Tuina对原发性失眠大鼠模型中下丘脑食食素A表达和睡眠行为的影响

摘要

本研究探讨Tuina是否通过行为分析、免疫组织化学和实时定量PCR调控下丘脑食欲蛋白A表达，缓解大鼠模型中的失眠。

摘要

失眠是一种常见的睡眠障碍，会导致白天功能受损和合并症风险增加，显著影响患者的生活质量。目前的治疗方法，主要是认知行为疗法和药物治疗，受限于药物依赖、耐受性和戒断反弹等问题。研究表明，Tuina疗法能够调节神经系统、内分泌系统和免疫系统，而食欲素系统则是调节睡眠-觉醒周期的关键因素。这促使人们探讨Tuina是否通过调节下丘脑食欲素系统来缓解失眠。本方案描述了Tuina干预方法，适用于由改良多平台水环境法诱发的原发性失眠大鼠模型。我们将64只Wistar大鼠随机分为四组：对照组、模型组、Tuina组和食欲蛋白拮抗组。进行了行为评估（开放田野测试、戊巴比妥诱导睡眠测试）， 并通过 实时定量PCR和免疫组化检测下丘脑中Orexin-A的表达。该方案旨在评估Tuina的疗效，并探讨其与食欲素系统相关的潜在机制，为Tuina在睡眠障碍中的应用和机制研究提供参考。

引言

失眠以对睡眠时长或质量不满导致白天功能受损为特征，是一个普遍的全球健康问题，对个人和^{医疗系统造成}重大负担 ^1,2。在中国，失眠的患病率显著高，进一步加剧了其公共卫生影响³.该疾病与认知功能受损、心血管疾病风险增加以及与抑郁症和焦虑等精神疾病高共病率相关 ^4,5。目前的临床治疗主要依赖认知行为疗法和药物治疗，尤其是苯二氮卓类药物和非苯二氮卓类镇静催眠药。然而，其长期应用受药物依赖、耐药性、白天残留反应和戒断症状的限制，凸显了有效的非药物^{替代方法的}必要性。在临床实践中，Tuina特别适合慢性原发性失眠患者寻求非药物干预，尤其是高药物依赖风险的老年人，以及孕妇或^{哺乳期妇女}7。

作为中医外疗的基石，Tuina 在治疗失眠方面展现出独特的^优势。荟萃分析证据表明，Tuina在总有效率（OR = 4.12）、睡眠质量和焦虑抑郁状态方面显著优于单用药物或针灸，安全性较^高。特定的Tuina方案具有明显优势：传统Tuina对痰热型失眠的有效率为89.5%，腹部按摩可将复发率降至14.7%（而传统Tuina为38.2%）¹⁰。三部分Tuina方法将草药治疗效果从80.49%提升至92.68%，同时改善睡眠结构和神经递质谱¹¹。临床研究和系统综述已证实，Tuina能显著改善睡眠质量，降低焦虑和抑郁评分，并调节如5-羟色胺（5-HT）等神经递质的血清水平¹²。其治疗效果被认为是通过神经-内分泌-免疫网络的整体调控来实现的。近期研究越来越多地聚焦于食欲酶系统，这是源自外侧下丘脑的关键神经肽系统，对促进和维持清醒至关重要¹³。食欲素神经元异常过度活跃被认为与失眠的病理生理有关，而对该通路的抑制已被显示出治疗潜力¹⁴。初步证据表明，腹部按摩等操作可以影响睡眠剥夺大鼠大脑中Orexin-A水平¹²，但目前尚缺乏系统性研究，明确Tuina是否通过调节食欲素系统来发挥抗失眠效果。

因此，基于原发性失眠大鼠模型，本研究旨在：（1）通过行为测试评估标准化Tuina干预后睡眠行为的改善;以及（2）通过考察Tuina的作用是否与下丘脑中Orexin-A表达的下调有关，并比较其与食欲酶受体拮抗剂的疗效。本研究旨在为Tuina在治疗失眠中的核心机制提供实验证据。

方案

所有实验程序和动物福利评估均由新疆医科大学动物伦理委员会批准（伦理审批号：IACUC-20020158）。该方案遵循机构关于动物护理和使用的指导方针。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 动物制备

