中国临床队列中非小细胞肺癌m6A阅读蛋白YTHDC2的表达

摘要

本研究通过生物信息学和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）评估YTHDC2在非小细胞肺癌中的表达。尽管数据库分析提示其表达下调并具有预后相关性，但临床验证结果显示无显著差异。研究结果揭示了不一致性，表明其诊断准确性有限，在临床应用前仍需进一步验证。

摘要

非小细胞肺癌（NSCLC）仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一，目前可用于早期诊断和预后的生物标志物十分有限。N6-甲基腺苷（m6A）RNA修饰及其阅读蛋白（如YTHDC2）在基因调控和肿瘤发生中发挥关键作用。本研究旨在通过生物信息学分析和实时定量PCR（qRT-PCR）评估YTHDC2在NSCLC组织中的表达谱，分析YTHDC2与临床病理特征之间的关系，并探讨其在未来研究中的潜在临床和生物学意义。通过分析公共数据库中的基因表达和生存数据以评估其预后准确性。在一项中国临床队列中，我们对NSCLC组织中的YTHDC2表达水平进行了定量，并分析了相应的临床病理特征。公共数据库分析显示，YTHDC2在NSCLC组织中表达下调（p < 0.05），且与患者生存相关，但其预后效能较差（AUC ≈ 0.5）。对19对配对的肿瘤组织及相邻正常组织进行的qRT-PCR分析显示，癌组织与相邻正常组织之间的YTHDC2表达水平无统计学显著差异（p = 0.537）。综上所述，公共数据库分析提示YTHDC2可能在NSCLC中表达下调并具有一定预后意义，但在本研究队列中的独立临床验证并未证实其存在显著差异表达。这些结果凸显了大规模数据集与真实世界临床队列之间存在显著异质性，表明YTHDC2不太可能作为可靠的独立诊断或预后生物标志物，其临床应用可能需要与其他分子标志物联合使用。

引言

非小细胞肺癌（NSCLC）包括鳞状细胞癌和腺癌，是最常见的肺癌类型，也是全球癌症死亡的主要原因之一¹。全球癌症统计数据显示，肺癌是导致癌症死亡的主要病因之一²。尽管在诊断、手术、放疗和分子靶向治疗方面取得了新进展，但由于多数患者在晚期才被首次确诊，且疾病早期常无明显症状，NSCLC 的预后并未得到显著改善³。这凸显了寻找新的生物标志物以用于识别患者、判断预后及评估治疗效果的重要性。

m6A 是真核生物中最早被发现且最丰富的 RNA 修饰形式，已被证实参与调控 RNA 的稳定性、翻译及转录过程⁴。m6A 修饰具有动态性和可逆性，由甲基转移酶（书写蛋白）、去甲基化酶（擦除蛋白）和特异性结合蛋白（阅读蛋白）共同调控⁵。其中，YTHDC2 是一种主要的 m6A 阅读蛋白，可调节 RNA 的稳定性和翻译速率⁶。近期研究表明，YTHDC2 通过抑制细胞增殖与侵袭或诱导细胞死亡，在多种癌症类型的调控中发挥重要作用⁷。研究还揭示了其他 m6A 阅读蛋白（如 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDC1）在肺癌进展、免疫调控及预后中的临床相关性，凸显了在独立患者队列中系统评估各个 m6A 阅读蛋白的重要性^8,9,10。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，YTHDC2 的表达水平显著降低，且与高肿瘤分期、淋巴结转移及患者不良预后相关，提示其可能具有抑癌因子的作用¹¹。体外和体内实验也证实，YTHDC2 的高表达可抑制肺癌细胞的增殖和转移⁷。

本研究通过整合计算分析和qRT-PCR实验验证，探讨了YTHDC2在非小细胞肺癌（NSCLC）中的调控作用。同时研究了YTHDC2表达水平与临床病理特征及患者预后之间的关系。尽管公共数据库提供的越来越多证据表明YTHDC2在NSCLC中存在表达失调，但已发表的研究在YTHDC2失调的程度及其临床意义方面报告的结果不一致，尤其是在亚洲人群中，针对经过充分表征的真实世界临床队列的独立验证仍然有限。此外，大多数先前的研究主要依赖公共转录组数据集或实验模型，较少将生物信息学分析结果与独立的临床验证相结合。本研究通过结合大规模公共转录组分析与中国临床队列中的独立qRT-PCR验证，旨在评估既往研究结果的可重复性，并弥合公共数据库分析与真实世界临床样本之间的转化鸿沟。因此，本研究旨在利用整合的生物信息学分析与临床验证方法，系统评估YTHDC2在NSCLC中的表达情况，并探讨其潜在的生物学和临床意义。我们假设YTHDC2在NSCLC中表达失调，且将生物信息学分析与独立临床验证相结合，相较于单一方法，能够更可靠地评估其诊断和预后价值。

