本研究通过生物信息学和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）评估YTHDC2在非小细胞肺癌中的表达。尽管数据库分析提示其表达下调并具有预后相关性，但临床验证结果显示无显著差异。研究结果揭示了不一致性，表明其诊断准确性有限，在临床应用前仍需进一步验证。
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本研究通过生物信息学和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）评估YTHDC2在非小细胞肺癌中的表达。尽管数据库分析提示其表达下调并具有预后相关性，但临床验证结果显示无显著差异。研究结果揭示了不一致性，表明其诊断准确性有限，在临床应用前仍需进一步验证。
非小细胞肺癌（NSCLC）仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一，目前可用于早期诊断和预后的生物标志物十分有限。N6-甲基腺苷（m6A）RNA修饰及其阅读蛋白（如YTHDC2）在基因调控和肿瘤发生中发挥关键作用。本研究旨在通过生物信息学分析和实时定量PCR（qRT-PCR）评估YTHDC2在NSCLC组织中的表达谱，分析YTHDC2与临床病理特征之间的关系，并探讨其在未来研究中的潜在临床和生物学意义。通过分析公共数据库中的基因表达和生存数据以评估其预后准确性。在一项中国临床队列中，我们对NSCLC组织中的YTHDC2表达水平进行了定量，并分析了相应的临床病理特征。公共数据库分析显示，YTHDC2在NSCLC组织中表达下调（p < 0.05），且与患者生存相关，但其预后效能较差（AUC ≈ 0.5）。对19对配对的肿瘤组织及相邻正常组织进行的qRT-PCR分析显示，癌组织与相邻正常组织之间的YTHDC2表达水平无统计学显著差异（p = 0.537）。综上所述，公共数据库分析提示YTHDC2可能在NSCLC中表达下调并具有一定预后意义，但在本研究队列中的独立临床验证并未证实其存在显著差异表达。这些结果凸显了大规模数据集与真实世界临床队列之间存在显著异质性，表明YTHDC2不太可能作为可靠的独立诊断或预后生物标志物，其临床应用可能需要与其他分子标志物联合使用。
非小细胞肺癌（NSCLC）包括鳞状细胞癌和腺癌，是最常见的肺癌类型，也是全球癌症死亡的主要原因之一1。全球癌症统计数据显示，肺癌是导致癌症死亡的主要病因之一2。尽管在诊断、手术、放疗和分子靶向治疗方面取得了新进展，但由于多数患者在晚期才被首次确诊，且疾病早期常无明显症状，NSCLC 的预后并未得到显著改善3。这凸显了寻找新的生物标志物以用于识别患者、判断预后及评估治疗效果的重要性。
m6A 是真核生物中最早被发现且最丰富的 RNA 修饰形式，已被证实参与调控 RNA 的稳定性、翻译及转录过程4。m6A 修饰具有动态性和可逆性，由甲基转移酶（书写蛋白）、去甲基化酶（擦除蛋白）和特异性结合蛋白（阅读蛋白）共同调控5。其中，YTHDC2 是一种主要的 m6A 阅读蛋白，可调节 RNA 的稳定性和翻译速率6。近期研究表明，YTHDC2 通过抑制细胞增殖与侵袭或诱导细胞死亡，在多种癌症类型的调控中发挥重要作用7。研究还揭示了其他 m6A 阅读蛋白（如 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDC1）在肺癌进展、免疫调控及预后中的临床相关性，凸显了在独立患者队列中系统评估各个 m6A 阅读蛋白的重要性8,9,10。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，YTHDC2 的表达水平显著降低，且与高肿瘤分期、淋巴结转移及患者不良预后相关，提示其可能具有抑癌因子的作用11。体外和体内实验也证实，YTHDC2 的高表达可抑制肺癌细胞的增殖和转移7。
本研究通过整合计算分析和qRT-PCR实验验证，探讨了YTHDC2在非小细胞肺癌（NSCLC）中的调控作用。同时研究了YTHDC2表达水平与临床病理特征及患者预后之间的关系。尽管公共数据库提供的越来越多证据表明YTHDC2在NSCLC中存在表达失调，但已发表的研究在YTHDC2失调的程度及其临床意义方面报告的结果不一致，尤其是在亚洲人群中，针对经过充分表征的真实世界临床队列的独立验证仍然有限。此外，大多数先前的研究主要依赖公共转录组数据集或实验模型，较少将生物信息学分析结果与独立的临床验证相结合。本研究通过结合大规模公共转录组分析与中国临床队列中的独立qRT-PCR验证，旨在评估既往研究结果的可重复性，并弥合公共数据库分析与真实世界临床样本之间的转化鸿沟。因此，本研究旨在利用整合的生物信息学分析与临床验证方法，系统评估YTHDC2在NSCLC中的表达情况，并探讨其潜在的生物学和临床意义。我们假设YTHDC2在NSCLC中表达失调，且将生物信息学分析与独立临床验证相结合，相较于单一方法，能够更可靠地评估其诊断和预后价值。
