究 TCR 依赖性 T 细胞活化的体外模型主要采用包被于培养板或偶联于微珠的抗 CD3 和抗 CD28 抗体，可同时提供 TCR 结合信号和共刺激信号10,11。尽管此类系统被广泛使用，但通常仅采用单一浓度（常为饱和浓度）的抗 CD3 抗体，因而只能对 T 细胞活化进行“全或无”的二元比较，而无法反映通过梯度稀释刺激物所实现的 TCR 信号强度的动态范围12,13。
本文所述方案提供了一种标准化且可重复的体外系统，用于系统性评估梯度性 TCR 信号强度如何调控初级小鼠 CD8+ T 细胞的活化、增殖及功能表型。该方法采用滴定浓度的抗 CD3 抗体梯度（0.1–10 µg/mL）和固定浓度的抗 CD28 抗体（1 µg/mL）。该方案的核心是多参数流式细胞术，可同时检测上游信号通路——通过细胞内磷酸化核糖体蛋白 S6（p-S6）的表达水平反映雷帕霉素复合物 1 机械靶点（mTORC1）的活性——以及下游细胞反应，包括通过 CTV 稀释追踪的细胞增殖、活化表面标志物（CD69、CD25、可诱导 T 细胞共刺激分子 [ICOS]、程序性细胞死亡蛋白 1 [PD-1]）和效应分子的表达（颗粒酶 B、肿瘤坏死因子-α [TNF-α]），检测时间点覆盖刺激后 6 至 48 小时。
本方案采用包被于固相的抗CD3抗体的梯度浓度，以精确调控刺激强度，从而模拟生理条件下观察到的T细胞受体（TCR）结合亲和力的差异。该方法可高效实现TCR交联，并强有力地激活初始静息T细胞。标准化的包被程序确保抗体在培养板表面均匀分布，从而使同一批次细胞受到一致的刺激，实验重复性良好。该体系为T细胞活化提供了一种经济高效且操作简便的方法。
然而，应认识到该方法存在某些局限性。由抗CD3/CD28抗体介导的刺激与体内生理环境存在显著差异。尽管仅使用激动性抗CD3和抗CD28抗体来评估T细胞活化的实验方法能够有效反映活化情况，但其无法完全模拟抗原呈递细胞与T细胞之间的相互作用，以及生理条件下存在的共刺激微环境14。
尽管存在这些局限性，本方案仍提供了一个系统且可重复的平台，可作为研究TCR信号强度依赖性T细胞反应的有价值且易于使用的工具，并可补充更为复杂的抗原特异性模型。
方案
本研究中的所有动物实验均经第三军医大学动物护理与使用委员会批准。
1. 试剂与培养板的准备
- 用无菌 PBS 配制浓度为 0.1、0.5、1、5 和 10 µg/mL 的板结合型抗 CD3 抗体溶液。
- 每孔加入 50 µL 抗 CD3 包被液至平底 96 孔板中。
- 用封板膜密封，于 4 °C 过夜孵育。
- 吸除包被液，每孔用 200 µL 无菌 PBS 洗涤两次，然后加入细胞。
2. 从小鼠脾脏中分离初始型CD8+ T细胞
- 选取6–8周龄的雄性C57BL/6小鼠（购自北京西贝福生物科技有限公司），通过吸入CO2 并辅以颈椎脱位法实施安乐死。小鼠饲养于特定病原体阴性环境中，维持12小时光照/12小时黑暗循环，并可自由获取食物和水。每次独立实验至少使用3只小鼠。
- 使用手术剪小心切开腹膜以暴露脾脏，用镊子夹取并摘除脾脏，将其放入含有预冷的添加2%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基（R2）的收集皿中。在进行组织解离前，将收集皿置于冰上保存。
注意：所有动物尸体和细胞培养废弃物应收集于指定的生物危害袋中，并在121 °C下高压灭菌20分钟后方可处理。 - 将脾脏从收集皿中取出，转移至含有3 mL 1 × 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液的60 mm培养皿中。
- 使用3 mL注射器的推杆将脾脏轻轻研磨通过70 µm细胞筛网，制备单细胞悬液。
- 室温（RT）孵育1分钟，随后加入3 mL预冷的R2培养基以中和氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液。
- 将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在4 °C下以500 × g离心5分钟。
- 离心后，吸除上清液，并将沉淀重悬于10 mL流式细胞术染色缓冲液（含2% FBS的PBS）中。
- 将悬液通过70 µm细胞筛网过滤至新的15 mL锥形离心管中，再次在4 °C下以500 × g 离心5分钟。
注意：为保持细胞活力以用于后续功能实验，流式细胞术染色缓冲液中不应含有叠氮化钠。所有样品均应在4 °C保存并立即进行分析。 - 吸除上清液，将每只小鼠脾脏所得细胞沉淀重悬于200 µL生物素标记抗体混合液中（包含抗-CD16/32（Fc阻断剂）、抗-TER-119、抗-CD19、抗-CD4、抗-B220、抗-NK1.1、抗-Ly-6G、抗-CD11b、抗-CD11c、抗-CD49b、抗-CD44和抗-F4/80抗体）。