方案

本研究经海南医科大学伦理委员会批准（批准号 HMC1984.24），并遵循《赫尔辛基宣言》（2013年修订版）的规定。

研究对象

本研究纳入了2017年至2024年间在海南省三亚市中心医院确诊的50例肺癌患者，采用《中华医学会肺癌诊疗临床指南（2024年版）》进行分析。CSCO分期（2024年版）与AJCC第8版保持一致，以确保跨研究的可比性，该一致性已在汉族人群队列中得到验证¹²，并由两名独立的肿瘤科医生进行复核以保证结果一致性。患者筛选流程、组织样本可及性、RNA质量评估以及最终纳入qRT-PCR分析的样本情况详见图1。

研究数据

本研究采用生物信息学方法分析非小细胞肺癌（NSCLC）中YTHDC2的表达水平及其与临床病理特征的关系，以探讨其潜在作用机制。生物信息学分析完全基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）公开的RNA测序数据，包括通过GDC数据门户（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载的肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）及相应的正常肺组织样本。下载的数据集包含RNA测序表达数据以及符合条件的TCGA-LUAD和TCGA-LUSC病例的可用临床变量（患者编号、样本编号、年龄、性别、病理分期、生存状态和总生存时间）。缺乏基因表达或生存信息的样本被排除在后续的生存分析和ROC分析之外。本研究所用数据集作为补充文件1提供。生物信息学分析未使用三亚中心医院采集的任何临床标本。GEPIA、Kaplan–Meier Plotter和survivalROC分析的详细步骤见下文“生物信息学分析”部分。完整的生物信息学工作流程，包括数据获取、预处理、基因表达分析、生存分析和ROC分析，总结于图2中。

纳入与排除标准

患者的纳入和排除标准见表1。使用统计功效分析软件进行的效能分析表明，每组至少26例可提供80%的检验效能，以检测中等效应量（d = 0.8，α = 0.05，双侧检验）。尽管肺癌组最初计划纳入50对样本，但在因组织或RNA质量不符合要求而排除部分样本后，最终qRT-PCR分析共包括30个肿瘤组织样本和19个癌旁正常组织样本。样本量的减少反映了实际临床研究中的限制，突显了RNA完整性及组织可获得性在转化研究中的重要性。当比较组样本量为n = 19时，可检测到的最小效应量为d = 1.0（检验效能80%，α = 0.05）。因此，本实验具备足够的检验效能来检测YTHDC2表达的较大差异，但不足以检测小到中等程度的差异。

组织样本与定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）

病理诊断由两位不同的病理学家以双盲方式确定。肿瘤纯度由病理学家评估（>70% 恶性细胞），并通过 ESTIMATE（TCGA）方法确认。邻近的正常组织经过大体解剖以尽量减少间质污染。肺癌的组织学类型包括肺腺癌和鳞状细胞癌，其中肺腺癌26例，鳞状细胞癌4例。50例肺癌患者的临床分期依据《中华医学会肺癌临床诊疗指南（2024年版）》中的分期标准进行。经病理学确认的非小细胞肺癌（NSCLC）标本（n = 50）具有典型的临床分布特征（见表2）。在最初纳入的50例患者中，有30例肿瘤组织样本和19例配对的邻近正常组织样本符合RNA质量标准。由于配对统计分析需要来自同一患者的匹配样本，因此肿瘤组织与邻近正常组织的表达比较基于这19对可用的匹配样本进行。这些临床标本仅用于qRT-PCR实验验证，且独立于用于生物信息学分析的公共TCGA数据集。所选标本在病理确认后立即处理，并在无RNase条件下进行操作，随后提取RNA。该样本子集代表了能够同时获得足够组织量和高质量总RNA（RNA完整性编号，RIN >7.0）的病例。在逆转录前测定总RNA浓度和纯度，仅纳入RNA质量合格（RIN >7.0）的样本用于后续分析。按照制造商说明书，将等量的总RNA逆转录为互补DNA（cDNA），用于定量PCR。该流程确保了所分析基因表达数据的有效性。qRT-PCR实验在实时荧光定量PCR仪上使用基于探针的定量PCR检测方法进行。所有反应均设三个重复，并包括无模板对照，以确保分析的可重复性。PCR扩增程序如下：95°C 预变性/酶活化10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95°C 变性15秒，60°C 退火/延伸60秒。每个扩增循环结束时采集荧光信号。所有试剂和耗材均购自商业供应商（见材料表）。qRT-PCR中使用的引物和探针序列见表3。

生物信息学分析

GEPIA 数据库分析 YTHDC2 基因表达

使用 GEPIA 数据库分析 YTHDC2 在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达。通过网络浏览器访问 GEPIA 网络服务器（http://gepia.cancer-pku.cn/），选择“Expression DIY”模块，输入基因符号 "YTHDC2"，选定 LUAD 和 LUSC 数据集，保留默认的标准化参数，并通过 GEPIA 界面直接生成差异表达箱线图。统计学显著性定义为 p < 0.05。