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本研究经海南医科大学伦理委员会批准（批准号 HMC1984.24），并遵循《赫尔辛基宣言》（2013年修订版）的规定。
研究对象
本研究纳入了2017年至2024年间在海南省三亚市中心医院确诊的50例肺癌患者，采用《中华医学会肺癌诊疗临床指南（2024年版）》进行分析。CSCO分期（2024年版）与AJCC第8版保持一致，以确保跨研究的可比性，该一致性已在汉族人群队列中得到验证12，并由两名独立的肿瘤科医生进行复核以保证结果一致性。患者筛选流程、组织样本可及性、RNA质量评估以及最终纳入qRT-PCR分析的样本情况详见图1。
研究数据
本研究采用生物信息学方法分析非小细胞肺癌（NSCLC）中YTHDC2的表达水平及其与临床病理特征的关系，以探讨其潜在作用机制。生物信息学分析完全基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）公开的RNA测序数据，包括通过GDC数据门户（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载的肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）及相应的正常肺组织样本。下载的数据集包含RNA测序表达数据以及符合条件的TCGA-LUAD和TCGA-LUSC病例的可用临床变量（患者编号、样本编号、年龄、性别、病理分期、生存状态和总生存时间）。缺乏基因表达或生存信息的样本被排除在后续的生存分析和ROC分析之外。本研究所用数据集作为补充文件1提供。生物信息学分析未使用三亚中心医院采集的任何临床标本。GEPIA、Kaplan–Meier Plotter和survivalROC分析的详细步骤见下文“生物信息学分析”部分。完整的生物信息学工作流程，包括数据获取、预处理、基因表达分析、生存分析和ROC分析，总结于图2中。
纳入与排除标准
患者的纳入和排除标准见表1。使用统计功效分析软件进行的效能分析表明，每组至少26例可提供80%的检验效能，以检测中等效应量（d = 0.8，α = 0.05，双侧检验）。尽管肺癌组最初计划纳入50对样本，但在因组织或RNA质量不符合要求而排除部分样本后，最终qRT-PCR分析共包括30个肿瘤组织样本和19个癌旁正常组织样本。样本量的减少反映了实际临床研究中的限制，突显了RNA完整性及组织可获得性在转化研究中的重要性。当比较组样本量为n = 19时，可检测到的最小效应量为d = 1.0（检验效能80%，α = 0.05）。因此，本实验具备足够的检验效能来检测YTHDC2表达的较大差异，但不足以检测小到中等程度的差异。
组织样本与定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）
病理诊断由两位不同的病理学家以双盲方式确定。肿瘤纯度由病理学家评估（>70% 恶性细胞），并通过 ESTIMATE（TCGA）方法确认。邻近的正常组织经过大体解剖以尽量减少间质污染。肺癌的组织学类型包括肺腺癌和鳞状细胞癌，其中肺腺癌26例，鳞状细胞癌4例。50例肺癌患者的临床分期依据《中华医学会肺癌临床诊疗指南（2024年版）》中的分期标准进行。经病理学确认的非小细胞肺癌（NSCLC）标本（n = 50）具有典型的临床分布特征（见表2）。在最初纳入的50例患者中，有30例肿瘤组织样本和19例配对的邻近正常组织样本符合RNA质量标准。由于配对统计分析需要来自同一患者的匹配样本，因此肿瘤组织与邻近正常组织的表达比较基于这19对可用的匹配样本进行。这些临床标本仅用于qRT-PCR实验验证，且独立于用于生物信息学分析的公共TCGA数据集。所选标本在病理确认后立即处理，并在无RNase条件下进行操作，随后提取RNA。该样本子集代表了能够同时获得足够组织量和高质量总RNA（RNA完整性编号，RIN >7.0）的病例。在逆转录前测定总RNA浓度和纯度，仅纳入RNA质量合格（RIN >7.0）的样本用于后续分析。按照制造商说明书，将等量的总RNA逆转录为互补DNA（cDNA），用于定量PCR。该流程确保了所分析基因表达数据的有效性。qRT-PCR实验在实时荧光定量PCR仪上使用基于探针的定量PCR检测方法进行。所有反应均设三个重复，并包括无模板对照，以确保分析的可重复性。PCR扩增程序如下：95°C 预变性/酶活化10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95°C 变性15秒，60°C 退火/延伸60秒。每个扩增循环结束时采集荧光信号。所有试剂和耗材均购自商业供应商（见材料表）。qRT-PCR中使用的引物和探针序列见表3。
生物信息学分析
GEPIA 数据库分析 YTHDC2 基因表达
使用 GEPIA 数据库分析 YTHDC2 在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达。通过网络浏览器访问 GEPIA 网络服务器（http://gepia.cancer-pku.cn/），选择“Expression DIY”模块，输入基因符号 "YTHDC2"，选定 LUAD 和 LUSC 数据集，保留默认的标准化参数，并通过 GEPIA 界面直接生成差异表达箱线图。统计学显著性定义为 p < 0.05。