- 冰上孵育25分钟，每隔5分钟轻柔颠倒混匀一次，确保充分混悬。
- 用大量流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞，在500 × g 下离心5分钟，弃去上清液。
- 将沉淀重悬于与生物素标记抗体混合液相同体积的流式细胞术染色缓冲液中，加入等体积一半的链霉亲和素包被磁珠，冰上孵育15分钟，每隔5分钟轻柔颠倒混匀一次，确保充分混悬。
- 短暂离心后，将离心管置于磁力架上静置2–3分钟，小心转移上清液（富集的初始型CD8+ T细胞）至新的15 mL锥形离心管中。
- 用流式细胞术染色缓冲液洗涤收集的细胞一次，在500 × g 下再次离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于添加10% FBS的RPMI 1640培养基（R10）中，用于后续实验操作。
3. 使用紫罗兰增殖示踪染料（CTV）标记以追踪细胞增殖
- 使用前立即配制 2 × 新鲜的 CTV 工作液（10 µM）。将 5 mM 的 CTV 储存液（溶于二甲基亚砜 [DMSO] 中）充分涡旋混匀，再用无菌 PBS 稀释，得到终浓度为 10 µM 的工作液。
注意：操作 CTV 储存液（以 DMSO 配制）时，须在通风橱中佩戴腈类手套，因为 DMSO 可促进有毒物质经皮肤吸收。避免吸入或皮肤接触。 - 将分离得到的一半初始 CD8+ T 细胞重悬于预冷的 PBS 中，细胞密度为 8 × 107 个细胞/mL。
- 向细胞悬液中迅速加入等体积的 2 × CTV 工作液（10 µM），用移液器充分混匀，使 CTV 的终浓度为 5 µM。
- 将细胞在室温避光条件下孵育 20 分钟，每隔 5 分钟轻轻翻转管子数次，以确保充分混匀。
- 向细胞中加入 5 倍体积的培养基（含至少 10% 胎牛血清），冰上孵育 5 分钟，以去除未结合的染料。
- 将细胞在 500 × g 离心 5 分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于新鲜预热的完全培养基 R10 中，培养基中补充抗 CD28 抗体（终浓度：1 µg/mL）和 IL-2（终浓度：10 ng/mL）。
- 将 250 µL 细胞悬液（含 6 × 105 个细胞）加入已包被的 96 孔板的每孔中。
- 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，最长培养 48 小时。
4. 通过流式细胞术检测 CTV
- 在6、36和48小时将细胞收集至96孔圆底板中。于500 × g离心 × g 5 分钟，然后用流式细胞术染色缓冲液洗涤两次。
- 用于表面染色，将细胞与 50 µL 含抗CD8抗体、可固定活力染料和抗CD44抗体的抗体混合物，冰上孵育30分钟 在暗处。
注意：将所有含有荧光染料标记抗体的上清液收集至指定的废液容器中，容器内需添加0.5%次氯酸钠以进行去污处理，并根据机构的生物危害废物处理规程予以丢弃。 - 用流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞两次，重悬于 200 µL 流式细胞仪检测用染色缓冲液
- 使用配备三根激光器的流式细胞仪获取样本。利用染色细胞制备单色对照管，以设定补偿参数。
- 应用以下设门策略：通过前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）设门排除碎片，通过单细胞设门去除双联体，并选择活细胞（可固定活力染料阴性）CD8+ 用于分析的T细胞
- 至少收集1 × 104 门控 CD8+ 每份样本的T细胞事件数。使用流式细胞术分析软件，通过增殖分析模块计算经历一次或多次分裂的细胞比例。
5. 活化与信号通路相关表面及胞内染色
- 将另一份 naive CD8+ T 细胞重悬于 R10 培养基中，添加终浓度为 1 µg/mL 的抗 CD28 抗体和 10 ng/mL 的 IL-2，细胞密度为 2.4 × 106 个细胞/mL。
- 向每孔预包被的 96 孔板中加入 250 µL 细胞悬液（含 6 × 105 个细胞）。
- 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，最长不超过 48 小时。
- 在指定时间点（6、10、12、24 和 36 小时），将细胞收集至 96 孔圆底板中。
注意：6 小时用于检测早期 TCR 信号（磷酸化 S6）和 CD69 表达；CD69 的表达还将在 12、24 和 36 小时进一步检测以完整反映其动力学变化。CD25、PD-1 和 ICOS 在 10、12、24 和 36 小时进行监测；48 小时时间点保留用于增殖检测（第 4 节）和细胞因子检测（第 6 节）。 - 以 500 × g 离心 1 分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于 200 µL 流式细胞术染色缓冲液中。