用于肺癌患者生存分析的Kaplan-Meier绘图仪数据库

本研究利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析了YTHDC2表达水平与肺癌患者预后之间的关系。选择肺癌数据集，输入基因符号"YTHDC2"，采用系统自动选择的最佳截断值选项，并使用默认分析设置生成总生存期和进展后生存期的Kaplan-Meier曲线。Kaplan-Meier Plotter平台根据最优截断值自动将患者分为高表达组和低表达组，并使用平台默认设置计算风险比及其相应的95%置信区间。

在R软件中运行R包绘制ROC曲线

符合条件的TCGA-LUAD和TCGA-LUSC病例的RNA测序表达数据及相应的临床元数据从GDC数据门户下载。下载的数据集通过患者标识符进行合并，并导入R语言进行后续分析。使用survivalROC包生成1年、3年和5年预测时间点的时变ROC曲线，并计算相应的曲线下面积（AUC）值，以评估YTHDC2表达的预后性能。生存ROC分析仅纳入具有可用RNA-seq表达数据和生存信息的TCGA-LUAD和TCGA-LUSC患者。本地临床队列未用于生存预测分析，因为缺乏长期随访数据。

通过qRT-PCR检测组织中YTHDC2的表达

为分析基因表达水平，进行了定量反转录PCR（qRT-PCR）。根据制造商推荐的反应条件，将等体积的cDNA加入每个反应体系中。使用基于探针的定量PCR检测进行扩增，并在每轮扩增循环结束时自动收集荧光数据。简言之，RNA提取过程包括多个步骤：样品制备、脱蜡、去除残留液体、蛋白酶K消化、孵育、离心、DNase处理、加入DNase I以及乙醇沉淀。随后将样品结合至基于二氧化硅的RNA纯化柱上，并在8,000 × g 条件下离心30秒。然后用洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2以及用乙醇稀释的洗涤缓冲液2洗涤柱子，并在13,000 × g 条件下干燥2分钟。通过向柱膜中心加入70 µL无RNase水洗脱RNA，随后在13,000 × g 条件下离心1分钟。每个引物对均产生单一扩增产物，在计算相对基因表达前通过熔解曲线分析予以确认。在样品分析前，使用标准曲线验证了引物扩增效率（90–110%）。熔解曲线分析证实仅存在单一扩增子，且无引物二聚体。相对YTHDC2表达水平采用2^-ΔCt法计算，其中Ct值经内参基因GAPDH归一化处理。由于表达值以归一化表达水平而非相对于校准样品的倍数变化形式呈现，因此结果以2^−ΔCt值表示。选择GAPDH作为看家基因，因其表达变异性最小（CV < 5%），相较于其他候选内参基因（ACTB，CV = 12%；18S rRNA，CV = 18%），符合m6A研究中参考基因的选择标准。

统计分析

采用统计软件进行统计分析，包括图形和图表的绘制。为分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者中YTHDC2基因表达的定量数据和分类数据，使用R软件进行生物信息学分析及ROC曲线的构建。通过ROC曲线和曲线下面积（AUC）评估YTHDC2表达在预测生存预后方面的诊断效能。在基于回归的分析中，如适用，报告效应估计值（比值比）及其相应的95%置信区间。采用Wilcoxon符号秩检验比较配对的肿瘤组织与相邻正常组织样本中YTHDC2的表达水平，而采用Pearson相关性分析评估YTHDC2表达与临床病理特征之间的关联，并报告相关系数（r）及相应的p值。由于qRT-PCR数据来自同一患者的配对肿瘤组织和相邻正常组织样本，且基因表达数据不符合正态分布，因此采用Wilcoxon符号秩检验比较配对组织间YTHDC2的表达水平。该检验不假设数据呈正态分布，常用于分析偏态分布的生物学数据。所有统计检验均为双侧检验，以p <0.05为差异具有统计学意义。在分析前对连续变量进行正态性检验。连续变量根据情况以均值±标准差或中位数（四分位间距）表示。

结果

基于 TCGA 数据库的肿瘤中 YTHDC2 基因表达分析

图3通过使用TCGA数据库中的GDC工具分析不同癌症中YTHDC2的表达水平，展示了非小细胞肺癌与YTHDC2之间的关联。

GEPIA 数据库中非小细胞肺癌 YTHDC2 基因的表达

从GEPIA数据库中对肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）中YTHDC2表达水平的额外筛选中，获得了483例肺腺癌组织样本、347例正常肺组织样本、486例肺鳞状细胞癌组织样本以及338例正常肺组织样本。通过统计分析发现，肺腺癌和肺鳞状细胞癌组织中的YTHDC2表达水平均显著低于正常肺组织（p < 0.05），如图4所示。

基于GEPIA分析YTHDC2在不同病理阶段的表达

利用GEPIA（基因表达谱交互分析）数据库生成分期图，以评估YTHDC2在非小细胞肺癌（NSCLC）不同分期中的差异表达。如图5所示，在非小细胞肺癌的病理分期之间，YTHDC2的表达水平未观察到具有统计学意义的差异（p = 0.644）。