1. 在18–22°C、12小时明暗周期的SPF屏障系统中饲养64只特异性无病原体（SPF）Wistar鼠（体重250克±50克，性别分布均等）。随时提供食物和水。
2. 在适应性喂养1周后，随机将大鼠分为4组（每组n = 16只）：对照组（A组）、模型组（B组）、Tuina组（C组）和拮抗剂（D组）。

2. 建立原发性失眠模型

注意：除A组外，B组、C组和D组的大鼠需接受以下建模程序。

1. 准备一个塑料圆柱形容器（顶部直径：30厘米，高度：40厘米）作为老鼠箱。
2. 在容器底部安装一个圆柱形平台（直径6厘米，高度10厘米）。
3. 向容器中加水，直到水位低于平台表面1厘米。保持水温20°C。
4. 在容器内水平放置一个圆形铁网（直径：25厘米，网格尺寸：1厘米），距离平台15厘米。用细铁丝将网固定在容器边缘。
5. 将饮用水和食物放在铁网上。每天更换水，并清洁和消毒容器。
6. 每个容器在平台上放置一只老鼠，连续8天。

3. 使用戊巴比妥钠协同睡眠测试进行模型评估

1. 戊巴比妥钠溶液是直接加入超纯水制备的。称1.0克粉末，加入100毫升的超纯净水，溶解后以0.22微米过滤，得到1%（10毫克/毫升）溶液。
2. 第9天，向所有大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠溶液，剂量达到诱导睡眠的最低阈值（初步实验确定）。
3. 记录睡眠潜伏期（从注射到首次失去正直反射的时间）和睡眠时长（从失去到恢复正反复的时间）。将1分钟的恢复反射丧失定义为睡眠开始，恢复为睡眠结束。

4. 图伊纳干预

注意：干预从模型评估成功后的第二天开始，连续14天每天进行一次。A组和B组每天在固定框架中接受10分钟的约束。操作员在实验前接受严格培训，以确保力量、频率和节奏的一致性。

1. 对于C组，将大鼠固定在手术台上仰卧。
2. 用左手的五个手指轻柔地固定老鼠的四肢，完全伸展腹部。
3. 用右手做腹部图伊纳：用中指远端指骨的牙髓在观源点（CV4，位于脐下25毫米处）施加力量。保持剩下的四根手指自然伸展。
4. 用肩关节的前侧小圆周运动驱动中指，对腹部进行逆时针方向的平移摩擦。
5. 沿由九尾（CV15，剑突下方5毫米）、观源（CV4）和双侧大麦点（GB26，位于第12^肋骨 自由端与髂嵴上缘之间的中点）形成的闭合圆形路径。
6. 保持平稳、稳定、连续的圆周运动，频率为5–7个周期/分钟。
7. 逆时针操作5分钟，然后顺时针操作5分钟。
8. 确保力道稳定且坚定，老鼠保持冷静，不挣扎。每天进行一次干预，持续14天。

5. 对抗政府

1. 对于D组，每天一次通过胃内盖囊注射MK-4305（10 mg/kg），持续14天。将MK-4305溶解于生理盐水中，制备5毫升溶液。

6. 开放场地测试

1. 干预期结束后，使用黑色立方盒（底部：100厘米×100厘米，高度：40厘米）进行开放田地测试。将地板用灰线划分为25个相等的方格（16条边缘，9条中央）。
2. 把老鼠放到中央方格，开始计时。
3. 使用图像采集系统记录总行进距离、养育次数以及在中心区域停留超过3分钟的时间。
4. 每次测试后，清除粪便，并用75%乙醇清洁地板和内壁。
5. 图像采集系统的运行
   1. 搭建图像采集系统。将一台数字CCD摄像机（分辨率：1280×720像素;帧率：25 fps）垂直安装在空旷场地上方1.5米处。通过USB接口将相机连接到电脑。
   2. 配置追踪软件和分析设置。使用行为视频分析软件进行自动跟踪。跟踪参数设置如下：
      1. 将追踪焦点定义为老鼠的中心点（质心）。
      2. 将帧率设置为25 fps，用于图像采集和分析。
      3. 校准空间分辨率，使每个像素对应基于开放场尺寸和视频分辨率的实际距离1.5毫米。
      4. 将背景减去阈值设为15灰度（范围：0–255），以区分大鼠与背景。
      5. 将最小事件持续时间设置为0.2秒（5帧），以减少噪声引起的误报检测。
      6. 将开放场地几乎划分为5个×5个等面积方格（第1至25区）。将中央区域定义为7、8、9、12、13、14、17、18和19区（中央3×3格，占总面积的36%）。将周边区域定义为剩余的正方形。
   3. 记录以下输出参数：总行进距离（mm）、平均速度（mm/s）、静止时间（s）、移动时间（s）、每个区域停留时间（s）、每个区域移动距离（mm）、进入每个区域的数量以及繁殖次数。手动核对养殖次数。