- 以 500 × g 离心 1 分钟，吸除上清，用 200 µL 流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞两次。
- 进行表面染色时，将细胞与含抗 CD69、抗 CD25、抗 CD8、抗 PD-1、抗 ICOS 抗体及可固定活死染料的抗体混合液（50 µL）在冰上避光孵育 30 分钟。
- 用流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞三次，以去除未结合的抗体。
- 将细胞沉淀重悬于 200 µL 1% 多聚甲醛中，在室温避光固定 15 分钟。
注意：所有涉及多聚甲醛的操作均须在通风橱中进行，以防吸入蒸气。所有含固定剂的液体废弃物应收集于标有“危险化学品处置”的专用容器中。 - 以 500 × g 离心 1 分钟，用流式细胞术染色缓冲液洗涤一次。
- 将 5 × 溶解/固定缓冲液在室温预热，并用去离子水稀释成 1 × 工作液。
- 向每孔加入 200 µL 1 × 溶解/固定工作液，在室温避光孵育 30 分钟。
- 用 1 × 穿膜/洗涤缓冲液洗涤两次，用于磷酸化表位染色。将细胞沉淀重悬于 1 × 穿膜/洗涤缓冲液中，室温避光孵育 10 分钟。
- 以 500 × g 离心 1 分钟，弃去上清。
- 进行胞内染色时，将细胞与含抗 p-S6 抗体的抗体混合液（50 µL）在室温避光孵育 60 分钟。
- 用 1 × 穿膜/洗涤缓冲液洗涤细胞三次，用于磷酸化表位染色。
- 进行二抗染色时，将细胞与含抗兔二抗的抗体混合液（50 µL）在冰上避光孵育 30 分钟。
- 用 1 × 穿膜/洗涤缓冲液洗涤三次，用于磷酸化表位染色，再用流式细胞术染色缓冲液洗涤一次。
- 将细胞沉淀重悬于 200 µL 流式细胞术染色缓冲液中，并使用同一台流式细胞仪获取数据。
- 采用第 4.5 节所述相同的设门策略，每样本至少采集 1 × 104 个 CD8+ T 细胞。
- 使用流式细胞术分析软件分析各标志物的中位荧光强度（MFI）。
6. 细胞内细胞因子阻断与检测
- 收获前5小时，每孔加入100 µL新鲜R10培养基，其中添加PMA（50 ng/mL）、离子霉素（1 µg/mL）、蛋白转运抑制剂（莫能菌素）（1:1000）和基于布雷菲德菌素A的蛋白转运抑制剂（1:1000）。轻轻混匀后将培养板放回37 °C培养箱，以阻断细胞因子分泌并促进其在细胞内积累。
- 在预定时间点，将细胞收集至96孔圆底板中。
- 以500 × g离心1分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于200 µL流式细胞术染色缓冲液中。
- 以500 × g离心1分钟，吸除上清，用200 µL流式细胞术染色缓冲液洗涤两次。
- 进行表面标志物染色时，将细胞与含抗CD44、抗CD8抗体及可固定活力染料的50 µL抗体混合液在冰上避光孵育30分钟。
- 用流式细胞术染色缓冲液洗涤三次，以去除未结合的抗体。
- 加入200 µL固定和透化溶液，冰上避光孵育30分钟，以透化细胞。
注意：所有涉及含甲醛的固定/透化溶液的操作均应在通风橱中进行，以防吸入蒸气。所有含固定剂的液体废弃物应收集于标有“危险化学品废弃物”的专用容器中。 - 以500 × g离心1分钟，将上清弃入危险化学品废弃物容器中。
- 用1 × 透化/洗涤缓冲液洗涤细胞三次。
- 进行细胞内细胞因子染色时，加入含抗TNF-α和抗颗粒酶B抗体的50 µL抗体混合液，在冰上避光孵育30分钟。
- 用1 × 透化/洗涤缓冲液洗涤细胞三次，以去除未结合的抗体，最后再用流式细胞术染色缓冲液洗涤一次。
- 将细胞沉淀重悬于200 µL流式细胞术染色缓冲液中，并在同一台流式细胞仪上获取数据。
- 采用与第4.5节所述相同的设门策略，每样本至少采集1 × 104个CD8+ T细胞。使用流式细胞术分析软件分析各标志物的阳性百分比和MFI值。
结果
为研究不同强度的抗CD3刺激对T细胞活化的影响，我们分离了小鼠脾细胞并纯化CD8+ T细胞进行体外培养，随后开展T细胞活化实验及流式细胞术分析。数据分析时，首先通过FSC-A与SSC-A圈选淋巴细胞，接着利用FSC-H与FSC-W圈选单细胞，再通过SSC-H与SSC-W进一步确认。随后使用CD8抗体与可固定的活细胞染料共同标记，圈选活的CD8+ T细胞用于后续分析（图1A）。