YTHDC2 与肺癌生存的 Kaplan-Meier 分析

采用Kaplan-Meier Plotter数据库对YTHDC2基因进行Kaplan-Meier生存分析。结果显示，YTHDC2高表达患者的总体生存期（OS）显著高于低表达患者（p < 0.05）。如图6A（OS）所示，YTHDC2表达水平较高的肺癌患者预后更好，且该差异具有统计学意义（p < 0.05）。根据图6B（PPS）显示，在疾病进展后生存期（Post-Progression Survival, PPS）数据集中，YTHDC2高表达组的预后优于低表达组，差异同样具有统计学意义（p < 0.05）。

YTHDC2 生存率预测模型

基于TCGA RNA-seq表达数据和生存数据的时变ROC分析显示，YTHDC2表达水平单独用于预测非小细胞肺癌（NSCLC）生存的效能有限，在1年、3年、5年和8年时的AUC值分别为0.50（95% CI：0.38–0.62）、0.51（95% CI：0.39–0.63）、0.52（95% CI：0.40–0.64）和0.52（95% CI：0.39–0.65）（图7）。所有AUC的置信区间均包含0.5，表明其预测性能相当于随机水平。这些结果表明，单独使用YTHDC2表达水平缺乏对生存预测的区分能力，不应被视为独立的预后生物标志物。结合临床病理学变量或多基因特征可能有助于提高预测效能。

通过qRT-PCR检测YTHDC2在癌症与正常组织中的表达

采用qRT-PCR检测了非小细胞肺癌（NSCLC）患者肿瘤组织及其相邻正常组织中YTHDC2基因的表达水平。恶性组织中标准化后的YTHDC2表达量（2^−ΔCt）为3.24 ± 2.34，邻近正常组织中为3.60 ± 1.70。如图8所示，在19对配对的NSCLC肿瘤组织与其匹配的相邻正常组织之间，YTHDC2表达水平无显著差异（p = 0.537）。尽管大型数据集的生物信息学分析提示YTHDC2在NSCLC中显著下调，但本队列的qRT-PCR结果未显示显著差异，这可能反映了队列规模、样本异质性及技术变异所导致的潜在差异。此外，较低的AUC值（0.5）表明YTHDC2单独作为标志物时缺乏诊断或预后准确性。

NSCLC中YTHDC2的表达与临床病理特征

本研究共纳入50例非小细胞肺癌（NSCLC）患者，其中男性32例（64.00%），女性18例（36.00%），平均年龄为63.10 ± 9.85岁，年龄范围为37至86岁。25例患者有吸烟史，25例从未吸烟。病理类型包括9例鳞状细胞癌（18.00%）和41例肺腺癌（82.0%）。根据中国临床肿瘤学会（CSCO）临床分期标准，22例处于III–IV期（44.00%），28例处于I–II期（56.00%）。24例患者无淋巴结转移，26例患者（54.00%）存在淋巴结转移。9例患者肿瘤分化程度差（18.00%），41例患者肿瘤分化良好至中等（82.00%）。

分析了NSCLC组织中临床病理特征与YTHDC2表达水平之间的关联。不同病理亚型之间以及根据淋巴结转移状态分组时，YTHDC2的表达水平存在差异（p < 0.05）。然而，由于仅有4例鳞状细胞癌样本可用，因此对病理亚型的比较应谨慎解读，并视为探索性分析。如图9A,B所示，鳞状细胞癌中YTHDC2的表达水平显著高于肺腺癌，且伴有淋巴结转移的NSCLC组织中YTHDC2表达水平显著高于无淋巴结转移者（5.70 ± 2.53 vs. 3.83 ± 0.91，p = 0.027）。但由于仅纳入了4例鳞状细胞癌样本，病理亚型间的比较需谨慎对待，并应在更大样本队列中进一步验证。淋巴结转移患者中较高的YTHDC2表达可能提示YTHDC2与淋巴结转移状态之间存在潜在关联；然而，鉴于样本量有限，该结果应谨慎解读，并需在更大规模的独立队列中加以验证。年龄、吸烟史、CSCO临床分期及组织学分化程度对YTHDC2表达水平无显著影响（p > 0.05）。更多详细信息见表4、表5及图9。

非小细胞肺癌淋巴结转移的二元逻辑回归分析

与相关性分析结果一致，YTHDC2 表达水平与淋巴结转移显著相关（p < 0.05）。以淋巴结转移为因变量，年龄、性别、吸烟史、肿瘤分期、病理类型、YTHDC2 表达水平和分化程度为自变量，对非小细胞肺癌（NSCLC）患者进行二元 Logistic 回归分析。结果显示，NSCLC 患者中 YTHDC2 表达水平与淋巴结转移显著相关（p = 0.027，OR = 2.286，95% CI：1.101–4.748）。