7. 免疫组织化学灌注

注意：每组使用4只大鼠进行免疫组化。

1. 准备0.9%盐水（预热至37°C）和4%对甲醛溶液（储存于4°C）。
2. 用腹腔内聚氨酯（25%溶液，0.6毫升/100克体重）深度麻醉大鼠。确认踏板、角膜和正直反射丧失。
3. 将老鼠仰卧固定在泡沫板上。通过切开皮肤、筋膜和胸骨，迅速打开胸腔。
4. 轻轻拉开心脏，露出主动脉。将针头穿过左心室顶端进入主动脉，直到针尖在主动脉腔内可见。确保针头、左心室和主动脉水平排列。
5. 用止血产钳夹住主动脉和针头。立即剪断右心房，让血液流出。
6. 灌注150–200毫升预热的0.9%生理盐水（37°C）。成功的灌注表现为肝脏、肠系膜和前肢的白水，以及右心房的清澈液体。
7. 换成冷的4%对甲醛（4°C），并灌注400毫升。快速进行初步灌注，直到全身肌肉颤动和肢体僵硬发生。然后将流量降低到每秒2滴，直到所有固定液灌注完毕。
8. 当大脑看起来颜色较白且坚实时，确认固定成功。

8. 脑解剖

1. 灌注后，斩下老鼠头部，小心地将整个大脑从颅骨中取出。
2. 用剪刀沿着矢状缝切开颅骨。用骨隆格尔剥离顶骨和枕骨。
3. 用铲子轻轻抬起大脑，用细剪刀切断颅神经和视神经。
4. 免疫组化：立即将整个大脑转移到4%的对甲醛中，并在4°C下固定24小时。
5. 实时定量PCR时：用预冷生理盐水冲洗脑表面，用滤纸吸干，冷冻于液氮中5–10分钟，保存温度为–80°C。 所有步骤都必须在冰上完成。

9. 免疫组化染色

1. 将下丘脑组织嵌入石蜡中，并用切片机切开4–5微米厚度的冠状切片。将切片安装在防掉落滑套上，在65°C烘烤1.5–2小时。
2. 用木烯I和II进行脱蜡切片（各10分钟）。通过分级乙醇补充水分：无水乙醇I和II各5分钟，然后是95%、90%、80%、70%乙醇（各5分钟），最后是蒸馏水（5分钟）。
3. 通过将切片置于高压锅沸腾的0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中进行抗原反复。加热直到压力阀升起，然后关闭加热。浸泡10分钟，然后自然冷却至室温。
4. 通过将切片浸入新鲜3%的H₂O₂中，室温下10分钟，使内源性过氧化物酶失活。用PBS洗3×（每次5分钟）。
5. 用免疫组化笔圈状组织。应用兔子抗HCRT/Orexin-A多克隆抗体（稀释比例1：50，每片50微升）。在加湿箱中以4°C孵育一夜。
6. 第二天，在室温下重新加热20分钟。用PBS洗3×（每次5分钟）。
7. 涂抹带有过氧化物酶标记的辣根二级抗体。在室温下孵育20分钟。用PBS洗3×（每次3分钟）。
8. 涂抹带有过氧化物酶标记的辣根链亲生素工作液。在室温下孵育20分钟。用PBS洗3×（每次5分钟）。
9. 制备DAB色原溶液（0.85毫升蒸馏水+各50微升试剂A、B、C）。涂抹切片后，在室温下显影3–10分钟，显微镜下观察。通过浸泡自来水3分钟来阻止反应。
10. 用血液素做反染剂3分钟。用1%盐酸酒精分离1–2秒。蓝色浸泡在自来水中5分钟。
11. 通过蒸馏水（3分钟）、70%、80%、90%、95%乙醇（各3分钟）以及无水乙醇I和II（各5分钟）进行脱水。在二甲苯I和II中清澈（各5分钟）。
12. 涂抹中性香膏和盖层。在37°C下晾干一夜。
13. 使用光学显微镜观察并拍摄切片（40×、100×、200×、400×）。使用ImageJ计数Orexin-A阳性细胞（细胞质中的棕色颗粒沉淀物）。
14. 计算总分（0–12）为染色强度得分（0=负，1=浅黄色，2=浅棕色，3=深棕色）乘以正细胞百分比得分（0=0%，1=1–25%，2=26–50%，3=51–75%，4=76–100%）。定义1–5为低表达，6–12为高表达。