为了验证包被于培养板上的抗体刺激系统能否有效激活T细胞，我们检测了核糖体蛋白S6的磷酸化水平（p-S6）。p-S6是mTORC1活性的一个经典下游指标，同时也是TCR信号通路下游PI3K-mTOR和MEK-ERK MAPK通路的交汇点15,16。与上述研究结果一致，我们观察到在刺激后6小时，随着抗CD3抗体浓度（0.1–10 µg/mL）的增加，p-S6水平呈剂量依赖性上升（图1B），表明包被于培养板上的抗CD3抗体系统能够以信号强度依赖的方式激活TCR-mTORC1-S6信号轴。这一早期磷酸化事件提示mTORC1依赖的代谢通路被启动，从而支持后续T细胞的增殖和效应分化。
通过CTV稀释流式细胞术评估细胞增殖，T细胞受体（TCR）经梯度浓度抗CD3抗体（0.1–10 µg/mL）刺激后，在刺激后6、36和48小时三个时间点进行检测。在早期6小时信号时间点，所有刺激条件下均仅观察到极轻微的增殖稀释现象。至36小时，低剂量刺激组（0.1 µg/mL）仍未诱导出明显的克隆扩增，而中、高剂量组（5和10 µg/mL）则呈现出清晰可辨的CTV稀释峰，表明细胞周期进程已启动。在48小时时间点，不同刺激浓度下的增殖表型差异最为显著。弱TCR刺激（0.1 µg/mL）仅产生1.25%的增殖细胞，并呈现单一未稀释的CTV峰，提示激活不足。中等强度刺激（1–5 µg/mL）诱导出三个清晰的分裂峰，增殖细胞比例从70.8%上升至84.0%。强刺激（10 µg/mL）达到最高的增殖细胞比例（89.5%），显示出最多的分裂代数，并可检测到增殖饱和现象（图2）。
接下来，我们检测了早期活化标志物 CD69 和 CD25 的表达。值得注意的是，本研究揭示了 CD69 表达呈快速且剂量依赖性的上调，该结果基于中位荧光强度（MFI）分析。在中等和强刺激条件下（5 和 10 µg/mL），CD69 在刺激 24 小时后迅速升高，随后在 24 至 36 小时之间逐渐下降。然而，在弱刺激条件下（0.1、0.5 和 1 µg/mL），CD69 在整个刺激时间段内呈持续上升趋势。上述 CD69 的动力学表达模式与其作为早期 T 细胞活化标志物的功能一致（图 3A）17。有趣的是，我们观察到 CD25 的表达呈现剂量和时间依赖性的逐步升高（图 3B）。与既往研究一致，CD25 的上调速度较 CD69 更慢，尤其是在最佳刺激条件下18,19。
为了进一步研究TCR刺激强度对CD8+ T细胞中抑制性受体和共刺激分子表达的调控作用，我们检测了PD-1和ICOS的表达水平。PD-1的诱导性表达依赖于高强度的TCR刺激。在低强度刺激组（0.5–1 µg/mL）中，PD-1在整个刺激期间均维持在低水平表达。相比之下，在中高强度刺激组（5–10 µg/mL）中，PD-1的表达从10小时开始逐渐上升，并在36小时达到峰值（图4A）。ICOS的表达也随刺激强度的增加而相应升高，并在5–10 µg/mL刺激条件下于36小时达到最高水平（图4B）。这些结果表明，高强度TCR刺激可显著上调PD-1和ICOS的表达水平。
最后，我们在刺激后24小时和48小时，通过PMA和离子霉素再次刺激，检测了T细胞的功能能力。在24小时时，我们定量分析了TNF-α和颗粒酶B的产生，观察到TNF-α的阳性细胞频率+颗粒酶 B+，以及 TNF-α+颗粒酶B+ 细胞逐渐以抗CD3剂量依赖性方式升高（图 5A, B）。一致地，TNF-α 和颗粒酶 B 的平均荧光强度（MFI）也呈浓度依赖性升高，并在高强度刺激下达到最大值（10 µg/mL) (图 5C），反映出由梯度 TCR 信号强度驱动的剂量依赖性早期效应细胞分化。然而在 48 小时，这一模式显著逆转。较高浓度的抗 CD3 显著降低了 TNF-α 阳性细胞的比例+颗粒酶B+ 细胞，并下调了每个细胞上效应分子的表达水平。
所示所有数据均代表3次独立实验的结果。统计分析采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验；数据以均值±标准误（SEM）表示。细胞活力 consistently 超过90%，每样本至少获取1 × 104个活的CD8+ T细胞事件。
图 1： CD8+ T 细胞的体外激活及流式细胞术分析。（A）从小鼠脾细胞中分离的纯化 CD8+ T 细胞，在体外用不同浓度的抗-CD3 抗体（0.1–10 µg/mL）联合固定浓度的抗-CD28 抗体（1 µg/mL）刺激 6 至 48 小时，随后进行细胞活化状态的流式细胞术分析。通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设门排除细胞碎片，通过单细胞设门排除双联体，最终选取可固定活力染料阴性且 CD8+ 的 T 细胞用于后续分析。（B）在给予指定浓度抗-CD3 抗体（0.1–10 µg/mL）联合恒定浓度抗-CD28 抗体（1 µg/mL）刺激后 6 小时，CD8+ T 细胞中核糖体蛋白 S6 的磷酸化（p-S6）情况。代表性直方图（左）和 MFI 汇总图（右）。流式细胞术图示数据代表 3 次独立实验。数据以均值 ± 标准误表示。统计学分析：采用 Tukey 事后检验的重复测量单因素方差分析。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001；ns，无显著性差异。请点击此处查看此图的高清版本。