在一般临床资料中，非小细胞肺癌患者的肿瘤分期与淋巴结转移具有统计学上的显著相关性（p = 0.007，OR = 27，95% CI：2.504–291.186）。然而，年龄、性别、吸烟史、病理类型和分化程度与非小细胞肺癌的淋巴结转移无显著相关性（p > 0.05），如表6所示。

数据可用性： 支持本研究发现的数据集可在 Zenodo 仓库中获取（DOI: 10.5281/zenodo.21409961）。该仓库包含用于生物信息学分析的 TCGA 临床元数据、样本注释、数据获取规范以及分析清单。其他数据可根据合理要求向通讯作者申请获取。

图1：用于qRT-PCR分析的患者筛选与组织纳入流程图。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2。用于评估YTHDC2在非小细胞肺癌中表达水平及预后意义的生物信息学分析工作流程 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：TCGA数据库中YTHDC2基因的表达情况。 利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）通过基因组数据共享中心（Genomic Data Commons, GDC）数据门户获取的RNA测序数据，并通过GEPIA网络平台进行分析，比较了肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）中YTHDC2的表达水平与正常肺组织中的表达水平。数据分析通过GEPIA平台完成。统计学显著性由p值 < 0.05 确定。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：基于GEPIA数据库分析的NSCLC中YTHDC2的差异表达。 利用GEPIA平台整合癌症基因组图谱（TCGA）和基因型-组织表达（GTEx）项目的数据，比较了肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）与正常肺组织中YTHDC2的表达水平。箱线图表示标准化后的基因表达水平。统计学显著性由p值<0.05确定。请点击此处查看该图的高清版本。

图5：利用GEPIA数据库对NSCLC中YTHDC2的分期表达分析。 使用GEPIA平台分析了YTHDC2在非小细胞肺癌（NSCLC）不同病理分期（I–IV期）中的表达水平。分期图展示了基因表达在肿瘤不同分期之间的变化。各分期之间YTHDC2的表达水平未观察到具有统计学意义的差异（p = 0.644）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：NSCLC患者中YTHDC2表达的Kaplan–Meier生存分析（Kaplan–Meier Plotter）。（A）总生存期（OS）：采用Kaplan–Meier Plotter工具提供的最优截断值设置（“自动选择最佳截断值”），将NSCLC患者按YTHDC2高表达（n = 140）和低表达（n = 364）分组，比较其总生存期的Kaplan–Meier生存曲线。使用log-rank检验评估统计学显著性（p = 0.0093）；风险比（HR）= 0.61；95%置信区间（CI）：0.42–0.89。YTHDC2高表达与显著更优的总生存期相关。（B）进展后生存期（PPS）：采用Kaplan–Meier Plotter工具提供的最优截断值设置（“自动选择最佳截断值”），将NSCLC患者按YTHDC2高表达（n = 181）和低表达（n = 296）分组，比较其进展后生存期的Kaplan–Meier生存曲线。使用log-rank检验进行统计学比较（p = 4.2 × 10⁻⁵）；风险比（HR）= 0.63（95%置信区间：0.51–0.79）。YTHDC2高表达与显著更长的进展后生存期相关。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：YTHDC2生存率预测模型。 受试者工作特征（ROC）曲线评估YTHDC2在TCGA-LUAD和TCGA-LUSC患者中对总生存期的预测准确性，所用数据包括可用的RNA-seq表达数据和生存数据，时间点分别为1年、3年、5年和8年。AUC值：1年=0.50，3年=0.51，5年=0.52，8年=0.52。虚线对角线表示随机预测水平（AUC = 0.5）。分析使用R语言中的survival ROC软件包完成。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：通过qRT-PCR检测配对的非小细胞肺癌肿瘤组织及相邻正常组织中YTHDC2的表达水平。 采用2^–ΔCt 法计算YTHDC2的相对表达量，并以GAPDH作为归一化对照。表达值表示归一化后的表达水平，而非相对于校准样本的倍数变化。统计分析基于可进行配对比较的19对匹配肿瘤组织与相邻正常组织样本。数据以单个配对观测值及均值±标准差形式呈现。配对样本间的差异采用Wilcoxon符号秩检验进行分析（p = 0.537）。请点击此处查看该图的放大版本。

图9：YTHDC2表达水平与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关联性。（A）不同病理类型中YTHDC2的表达情况，显示鳞状细胞癌中的表达高于腺癌（p < 0.05）。（B）根据淋巴结转移状态分析YTHDC2的表达，显示有淋巴结转移的患者表达水平高于无转移者（p < 0.05）。（C）不同组织学分化程度中YTHDC2的表达，差异无统计学意义（p = 0.181）。（D）不同CSCO临床分期中YTHDC2的表达，差异亦无统计学意义（p = 0.08）。YTHDC2表达水平通过定量实时PCR（qRT-PCR）检测，并采用2^–ΔCt法计算，以GAPDH为内参进行标准化。数据以均值±标准差（SD）表示。统计学比较采用Wilcoxon秩和检验。*p < 0.05被认为具有统计学显著性。请点击此处查看该图的放大版本。