10. Orexin-A mRNA的实时定量PCR

1. 组织解冻后的RNA处理必须在无RNase条件下进行。具体的无RNase要求如下：
   1. 工作环境：使用专门的RNA工作区，该区域已用RNase去污剂擦拭并接受紫外线照射。
   2. 消耗品：使用认证的无RNase离心管和移液器吸头，或者浸泡在0.1% DEPC水中后进行高压灭菌。
   3. 试剂：使用无RNase裂解缓冲液和DEPC处理水。
   4. 操作：整个过程佩戴无粉末手套，频繁更换手套，避免直接接触消耗品内部及样品。
   5. 实验程序
      注意：在RNA提取和逆转录过程中，所有接触RNA或逆转录试剂的消耗品和工具必须无RNase。在PCR扩增阶段，由于cDNA是双链结构，RNase无法降解双链DNA，此阶段的消耗品和工具只需不含DNase及其他可能抑制PCR反应的杂质;无需额外的无RNase治疗。将冷冻的下丘脑组织在液氮下研磨。将50–100毫克的组织粉与1毫升Trizol一起装入管内。搅拌后放在室温下静置15分钟。
2. 加入200微升氯仿，倒置混合后置于室温5分钟。离心机在12,000×克下，4°C下离心15分钟。
3. 将上层水相转移到新的管子上。加入等量异丙醇，混合后在-20°C下静置35分钟。离心机在12,000克×4摄氏度下离心15分钟。 丢弃上清液。
4. 用75%乙醇清洗沉淀物，在4°C下离心12,000×克离心15分钟。 丢弃上清液，重复一次清洗。
5. 在室温下风干沉淀。溶解在无RNase水中。
6. 测量RNA浓度和纯度（A260/A280比值1.8–2.1）。通过1%琼脂糖凝胶电泳（清晰的28S和18S带，弱或缺失5S带）评估完整性。
7. 制备逆转录反应（20微升）：800 ng总RNA，1微升随机引物（0.1 μg/μL），10 μL 2× TS反应混合物，1 μL TransScript RT/RI 酶混合物，1 μL gDNA 去除剂，以及无RNase水体积。
8. 在25°C下孵育10分钟，然后在85°C下孵育5秒，合成第一股cDNA。用无RNase水稀释cDNA 1：1。
9. 制备qPCR反应（10微升）：5微升EvaGreen 2液×qPCR主混合液，0.3微升正向引物（10微米），0.3微升反向引物（10微米），1微升cDNA模板，无RNase水体积。三份运行。
   注：引物：Orexin-A-F：5'-CGCCAGAAGACGTGTTCCT-3';食氧素-A-R：5'-GCCGCTTTCCCAGAGTGAG-3'（产物长88碱基对）;β-肌动蛋白-F：5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
   肌动蛋白β-R：5'-TTTAATGTCACGACGATTTC-3'（产物长150 bp）。
10. 运行qPCR程序：95°C，30秒（变性前）;40个循环，95°C循环5秒（变性），60°C循环30秒（退火/伸展）。
11. 验证放大和熔融曲线。将5微升产品置于2%琼脂糖凝胶上以确认特异性。
12. 使用2^⁻ΔΔCt 法计算相对的Orexin-A mRNA表达，β-肌动蛋白为内控。

11. 统计分析

1. 使用SPSS 26.0进行数据分析。将所有数据表示为均值±标准差。在两组比较时，如果数据分布正态，使用独立样本 t检验 ;否则使用曼-惠特尼U检验。
2. 对于多组比较，对于均匀方差，使用单向方差分析加LSD事后检验，或Tamhane检验用于异质方差。如果数据分布不符合正态分布，则使用Kruskal-Wallis H检验。考虑P<0.05的统计显著性。