图2：基于紫罗兰增殖示踪染料（CTV）的小鼠原代CD8+ T细胞在梯度TCR刺激下的增殖分析。 使用CTV标记CD8+ T细胞，并在体外用抗CD3抗体以0.1–10 µg/mL的梯度浓度刺激6至48小时。通过流式细胞术分析CD8+ T细胞中CTV荧光的稀释与减弱程度来评估细胞增殖情况。直方图显示了各浓度组的CTV荧光分布，其中标注了经历一次或多次分裂的细胞百分比。流式细胞术图代表3次独立实验的结果。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：抗CD3刺激后CD8+ T细胞早期活化标志物CD69和CD25的表达动力学。 初始CD8+ T细胞用不同浓度（0.1–10 µg/mL）的板结合抗CD3抗体及恒定浓度的抗CD28抗体（1 µg/mL）进行刺激。CD69在刺激后6、12、24和36小时检测，CD25在10、12、24和36小时检测，并通过流式细胞术分析。左侧面板显示各时间点的代表性直方图；右侧面板显示MFI随时间的动态变化。（A）CD69。（B）CD25。流式细胞术图代表3次独立实验的结果。数据以均值±标准误表示。统计学分析：采用Tukey多重比较校正的重复测量双因素方差分析。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001；ns，无显著性差异。请点击此处查看本图的放大版本。
图4： 抗CD3刺激后CD8+ T细胞上抑制性受体PD-1和共刺激分子ICOS的表达动力学。 初始CD8+ T细胞以指定浓度（0.1–10 µg/mL）的包被板抗CD3抗体刺激，并加入恒定浓度的抗CD28抗体（1 µg/mL）。在刺激后10、12、24和36小时收集细胞，并通过流式细胞术进行分析。左侧面板显示指定时间点的代表性直方图；右侧面板展示MFI随时间的动态变化。（A）PD-1。（B）ICOS。流式细胞术图代表3次独立实验的结果。数据表示为均值±标准误。统计分析：采用Tukey多重比较检验的重复测量双因素ANOVA。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001；ns，无显著性差异。请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：CD8+ T 细胞的细胞内细胞因子产生依赖于 TCR 信号强度。 初始 CD8+ T 细胞使用不同浓度的抗 CD3 抗体（0.1–10 µg/mL）以及恒定浓度的抗 CD28 抗体（1 µg/mL）进行刺激。刺激后 24 小时和 48 小时，在 PMA 和离子霉素存在下，细胞与蛋白转运抑制剂（莫能菌素和布雷菲德菌素 A）共同孵育 5 小时，以阻断细胞因子分泌并促进其在细胞内积累，随后收集细胞进行分析。(A) 等高线图显示在各指定浓度和时间点下 TNF-α 阳性和颗粒酶 B 阳性细胞的比例。未刺激细胞作为阴性对照。(B) TNF-α+、颗粒酶 B+ 以及 TNF-α+ 颗粒酶 B+ 细胞的比例。(C) TNF-α 和颗粒酶 B 的平均荧光强度（MFI）。流式细胞术图代表 3 次独立实验的结果。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。统计学分析：采用 Tukey 事后检验的重复测量双因素方差分析。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001；ns，无显著性差异。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本方案提供了一种系统且可重复的研究T细胞受体（TCR）信号强度依赖性T细胞应答的方法。通过梯度包被抗CD3抗体的策略，可精确控制刺激强度，使研究人员能够解析TCR输入信号与下游功能效应之间的定量关系。关键操作步骤包括初始CD8⁺ T细胞的纯化、抗CD3抗体包被浓度的精确梯度控制，以及每孔细胞数量的严格标准化。为确保不同实验间数据的可比性，我们还建议尽可能使用一致的仪器设置、补偿矩阵和设门策略，并采用相同批次的抗体和可固定的活率染料。这些关键步骤的可靠性直接决定了实验结果能否准确反映不同TCR刺激强度对T细胞表型动态的影响。