用于肺癌患者生存分析的Kaplan-Meier绘图仪数据库
本研究利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析了YTHDC2表达水平与肺癌患者预后之间的关系。选择肺癌数据集，输入基因符号"YTHDC2"，采用系统自动选择的最佳截断值选项，并使用默认分析设置生成总生存期和进展后生存期的Kaplan-Meier曲线。Kaplan-Meier Plotter平台根据最优截断值自动将患者分为高表达组和低表达组，并使用平台默认设置计算风险比及其相应的95%置信区间。
在R软件中运行R包绘制ROC曲线
符合条件的TCGA-LUAD和TCGA-LUSC病例的RNA测序表达数据及相应的临床元数据从GDC数据门户下载。下载的数据集通过患者标识符进行合并，并导入R语言进行后续分析。使用survivalROC包生成1年、3年和5年预测时间点的时变ROC曲线，并计算相应的曲线下面积（AUC）值，以评估YTHDC2表达的预后性能。生存ROC分析仅纳入具有可用RNA-seq表达数据和生存信息的TCGA-LUAD和TCGA-LUSC患者。本地临床队列未用于生存预测分析，因为缺乏长期随访数据。
通过qRT-PCR检测组织中YTHDC2的表达
为分析基因表达水平，进行了定量反转录PCR（qRT-PCR）。根据制造商推荐的反应条件，将等体积的cDNA加入每个反应体系中。使用基于探针的定量PCR检测进行扩增，并在每轮扩增循环结束时自动收集荧光数据。简言之，RNA提取过程包括多个步骤：样品制备、脱蜡、去除残留液体、蛋白酶K消化、孵育、离心、DNase处理、加入DNase I以及乙醇沉淀。随后将样品结合至基于二氧化硅的RNA纯化柱上，并在8,000 × g 条件下离心30秒。然后用洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2以及用乙醇稀释的洗涤缓冲液2洗涤柱子，并在13,000 × g 条件下干燥2分钟。通过向柱膜中心加入70 µL无RNase水洗脱RNA，随后在13,000 × g 条件下离心1分钟。每个引物对均产生单一扩增产物，在计算相对基因表达前通过熔解曲线分析予以确认。在样品分析前，使用标准曲线验证了引物扩增效率（90–110%）。熔解曲线分析证实仅存在单一扩增子，且无引物二聚体。相对YTHDC2表达水平采用2-ΔCt法计算，其中Ct值经内参基因GAPDH归一化处理。由于表达值以归一化表达水平而非相对于校准样品的倍数变化形式呈现，因此结果以2−ΔCt值表示。选择GAPDH作为看家基因，因其表达变异性最小（CV < 5%），相较于其他候选内参基因（ACTB，CV = 12%；18S rRNA，CV = 18%），符合m6A研究中参考基因的选择标准。
统计分析
采用统计软件进行统计分析，包括图形和图表的绘制。为分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者中YTHDC2基因表达的定量数据和分类数据，使用R软件进行生物信息学分析及ROC曲线的构建。通过ROC曲线和曲线下面积（AUC）评估YTHDC2表达在预测生存预后方面的诊断效能。在基于回归的分析中，如适用，报告效应估计值（比值比）及其相应的95%置信区间。采用Wilcoxon符号秩检验比较配对的肿瘤组织与相邻正常组织样本中YTHDC2的表达水平，而采用Pearson相关性分析评估YTHDC2表达与临床病理特征之间的关联，并报告相关系数（r）及相应的p值。由于qRT-PCR数据来自同一患者的配对肿瘤组织和相邻正常组织样本，且基因表达数据不符合正态分布，因此采用Wilcoxon符号秩检验比较配对组织间YTHDC2的表达水平。该检验不假设数据呈正态分布，常用于分析偏态分布的生物学数据。所有统计检验均为双侧检验，以p <0.05为差异具有统计学意义。在分析前对连续变量进行正态性检验。连续变量根据情况以均值±标准差或中位数（四分位间距）表示。
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基于 TCGA 数据库的肿瘤中 YTHDC2 基因表达分析
图3 通过使用TCGA数据库中的GDC工具分析不同癌症中YTHDC2的表达水平，展示了非小细胞肺癌（NSCLC）与YTHDC2之间的关联。
GEPIA数据库中NSCLC中YTHDC2基因的表达
从GEPIA数据库中对肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）中YTHDC2表达水平的额外筛选中，获得了483例肺腺癌组织样本、347例正常肺组织样本、486例肺鳞状细胞癌组织样本以及338例正常肺组织样本。通过统计分析发现，肺腺癌和肺鳞状细胞癌组织中的YTHDC2表达水平均显著低于正常肺组织（p < 0.05），如图4所示。
基于GEPI...