结果

表1显示，与A组相比，B组、C组和D组的睡眠潜伏期显著延长，且模型后睡眠持续时间显著缩短，表明原发性失眠大鼠模型已成功建立。表2和表3的发现为Tuina在治疗失眠中的治疗效果提供了初步支持。开放场测试（OFT）是行为神经科学中最经典且常用的范式之一，用于评估啮齿动物的焦虑样行为¹⁵。研究表明，四角区域的偏好是衡量焦虑样行为的敏感指标，在中度到低度焦虑中，它可能比中央区域指标更具辨别力。失眠模型大鼠表现出显著的焦虑样行为和探索行为变化^16,17，而Tuina干预有效缓解了这些大鼠的焦虑样行为。表4和表5以及图1中展示的分子生物学结果进一步表明，Tuina有效地下调了失眠模型大鼠下丘脑中Orexin-A的过度表达。

图1：各组大鼠下丘脑中Orexin-A的免疫组化染色结果（40×， 100×， 200×， 400×）。（A）在大鼠下丘脑组织中观察到食欲素-A阳性神经元，表现为深棕色颗粒信号。染色强度得分为3分，阳性细胞比例为40%（在26%–50%区间，得分2分），总分为6分，属于高表达区间。（B）大鼠下丘脑组织中Orexin-A阳性神经元数量显著增加，阳性细胞分布更密集。染色强度得分为3分（深棕色），阳性细胞比例达到80%（落在76%–100%区间，得分4分），总分为12分，属于高表达区间。（C）大鼠下丘脑组织中食欲素-A阳性神经元数量相较模型组减少。染色强度得分为3分（深棕色），阳性细胞比例为75%（在51%–75%区间，得分3分），总分为9分，属于高表达区间。（D）大鼠下丘脑组织中Orexin-A阳性神经元数量也相较模型组减少。染色强度得分为3分（深棕色），阳性细胞比例为60%（在51%–75%区间，得分3分），总得分为9分，属于高表达区间。 请点击此处查看该图的放大版本。

集团	睡眠潜伏期 / 分钟	睡眠时长 / 分钟
A	4.13 ± 1.80	49.75 ± 38.46
B	6.31 ± 2.80*	22.13 ± 11：41*
C	6.33 ± 2.60*	24.93 ± 14.43*
D	6.53 ± 1.90*	24.73 ± 17.59*

表1：模型组间戊巴比妥钠诱导睡眠测试比较。* 表示 与 对照组相比P<0.05。

集团	抬升频率	静止时间（s）	运动时间（s）	运动距离（m）	中区时间	中心区距离（米）	角落区时间	角区距离（米）	角落区时间	侧向区距离（米）
A	1.875 ± 0.835	76,700 ± 34,324	103.350 ± 34.307	18.318 ± 16.314	8.750 ± 7.718	2.937 ± 5.112	103,000 ± 28,582	6.315 ± 3.893	56.600 ± 27.772	6.705 ± 3.666
B	7.125 ± 5.668	31.513 ± 10.964	148.488 ± 10.964	22.399 ± 9.159	16.275 ± 10.703	3.244 ± 2.991	75.088 ± 21.561	6.578 ± 1.972	85.463 ± 23.374	11.724 ± 4.959
T值	-2.592	3.547	-3.545	-0.617	-1.613	-0.146	2.205	-0.171	-2.249	-2.302
P值	0.035	0.007*	0.007*	0.547	0.129	0.886	0.045*	0.867	0.041*	0.037*