在本实验方案中，我们采用了平板包被抗体刺激法，即将抗CD3抗体直接包被于培养板表面，以交联TCR-CD3复合物。该方法具有成本低、抗体分布均匀、孔间差异小以及良好的可重复性等优点。值得注意的是，通过滴定包被抗体的浓度，可实现对刺激强度的精确梯度调控，这一特点使其区别于磁珠偶联刺激法——后者通常将配体密度固定在饱和水平，难以实现精细的信号调节14。然而，平板包被刺激产生的TCR交联具有超生理性和持续性，本质上不同于抗原呈递细胞表面肽-MHC复合物所诱导的短暂且亲和力依赖性的相互作用。尽管基于pMHC的刺激更接近生理状态，但其技术要求高，需要多聚体生产的专门技术，且成本显著更高。在细胞分离方面，我们采用了阴性免疫磁珠分选法，该方法操作简便、快速且经济。尽管其纯度低于流式细胞分选（FACS），但避免了机械应力和荧光标记可能对分选细胞生理状态造成的干扰20,21。
在方案执行过程中可能出现的关键问题包括分选纯度低、增殖能力弱、CTV诱导的细胞毒性、培养后存活率差以及染色不一致。针对纯度低的问题，应确保细胞与生物素化抗体混合液及链霉亲和素包被磁珠充分混匀，必要时延长磁分离时间，并针对每批新试剂优化磁珠与抗体的比例。若即使在最高浓度抗CD3抗体条件下仍观察到增殖极少，需验证分离所得初始T细胞的存活率和纯度（尤其是是否存在CD44hi污染），确认抗CD3包被操作步骤（在4 °C过夜孵育期间使用封板膜密封培养板，并确保抗体覆盖均匀），并验证IL-2浓度，因为该细胞因子对支持T细胞扩增至关重要。对于CTV诱导的细胞毒性，可在保持分裂峰清晰分辨的前提下降低染色浓度，并严格在冰上完成完整的5分钟淬灭步骤，以去除残留的游离染料22,23。若培养后细胞存活率差，应控制细胞密度，保证足够的培养基体积，并维持无菌操作技术。若出现染色不一致或流式细胞术数据变异性高，建议将抗体混合液配制成母液，所有染色样本均避光保存，并在重复实验中使用同一批次的抗体和可固定的活率染料。
然而，本方案存在一定的局限性。作为一种体外系统，它无法重现次级淋巴器官中复杂的组织微环境、细胞间相互作用或细胞因子环境。培养时间窗口仅限于48小时，限制了对早期活化事件的分析，无法评估晚期分化、耗竭或记忆细胞形成过程。此外，该方案高度依赖流式细胞术检测结果，这要求在不同独立实验之间对仪器设置、补偿矩阵和设门策略进行严格的标准化。而且，本方案基于抗CD3/CD28刺激系统所得的结果仅来源于CD8+ T细胞，可能无法直接推广至CD4+ T细胞，因为后者的活化阈值、共刺激需求以及下游分化路径已知存在差异12,24,25。此外，由于共生微生物群的差异，不同小鼠品系中T细胞的基础活化状态可能存在差异，这构成了实验室间变异的潜在来源，在跨研究结果解读时应予以考虑。
本文所述的梯度刺激系统使研究人员能够根据不同读数中观察到的独特反应模式，根据特定的实验目标调整TCR信号强度。这些数据表明，抗CD3浓度和收获时间的选择应依据具体的研究问题而定。对于早期即时激活标志物，CD69的上调在所有浓度下最早可在6–12小时检测到，但其动力学特征存在差异：高浓度（5–10 µg/mL）诱导快速达峰后下降，而低浓度（0.5–1 µg/mL）则引起缓慢且持续的上升。在增殖实验中，低于1 µg/mL的浓度效果不佳，可作为内部阴性对照，而5–10 µg/mL的浓度可在48小时通过CTV稀释清晰检测到显著的克隆扩增。共抑制受体PD-1和共刺激分子ICOS的表达需要高强度刺激（5–10 µg/mL），并在36小时达到峰值，表明研究这些分子时应避免较早时间点或低剂量条件。对于效应功能读数（TNF-α和颗粒酶B），刺激强度与细胞因子产生的关系具有时间依赖性，并呈现独特的双相模式。在24小时，效应分子的产生量随抗CD3浓度升高而增加，较高剂量导致更多的细胞因子输出。然而到48小时，尽管在所有条件下产生细胞因子的细胞绝对数量相比24小时显著升高，剂量-反应关系却发生逆转：较低的刺激浓度（0.5–1 µg/mL）产生的TNF-α⁺ Granzyme B⁺细胞频率相对高于高剂量（5–10 µg/mL）。这种反转提示，持续的强TCR信号虽然促进初始效应细胞分化，但可能相对限制了单个细胞维持细胞因子产生能力，可能反映了激活诱导的耗竭或低反应性的开始。
综上所述，这些实证观察结果使本方案成为一种参考框架，使用户能够根据特定的下游终点预先选择刺激条件，从而提高实验设计的效率和数据的可解释性。除了基础的机制研究外，该系统还可用于优化过继免疫治疗中的T细胞扩增方案，其中对TCR信号强度的精确调控可能有助于引导T细胞向有利的效应或记忆表型分化26,27,28。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家自然科学基金委员会（编号：T2394504，LY）和叶丽林首席科学家科研启动基金（编号：R2045，LY）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 离心管 | Labgic | CD-002-15A | 无菌 15 mL 圆锥形离心管 |
| 4% 多聚甲醛 | Beyotime | P0099 | 用于染色前固定细胞的 4% 水溶液固定剂 |