序号	纳入标准	排除标准
1	年龄 ≥18 岁，性别不限。	诊断为其他恶性肿瘤。
2	根据《中国医学会肺癌临床诊疗指南（2024 年版）》确诊为非小细胞肺癌（NSCLC）。	患有慢性呼吸系统或心血管疾病（如慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病、心力衰竭）。
3	具备完整的临床资料，包括人口学信息、血清肿瘤标志物及增强胸部 CT 影像，并已签署知情同意书。	严重器官功能障碍，包括肾功能不全（eGFR <30 ml/min/1.73m²）或肝硬化。
4	未经治疗的初治患者，未接受过任何针对肿瘤的治疗。	特殊人群，包括妊娠或哺乳期妇女（如适用，需经 β-hCG 检测确认）。
5	具备足够量的肿瘤组织和/或邻近组织样本，适用于分子学分析。	样本质量差，包括组织量不足或 RNA 降解（经病理医生评估确认）。

表1：研究中非小细胞肺癌患者的纳入与排除标准

组织类型	分析的配对样本数 (n)	相对表达量 (均值 ± 标准差)
肿瘤组织	19	3.24 ± 2.34
配对的相邻正常组织	19	3.60 ± 1.70

表2：配对的非小细胞肺癌肿瘤组织及相邻正常组织中YTHDC2的表达。 采用2^–ΔCt法检测YTHDC2的相对表达水平，并以GAPDH为内参进行标准化。数据以均值±标准差（SD）表示。对19对匹配的肿瘤-相邻正常组织样本的统计学比较采用Wilcoxon符号秩检验进行分析（p = 0.537）。

目的基因	引物/探针	序列 (5′→3′)
YTHDC2	正向引物 (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	反向引物 (R)	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	探针 (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	正向引物 (F)	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	反向引物 (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	探针 (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

表3：定量实时PCR（qRT-PCR）所用引物和探针序列。 使用TaqMan化学法检测YTHDC2的表达水平，以内参基因GAPDH作为内部对照。

特征	类别	n	%
病理类型	腺癌	41	82
	鳞状细胞癌	9	18
CSCO 分期	I–II 期	28	56
	III–IV 期	22	44
淋巴结转移	无	24	48
	有	26	52
分化程度	低分化	9	18
	中–高分化	41	82
年龄	≥60 岁	36	72
	<60 岁	14	28
性别	男性	32	64
	女性	18	36
吸烟史	有	25	50
	无	25	50

表4：非小细胞肺癌患者的临床和病理特征。 数据基于总研究人群（n = 50）以数量（n）和百分比（%）表示。

临床病理学特征	组别	n	YTHDC2 表达水平（均值 ± 标准差）	p 值
组织类型	肿瘤组织	30	3.24 ± 2.34	0.537
	癌旁正常组织	19	3.60 ± 1.70
病理类型	腺癌	26	4.13 ± 1.29	0.022*
	鳞状细胞癌	4	7.50 ± 3.41
CSCO 分期	I–II 期	22	4.29 ± 1.94	0.08
	III–IV 期	8	5.05 ± 1.51
淋巴结转移	无	19	3.83 ± 0.91	0.027*
	有	11	5.70 ± 2.53
组织学分化程度	中–高分化	25	4.33 ± 1.90	0.181
	低分化	5	5.18 ± 1.60
年龄	≥60 岁	20	4.62 ± 2.10	0.835
	<60 岁	10	4.16 ± 1.12
吸烟史	有	12	4.62 ± 2.40	0.845
	无	18	4.38 ± 1.40

表5：YTHDC2表达水平与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关联性。 YTHDC2表达水平通过qRT-PCR检测，并采用2^–ΔCt法计算，以GAPDH为内参进行标准化。数据以均值±标准差（SD）表示。组别样本量（n）表示经分析的有效样本数。组间统计学比较采用Wilcoxon秩和检验。*p < 0.05被认为具有统计学显著性。

变量	β	Wald	p值	OR	95% CI
年龄（≥60 vs <60）	0.07	0.01	0.93	1.08	0.20–5.68
性别（女性 vs 男性）	0.53	0.4	0.525	1.7	0.33–8.67
吸烟史（是 vs 否）	0.54	0.46	0.496	1.71	0.36–8.09
肿瘤分期（III–IV vs I–II）	3.3	7.38	0.007*	27	2.50–291.18
分化程度（差 vs 中–高）	–1.29	1.62	0.204	0.28	0.04–2.02
YTHDC2 表达水平	0.83	4.91	0.027*	2.29	1.10–4.75