表2：各指标水平在对照组（A）与模型组（B）之间的影响分析。*显示P<0.05，相较于对照组。

集团	抬升频率	静止时间（s）	运动时间（s）	运动距离（m）	中区时间	中心区距离（米）	角落区时间	角区距离（米）	角落区时间	侧向区距离（米）
B	5.875 ± 2.295	29.819 ± 12.871	150.219 ± 12.867	19.165 ± 8.054	24.838 ± 13.068	3.178 ± 2.438	69.075 ± 13,992	5.823 ± 1.422	83.019 ± 15.464	9.878 ± 4.393
C	6.357 ± 0.627	35.993 ± 32.237	144.021 ± 32.246	23.291 ± 4.873	14.321 ± 3.774	3.106 ± 2.214	87.057 ± 12.658 △	8.087 ± 1.496 △	68.943 ± 9.240	10.420 ± 1.225
D	6.667 ± 1.633	30.808 ± 15.389	149.200 ± 15.380	18.584 ± 4.969	27.792 ± 12.460	3.085 ± 1.114	74,600 ± 22,248	5.744 ± 1.291▲	74.192 ± 17.011	9.465 ± 3.380

表3：各指标水平在模型组（B组）、图伊纳组（C）和拮抗剂组（D）之间的影响分析。 ^△P < 0.05 与模型组（B）相比; ^▲P < 0.05，相比图伊纳组（C）。

集团	食欲素-A
A	1.011 ± 0.173
B	10.436 ± 2.512△
C	2.392 ± 0.998▲
D	3.227 ± 1.703▲

表4：下丘脑组织中Orexin-A mRNA表达水平。 ^△P <对照组（A）为0.05; ^▲P < 0.05，与模型组（B）相比。

集团	食欲素-A
	染色强度	阳性细胞百分比	百分比得分	配乐
A	3	40%	2	6
B	3	80%	4	12
C	3	75%	3	9
D	3	60%	3	9

表5：各组大鼠下丘脑中Orexin-A的免疫组化染色评分。染色强度评分标准：0 = 负染色（无色），1 = 浅黄色，2 = 浅棕色，3 = 深棕色。阳性细胞得分标准百分比：0 = 0%，1 = 1%–25%，2 = 26%–50%，3 = 51%–75%，4 = 76%–100%。总分=染色强度得分×百分比得分。总得分1至5者表示表达较低，得分6至12分者表示表达较高。

讨论

本研究旨在评估Tuina在原发性失眠大鼠模型中的疗效，并探讨其与下丘脑食欲素系统相关的潜在机制。目前的研究结果表明，标准化的Tuina方案显著改善了睡眠潜伏期和睡眠时长，缓解了焦虑类行为，并有效下调了下丘脑中Orexin-A在mRNA和蛋白质水平的过度表达。值得注意的是，Tuina的效果与食欲蛋白受体拮抗剂MK-4305相当，表明食欲蛋白系统的调节可能是Tuina缓解失眠的关键机制。

与药物干预相比，Tuina作为非侵入性外部治疗，在安全性、副作用极小和患者依从性方面具有优势^12,18。其对失眠的治疗益处得到了临床证据的支持，显示其改善睡眠质量和心理状态（^18,19）。其机制多方面，涉及下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节、自主神经系统的稳态，以及关键神经递质如5-HT^18,20。结果通过将食欲素系统定位为特定靶点，进一步扩展了这一理解。食欲素神经元是清醒的核心驱动力，其过度兴奋性与睡眠不稳定有关 21,22,23。Tuina后观察到的食欲素A下调似乎与新型失眠药物“双食食点受体拮抗剂”的作用一致，凸显了药理与非药物干预之间可能的趋同路径 ^24,25。

虽然本研究建立在我们此前关于腹部Tuina和食尿素A调节²⁵的研究基础上，但本稿在原始报告基础上进行了重大扩展和方法学的改进。具体来说，本研究将样本量扩大到64只大鼠以增强统计能力，并引入了包括开放田野测试和戊巴比妥诱导睡眠测试在内的一系列行为评估，系统性评估睡眠结构和类似焦虑的行为，这些在之前的研究中未涉及。与之前重点关注氧化应激和经典神经递质的研究不同，本文优先通过整合行为结果和分子检测对食肉素系统的功能验证，作为独立的机制性研究，补充而非重复前述发现。

实验设计遵循中医理论，聚焦腹部及特定穴位如观源（CV 4），该穴被认为能调节原气和内脏功能，采用闭环操作路径^26,27。参数（频率、持续时间、过程）基于初步工作标准化，以确保一致性和可重复性，这对机制性动物研究至关重要¹²。