| 60 mm 培养皿 | Labgic | 12211 | 60 mm 细胞培养皿 |
| 70 µm 细胞筛 | Labgic | BS-70-CS | 用于制备单细胞悬液的 70 µm 尼龙网筛 |
| 96 孔圆底培养板 | Beyotime | FPT016 | 用于细胞培养和染色的 96 孔圆底板 |
| ACK 裂解缓冲液 | Beyotime | C3702 | 基于氯化铵的红细胞裂解缓冲液 |
| 抗小鼠 CD25 抗体 | Biolegend | 101910 | APC 标记抗小鼠 CD25 抗体，克隆号 3C7，用于流式细胞术 |
| 抗小鼠 CD28 抗体 | Bio X Cell | BE0015-1 | 纯化抗小鼠 CD28 抗体，克隆号 37.51，用于 T 细胞共刺激 |
| 抗小鼠 CD3 抗体 | Bio X Cell | BP0001-1 | 纯化抗小鼠 CD3ε 抗体，克隆号 145-2C11，用于 T 细胞活化 |
| 抗小鼠 CD69 抗体 | BD Biosciences | 553237 | PE 标记抗小鼠 CD69 抗体，用于活化标志物染色 |
| 抗小鼠 CD8 抗体 | Invitrogen | 17-0081-82 | APC 标记抗小鼠 CD8a 抗体，克隆号 53-6.7，用于流式细胞术 |
| 抗小鼠 GZMB 抗体 | Biolegend | 372212 | PerCP/Cyanine5.5 标记抗人/小鼠颗粒酶 B 抗体，克隆号 QA16A02，用于胞内流式细胞术 |
| 抗小鼠 ICOS 抗体 | BD Biosciences | 565886 | BV421 标记抗小鼠 ICOS (CD278) 抗体，用于流式细胞术 |
| 抗小鼠 PD-1 抗体 | Biolegend | 135220 | BV605 标记抗小鼠 PD-1 (CD279) 抗体，克隆号 29F.1A12，用于流式细胞术 |
| 抗小鼠 TNF-α 抗体 | Invitrogen | 46-7321-82 | PerCP-eFluor 710 标记抗小鼠 TNF-α 抗体，克隆号 MP6-XT22，用于胞内流式细胞术 |
| 抗小鼠/人 CD44 抗体 | Biolegend | 103030 | PE/Cyanine7 标记抗小鼠/人 CD44 抗体，克隆号 IM7，用于流式细胞术 |
| 生物素标记抗小鼠 CD11b 抗体 | Biolegend | 101204 | 生物素标记抗小鼠 CD11b 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 CD11c 抗体 | Biolegend | 117304 | 生物素标记抗小鼠 CD11c 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 CD16/32 抗体 | Biolegend | 156604 | 生物素标记抗小鼠 CD16/32 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 CD19 抗体 | Biolegend | 115504 | 生物素标记抗小鼠 CD19 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 CD4 抗体 | Biolegend | 100508 | 生物素标记抗小鼠 CD4 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 CD44 抗体 | Biolegend | 103004 | 生物素标记抗小鼠 CD44 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 CD45R 抗体 | Biolegend | 103204 | 生物素标记抗小鼠 CD45R/B220 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 CD49b 抗体 | Invitrogen | 13-5971-85 | 生物素标记抗小鼠 CD49b 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 F4/80 抗体 | Biolegend | 123106 | 生物素标记抗小鼠 F4/80 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 Ly6G 抗体 | Biolegend | 127604 | 生物素标记抗小鼠 Ly6G 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 NK1.1 抗体 | Biolegend | 108704 | 生物素标记抗小鼠 NK1.1 抗体，用于谱系耗竭 |