表6：非小细胞肺癌患者淋巴结转移相关因素的多变量逻辑回归分析。 以淋巴结转移作为因变量进行二元逻辑回归分析。报告比值比（OR）及其95%置信区间（CI）。参考类别：年龄（<60岁）、性别（男性）、吸烟史（无）、肿瘤分期（I–II期）和分化程度（中–高分化）。*p < 0.05 表示差异具有统计学意义。

讨论

YTHDC2 是 YTH 家族中最大的 N6-甲基腺苷（m6A）结合蛋白，因其具有 ATP 依赖性 RNA 解旋酶活性而具有独特性，使其成为 RNA 代谢的关键调控因子¹³。与其他 YTH 家族成员不同，YTHDC2 存在于细胞核和细胞质中，可调控 mRNA 的翻译及 RNA 的稳定性¹⁴。既往实验研究表明，YTHDC2 通过抑制 ADIRF 和 MRPL12 mRNA 的表达，增强细胞凋亡，并减少细胞增殖和转移，从而抑制肺腺癌（LUAD）的进展^15,16。先前的实验研究还表明，YTHDC2 可稳定长链非编码 RNA（如 ZNRD1-AS1），从而抑制 LUAD 的增殖；同时调控经 m6A 修饰的 mRNA（如 CYLD 和 SLC7A11），抑制 NF-κB 信号通路、半胱氨酸摄取和抗氧化过程，促进铁死亡并增强抗肿瘤活性^17,18。

本研究采用整合生物信息学分析与实验验证的方法，探讨了m6A阅读蛋白YTHDC2在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其临床意义。对TCGA和GEPIA数据库的生物信息学分析显示，与正常肺组织相比，NSCLC肿瘤组织中YTHDC2的表达显著下调，且较高的YTHDC2表达水平与更好的总体生存期和进展后生存期相关，提示其可能具有预后价值。然而，本研究队列中利用19对可获得的配对肿瘤组织及癌旁正常组织样本进行的qRT-PCR实验，并未发现YTHDC2在肿瘤组织与癌旁正常组织之间的表达差异具有统计学显著性。这种不一致性凸显了将大规模公共数据集的研究结果转化为独立临床队列时所面临的挑战，也强调了对计算机模拟分析结果需谨慎解读的重要性。明确这些差异背后的原因，对于准确评估YTHDC2作为NSCLC生物标志物和治疗靶点的潜力至关重要。本研究聚焦于YTHDC2，与其在YTH家族阅读蛋白中独特的解旋酶活性相符¹⁹，但近期的泛癌分析表明，该家族其他成员的作用具有情境依赖性。例如，Li等人的研究显示，YTHDF1/2在多数癌症（如LIHC、LUAD）中表达上调，并与不良预后相关，而YTHDC1/2在KIRC和BRCA中则表现出抑瘤效应²⁰。值得注意的是，YTHDF1通过激活Wnt/β-catenin通路发挥促癌作用，而YTHDC2在NSCLC中则具有抗转移功能，这突显了制定亚型特异性生物标志物策略的必要性。与已建立的预后标志物（如PD-L1用于预测免疫治疗反应）相比，结合其他m6A调控因子（如METTL3、YTHDF1）或免疫检查点基因，可能增强YTHDC2的预测能力，泛癌免疫浸润分析已提示了这一可能性。尽管既往研究提示YTHDC2可调控NF-κB/CYLD通路¹²，但本研究受限于缺乏通过免疫组织化学或Western blotting进行的蛋白水平验证，以及功能学验证。未来的研究应结合基因敲低实验与m6A测序技术，以绘制其直接靶标图谱。

既往分析显示，YTHDC2 在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达下调，并与不良预后相关²¹。Kaplan-Meier 分析表明，YTHDC2 表达水平较高的患者生存期更长，但 ROC 曲线分析提示其对生存的预测能力有限²⁰。本研究中的生存 ROC 分析使用了 TCGA 的 RNA-seq 表达数据和生存数据，因为本地区临床队列缺乏长期随访信息。重要的是，本研究中观察到的低 AUC 值（约 0.5）表明，YTHDC2 表达作为独立生物标志物在临床应用中缺乏足够的敏感性和特异性²²。这一局限性与新兴证据一致，即单基因生物标志物通常不足以应对非小细胞肺癌等复杂疾病，临床上需要多组学方法和整合型生物标志物组合以实现有意义的预测性能。在伴有淋巴结转移的 NSCLC 组织中观察到较高的 YTHDC2 表达水平，提示在本队列中 YTHDC2 表达可能与淋巴结转移状态存在关联。尽管在腺癌与鳞状细胞癌之间也观察到 YTHDC2 表达的差异，但该比较应谨慎解读，因为仅有 4 例鳞状细胞癌样本可用于分析，显著限制了该亚组比较的统计效能。在临床分期、分化程度、年龄或吸烟史方面均未观察到显著差异，这可能归因于研究的局限性，包括样本量较小和单中心设计。尽管观察到 YTHDC2 表达降低与淋巴结转移之间的关联提示其在 NSCLC 中可能存在生物学作用，但其较差的判别能力（AUC 约 0.5）以及在 qRT-PCR 中检测结果不一致，使其无法作为独立的临床标志物使用。未来的研究应探讨将 YTHDC2 与其他 m6A 相关蛋白联合应用是否可提高预测价值。