然而，该协议存在局限性。首先，干预在建模后单一时间点进行。未来研究应探讨不同的干预时长和频率，以建立Tuina的最佳“剂量-反应”关系。其次，本研究为观察性设计。虽然发现Tuina与Orexin-A表达减少及行为改善之间存在相关性，但目前尚不清楚这种关联是Tuina或其他因素的直接还是间接影响。未来的研究可以利用基因敲除、化成抑制或拮抗剂阻断等实验策略，进一步验证Tuina是否通过调节Orexin-A表达来改善失眠行为，从而阐明其因果机制。最后，本研究未建立假手术或安慰剂干预对照组。然而，本研究在设计时已考虑了这一点，所有动物组都接受了相同水平的抓握和固定操作，在一定程度上控制了非特异性应激因素的影响。此外，本研究中Tuina项目的频率、强度和行动路径基于初步实验进行了标准化，以确保干预的一致性和可重复性。未来的研究应聚焦于开发更严谨的控制方法，如使用非接触模拟或极少触觉刺激，以明确图伊纳手术的具体效果。

该方案成功的关键步骤包括：首先，在修改后的多平台水环境方法中严格控制水温和平台尺寸;第二，实验前对亚阈值戊巴比妥钠剂量进行滴定;第三，标准化Tuina操作参数（频率为每分钟5–7个周期，顺时针再顺时针各5分钟）及操作员培训;第四，将下丘脑组织快速冷冻于液氮中，随后无RNase处理，以确保Orexin-A mRNA的稳定性。

可能的改进包括：首先，开发自动化机械Tuina装置以减少操作者间的变异性;第二，利用脑电图/肌电图遥测替代戊巴比妥钠睡眠测试，实现连续睡眠阶段监测;第三，结合化学遗传或光遗传方法验证食欲蛋白神经元在介导图伊纳效应中的必要性。

该方案的可重复性基于：详细的操作轨迹和参数、采用阳性对照药物、蛋白质和mRNA水平的双维检测，以及严格的统计报告。其实用性体现在以下方面：行为测试设备需求低，无需昂贵的遥测系统;整个实验周期仅8天用于建模，14天用于Tuina干预，完成时间为4周，这与大多数常规研究项目的资助周期和实验室时间表高度契合，便于快速收集数据和方法学验证。此外，Tuina 操作协议通过操作轨迹（CV15 → CV4 →双侧 GB26 →返回 CV15）、频率（5–7 周期/分钟）、方向序列（逆时针后顺时针）和持续时间（每次 10 分钟）等指标进行明确量化。这些规范允许不同操作员在短暂培训后掌握该技术，从而降低因个体差异导致重复性差的风险，这在手动操作研究中很常见。

在实施该协议过程中，可能会出现一些常见问题，建议采取适当的故障排除措施。首先，在修改后的多平台水环境程序中，老鼠可能会从平台上掉落。这通常是由于平台表面过于滑溜所致。解决方法是用细砂纸轻微粗糙平台表面以增加摩擦力。此外，每个容器应只容纳一只老鼠，以避免相互干扰。其次，戊巴比妥钠睡眠测试可能无法在组间显示显著差异。解决方案是在试点实验中，使用另一组动物（每组3–4只）以5 mg/kg为单位重新调整最低亚阈值剂量。注射应每天同一时间进行（最好在上午9：00至11：00之间），以减少昼夜节律的差异。第三，老鼠在Tuina操作过程中可能会挣扎或发出声音，这通常表明过度用力或约束不当。操作者应逐渐减少施加的力量，直到老鼠保持冷静不再挣扎。建议事先使用压力感应假人进行训练，以规范力的施加。大鼠应仰卧，四肢轻柔但稳固地固定，确保腹部完全暴露。第四，同一实验组中食欲素A阳性细胞比例的较大变异性通常源于下丘脑切面不一致、主观计数偏差或染色批次间差异。推荐的解决方案是通过参考大鼠脑图谱（如Paxinos & Watson）来标准化解剖层面，采集从bregma –1.8毫米到–3.3毫米的冠状切片进行下丘脑分析。两个对群体分配盲的独立观察者应进行细胞计数，并使用平均值。所有针对特定结果指标的样本应在同一批次染色，并鼓励使用ImageJ进行半自动化阈值分析，以减少观察者主观性。