| 生物素标记抗小鼠 TER119 抗体 | Biolegend | 116204 | 生物素标记抗小鼠 TER-119 抗体，用于谱系耗竭 |
| C57BL/6 小鼠 | 斯贝福（北京）生物技术有限公司 | N/A | 用于实验的 6–8 周龄雄性小鼠 |
| 二氧化碳 (CO2) 培养箱 | Thermo Fisher | 3120 | 用于哺乳动物细胞培养的加湿 CO2 培养箱 |
| CellTrace Violet 染料 | Invitrogen | C34557 | 用于监测细胞增殖的紫色荧光染料 |
| DMSO | Sigma | D2650 | 二甲基亚砜；用于配制试剂储备液的溶剂 |
| 驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 488 | Invitrogen | A-21206 | Alexa Fluor 488 标记驴抗兔 IgG (H+L) 二抗 |
| D-PBS | VivaCell Biosciences | C3590-0500 | 用于洗涤和试剂配制的杜氏磷酸盐缓冲液 (Dulbecco’s PBS) |
| 胎牛血清 (FBS) | Gibco | C11995500BT | 哺乳动物细胞培养基的血清添加剂 |
| 可固定活力染料 | Invitrogen | 65-0865-14 | 用于流式细胞术中排除死细胞的可固定活力染料 |
| 固定与穿膜溶液 | BD Biosciences | 51-2090KZ | 用于胞内染色的固定与穿膜试剂 |
| 平底 96 孔板 | Labgic | 11510 | 用于细胞培养和刺激实验的 96 孔平底板 |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | LSRFortessa-3 laser | 用于多色荧光检测的三激光流式细胞仪 |
| Golgi Plug | BD Biosciences | 51-2301KZ | 基于布雷菲德林 A 的蛋白质转运抑制剂，用于胞内细胞因子染色 |
| Golgi Stop | BD Biosciences | 51-2092KZ | 基于莫能菌素的蛋白质转运抑制剂，用于胞内细胞因子染色 |
| 离子霉素钙盐 | Sigma | I3909-1ML | 与 PMA 联用的钙离子载体，用于细胞刺激 |
| Perm/Wash 缓冲液 | BD Biosciences | 51-20911KZ | 用于胞内染色的穿膜与洗涤缓冲液 |
| Phosflow 裂解/固定缓冲液 | BD Biosciences | 558049 | 5× 缓冲液，用于同时裂解红细胞并固定白细胞 |
| Phosflow Perm/Wash 缓冲液 I | BD Biosciences | 557885 | 基于甲醇的穿膜缓冲液，用于胞内磷酸化蛋白染色 |
| 磷酸化 S6 核糖体蛋白 (Ser235/236) (D57.2.2E) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 4858S | 兔单克隆抗体，靶向磷酸化 S6 核糖体蛋白 (Ser235/236)，克隆号 D57.2.2E |
| PMA | Sigma | P1585-1MG | 佛波酯 12-十四烷酰-13-乙酸盐；用于体外细胞刺激的激活剂 |
| 重组小鼠白细胞介素-2 | Gibco | 200-02-50UG | 用于 T 细胞培养与扩增的重组小鼠白细胞介素-2 |
| RPMI 1640 | Life-Lab | AC01L064 | 用于哺乳动物细胞培养的 Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基 |
| 链霉亲和素磁珠 | BEAVER | 22307 | 用于基于生物素抗体的细胞耗竭的链霉亲和素包被磁珠 |
| 流式细胞术染色缓冲液 | 未指定 | 未指定 | 流式细胞术染色缓冲液；未提供供应商或配制配方 |
| Parafilm M 实验室封口膜 | Amcor | PM996 | 用于密封培养板、离心管和培养容器的柔性自封实验室膜 |
| 裂解/固定缓冲液 | BD Biosciences | 558049 | 5× 缓冲液，用于同时裂解红细胞并固定白细胞 |
| FlowJo | BD Biosciences | v10.8.1 | 用于流式细胞术数据分析的软件，版本 10.8.1 |
参考文献
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