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YTHDC2 是 YTH 家族中最大的 N6-甲基腺苷（m6A）结合蛋白，因其具有 ATP 依赖性 RNA 解旋酶活性而具有独特性，使其成为 RNA 代谢的关键调控因子13。与其他 YTH 家族成员不同，YTHDC2 存在于细胞核和细胞质中，可调控 mRNA 的翻译及 RNA 的稳定性14。既往实验研究表明，YTHDC2 通过抑制 ADIRF 和 MRPL12 mRNA 的表达，增强细胞凋亡，并减少细胞增殖和转移，从而抑制肺腺癌（LUAD）的进展15,16。先前的实验研究还表明，YTHDC2 可稳定长链非编码 RNA（如 ZNRD1-AS1），从而抑制 LUAD 的增殖；同时调控经 m6A 修饰的 mRNA（如 CYLD 和 SLC7A11），抑制 NF-κB 信号通路、半胱氨酸摄取和抗氧化过程，促进铁死亡并增强抗肿瘤活性17,
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作者无相关财务或非财务利益需要披露。
本研究由海南省自然科学基金（编号：821RC735）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 定制引物和探针 | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | 定制合成 | 引物和探针序列见表6 |
| DNase I | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | DNase I (HiPure FFPE RNA Kit) | 去除基因组DNA污染 |
| ESTIMATE算法 | Yoshihara et al. | R软件包（版本1.0.13） | 肿瘤纯度评估 |
| FFPE RNA提取试剂盒 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02) | 从FFPE组织中提取RNA |
| GDC数据门户 | 美国国家癌症研究所（NCI），美国国立卫生研究院（NIH），美国 | https://portal.gdc.cancer.gov | 下载TCGA数据集 |
| GEPIA网络服务器 | 中国北京大学 | http://gepia.cancer-pku.cn | 基因表达分析 |
| Kaplan–Meier绘图工具 | 匈牙利塞梅尔维斯大学 | https://kmplot.com | 生存分析 |
| 微量离心机 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5424 R | RNA纯化操作 |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | NanoDrop 2000/2000c | RNA定量 |
| 基于探针的qPCR预混液 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040) | 定量PCR扩增 |
| R统计软件 | 维也纳统计计算基金会，奥地利维也纳 | 版本4.4.1 | 统计分析和ROC分析 |
| 实时PCR系统 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA | CFX Opus 96 | 定量实时PCR |
| 逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) | cDNA合成 |
| RNA纯化柱 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | HiPure Mini Column I | 硅胶膜RNA纯化柱 |
| 无RNase水 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | RNase-Free Water | RNA洗脱 |
| SPSS统计软件 | IBM Corp., Armonk, NY, USA | IBM SPSS Statistics 版本27.0 | 统计分析 |
| survivalROC软件包 | CRAN（R统计计算基金会） | 版本1.0.3.1 | 时间依赖性ROC分析 |
| TCGA数据库 | 美国国家癌症研究所（NCI），美国国立卫生研究院（NIH），美国 | https://portal.gdc.cancer.gov | 公共癌症基因组数据库 |
| 洗涤缓冲液RW1 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | Buffer RW1 | RNA纯化洗涤缓冲液 |
| 洗涤缓冲液RW2 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | Buffer RW2 | RNA纯化洗涤缓冲液 |
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