总之，本研究建立了标准化的Tuina干预方案和多层次评估系统，采用原发性失眠模型。它提供了有力证据，表明Tuina能够改善失眠行为，可能通过抑制下丘脑食欲素A过度表达的机制。该方法框架不仅为研究图伊纳的核心机制提供了可重复的范式，也为其他非药物干预的睡眠障碍机制研究提供了参考。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5x All-In-One RT MasterMix	abm	G492	cDNA合成
乙酰胆碱（Ach）	南京建成	A105-1	ELISA试剂
粘附显微镜载玻片	江苏世泰实验器材有限公司	N/A	组织切片装载
琼脂糖	上海三冈生物科技	A811BA0014	凝胶电泳
无水乙醇	天津福裕精细化工有限公司	N/A	组织脱水
抗体稀释液	北京中深生物科技有限公司	ZLI-9029	一抗稀释
篮子	福州麦克斯生物科技有限公司	N/A	载玻片持有器
柠檬酸粉	福州麦克斯生物科技有限公司	MVS-0066	抗原修复缓冲液制备
盖玻片	江苏世泰实验器材有限公司	N/A	显微镜观察
DAB显色试剂盒	福州麦克斯生物科技有限公司	DAB-1031	显色检测
DEPC	上海三冈生物科技	B417BA0001	无RNase处理
多巴胺（DA）	武汉华美生物工程有限公司	CSB-E08660r	ELISA试剂
电泳池	北京六仪仪器厂	DYCZ-21	凝胶电泳
电泳电源	北京六仪仪器厂	DYY-6C	凝胶电泳
EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	qPCR试剂
γ-氨基丁酸（γ-GABA）	AMOKE	AE91068Ra	神经递质ELISA试剂
凝胶成像系统	上海坦能	2500	凝胶记录
H2O2（30%）	天津福裕精细化工有限公司	N/A	内源性过氧化物阻断
苏木精染色液	福州麦克斯生物科技有限公司	CTS-1097	对比染色
高速冷藏离心机	上海力申科学仪器有限公司	Nefuqe 15R	样品离心
组胺（HIS）	南京建成生物工程研究所	EH171-1	ELISA试剂
热风干燥箱	上海精宏实验器材有限公司	DHG系列	干燥样品
IHC染色湿度箱	福州麦克斯生物科技有限公司	BOX-1001	湿度孵化箱
免疫组化染色试剂盒	北京中深生物科技有限公司	SP9000	IHC染色
培养箱	上海精宏实验器材有限公司	DNP-9272	温控孵化
感应炉	广东美的生活电器制造有限公司	C21-RK2101	加热源
微孔板读数仪	Bio-Rad中国	xMark	吸光度测量
显微镜	尼康	E200	显微成像
MK-4305	美伦生物	MB3773	实验试剂
中性巴尔萨木	北京中深生物科技有限公司	ZLI-9555	安装介质
去甲肾上腺素（NA）	南京建成	H096	ELISA试剂
核酸和蛋白质定量器	北京凯奥	K5500	核酸定量
Orexin A	武汉华美生物工程有限公司	CSB-E08860r	ELISA试剂
PCR热循环仪	Bio-Rad（美国）	MyCycler热循环仪	PCR扩增
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	福州麦克斯生物科技有限公司	PBS-0060/0061	洗涤缓冲液
移液器	Eppendorf（德国）	Dragon lab	液体处理
高压锅	浙江速尔股份有限公司	YW20F1	抗原修复
蛋白质定量试剂盒	TransGen Biotech	DQ111-01	BCA蛋白检测试剂盒
兔抗HCRT（Orexin-A）多克隆抗体	上海三冈生物科技	D163595	一抗
实时PCR仪	ABI（热鱼）	QuantStudio 6 Flex	qPCR分析
冰箱	合肥美菱有限公司	BCD-249LCK	样品存储
血清素（5-HT）	武汉华美生物工程有限公司	CSB-E08364r	ELISA试剂
染色罐	通用	N/A	载玻片染色容器
超级免疫组化笔	福州麦克斯生物科技有限公司	PEN-0002	疏水性屏障笔
Trans2K DNA标记物	TransGen Biotech	BM101	DNA梯子
TRIzol试剂	Ambion	15596026	RNA提取
涡旋混合器	海门凯林贝尔实验器材有限公司	GL-88B	实验室混合器
二甲苯	天津福裕精细化工有限公司	N/A	脱石蜡