生物信息学分析表明，YTHDC2 在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达水平降低，可能与较好的患者预后相关。尽管在伴有淋巴结转移的患者中也观察到表达降低，且不同病理亚型之间存在差异，但由于样本量有限，特别是鳞状细胞癌的样本量较少，这些亚组分析结果应谨慎解读。然而，我们在临床队列中通过 qRT-PCR 分析未能验证上述发现，这可能反映了队列特征、样本量、技术变异、转录后调控差异或缺乏蛋白水平验证等因素的影响。未来的研究应通过体外和体内实验，进一步探索 YTHDC2 在其他肺癌亚型中的作用机制。此类研究可能有助于进一步阐明 YTHDC2 的生物学功能，并明确其是否可作为多标志物联合策略的一部分具有临床应用价值，而非作为单一生物标志物使用。

局限性

本研究存在若干局限性。这是一项单中心回顾性研究，样本量相对较小，可能限制结果的普适性。使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织可能影响RNA质量和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）的敏感性。此外，仅评估了YTHDC2 mRNA的表达水平，未通过免疫组织化学（IHC）或蛋白质印迹法（Western blotting）进行蛋白水平的验证。由于转录后调控的存在，mRNA表达水平并不一定与蛋白质丰度相关，这可能部分解释了我们的临床发现与公共数据库分析结果之间的差异。本研究还缺乏长期随访数据，亚组分析（如鳞状细胞癌）的统计效能不足。

未来方向

未来的研究应通过体外和体内实验探索YTHDC2在非小细胞肺癌（NSCLC）中的作用机制，以更深入地理解其功能角色。需要开展更大样本量的多中心研究，以验证现有发现并提高结果的普适性。此外，将YTHDC2与其他m6A相关调控因子及临床病理学变量相结合，可能增强其预测和预后价值。有必要开展整合转录组学、蛋白质组学和表观基因组学等多组学方法的研究，以阐明YTHDC2异常调控背后的生物学机制。还应通过免疫组织化学（IHC）或蛋白质印迹法（Western blotting）进行蛋白质水平的验证，以评估mRNA与蛋白质表达之间的一致性。样本处理和验证技术的标准化也将至关重要，以确保研究结果的可重复性及临床应用价值。

结论

本研究通过整合生物信息学分析与临床qRT-PCR验证，对YTHDC2在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达进行了探索性评估。然而，由于其在不同分析平台间检测结果不一致，且诊断准确性有限（AUC≈0.5），目前尚不能将其作为独立的临床生物标志物使用。尽管生物信息学分析提示其可能具有预后意义，但独立的临床验证并未支持其在诊断或预后应用中的可靠性。上述研究结果需谨慎解读，并有待在更大规模的多中心队列中通过蛋白水平检测和功能研究进一步验证，方可考虑其临床应用价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
定制引物和探针	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	定制合成	引物和探针序列见表6
DNase I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	DNase I (HiPure FFPE RNA Kit)	去除基因组DNA污染
ESTIMATE算法	Yoshihara et al.	R软件包（版本1.0.13）	肿瘤纯度评估
FFPE RNA提取试剂盒	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	从FFPE组织中提取RNA
GDC数据门户	美国国家癌症研究所（NCI），美国国立卫生研究院（NIH），美国	https://portal.gdc.cancer.gov	下载TCGA数据集
GEPIA网络服务器	中国北京大学	http://gepia.cancer-pku.cn	基因表达分析
Kaplan–Meier绘图工具	匈牙利塞梅尔维斯大学	https://kmplot.com	生存分析
微量离心机	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5424 R	RNA纯化操作
NanoDrop分光光度计	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	NanoDrop 2000/2000c	RNA定量
基于探针的qPCR预混液	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	定量PCR扩增
R统计软件	维也纳统计计算基金会，奥地利维也纳	版本4.4.1	统计分析和ROC分析
实时PCR系统	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA	CFX Opus 96	定量实时PCR
逆转录试剂盒	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	cDNA合成
RNA纯化柱	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	HiPure Mini Column I	硅胶膜RNA纯化柱
无RNase水	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	RNase-Free Water	RNA洗脱
SPSS统计软件	IBM Corp., Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistics 版本27.0	统计分析
survivalROC软件包	CRAN（R统计计算基金会）	版本1.0.3.1	时间依赖性ROC分析
TCGA数据库	美国国家癌症研究所（NCI），美国国立卫生研究院（NIH），美国	https://portal.gdc.cancer.gov	公共癌症基因组数据库
洗涤缓冲液RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Buffer RW1	RNA纯化洗涤缓冲液
洗涤缓冲液RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Buffer RW2	RNA纯化洗涤缓冲液