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人诱导多能干细胞来源的心形类器官作为评估寡核苷酸递送的模型

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DOI：

10.3791/72013

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2026年8月11日

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案可利用人诱导性多能干细胞生成具有自组织特性的心肌细胞类心脏体，用于在显微镜下评估荧光标记寡核苷酸的摄取情况。

摘要

基于寡核苷酸的治疗药物是一类快速发展的药物，具有治疗心血管疾病的巨大潜力；然而，实现向心肌组织的有效递送仍是目前尚未解决的关键挑战。其中一个主要障碍是缺乏充足且具有生理相关性的高质量人类 体外 能够支持寡核苷酸细胞摄取及细胞内分布定量评估的模型。本文提供了一项详细的分步操作方案，用于从人诱导多能干细胞（iPSCs）生成自组织的三维心肌类器官（cardioids），并将其作为平台用于评估荧光标记寡核苷酸的摄取情况。该方案指导使用者通过在悬浮培养中时序性调控Wnt/β-catenin信号通路，实现iPSCs向中胚层、心脏中胚层及心肌祖细胞阶段的定向心脏分化。在此条件下，细胞可自发自组装形成具有搏动能力且含腔室的三维结构，并表达典型的心肌细胞标志物。所获得的心肌类器官为基于成像的寡核苷酸摄取效率评估提供了可扩展且实验操作性强的平台，有助于推动和优化面向心脏应用的递送策略。

引言

基于寡核苷酸的治疗手段，主要是反义寡核苷酸（ASOs）和小干扰RNA（siRNAs），正迅速成为治疗多种疾病（包括遗传性和获得性疾病）的一种变革性且高度特异性的方法1,2,3。这些治疗方式通过与靶标转录本进行序列特异性结合，可在mRNA水平直接调控基因表达，从而实现对致病基因的基因沉默或剪接校正，而这些靶点通常难以通过传统小分子疗法触及4,5。因此，基于寡核苷酸的基因治疗为针对多种疾病领域（包括心血管疾病6）中的不同致病机制提供了灵活的干预平台。迄今为止，已有多个基于寡核苷酸的治疗药物，包括ASOs、siRNAs和剪接转换剂，获得临床应用批准7。尽管取得了上述进展，但在临床前和临床环境中，其治疗效果仍受限于细胞内递送效率低下8。目前估计，不到1%的内化寡核苷酸能够从内涵体逃逸至胞质，进而与靶RNA结合，从而限制了其功能活性9,10。这一限制在心肌组织中尤为显著，因为该组织中的摄取和细胞内转运过程尚不明确。

历史上，心血管药物的临床前评估在很大程度上依赖动物模型，这些模型在评估药代动力学、生物分布、有效性和安全性方面仍然不可或缺 体内然而，不同物种在心脏生理学、基因调控和细胞反应方面存在重要的差异，这常常限制了它们在准确预测人类治疗效果和毒性方面的能力。这些局限性推动了以人类为基础的研究方法的发展 体外 具有更高生理相关性的模型。其中，人类诱导多能干细胞（iPSC）技术通过提供几乎无限来源的可分化为心血管谱系的细胞，彻底改变了心血管疾病建模领域。由人类iPSC分化而来的心肌细胞（iPSC-CMs）重现了人心肌组织在分子、结构和功能方面的诸多特性，已成为研究疾病机制、药物反应及新兴治疗手段的广泛应用平台11然而，人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）的传统二维培养存在重要局限性。大多数分化方案所获得的心肌细胞在结构、电生理、代谢和收缩特性方面均更类似于胎儿细胞而非成体细胞，表现出未成熟的特征。12.

此外，单层培养缺乏影响心肌细胞在体功能的三维（3D）组织结构、多细胞相互作用以及细胞外基质组成。in vivo 为解决这些挑战，人们已开发出日益复杂的3D心脏模型13。其中，通过将iPSC-CMs嵌入生物材料支架并施加机械和电刺激而构建的工程化心脏组织（EHTs），可促进结构和功能的成熟，同时更接近地再现天然心肌的生物力学环境13。尽管EHTs为疾病建模和药物测试提供了高度生理相关的平台，但其制备通常需要专业的生物工程技术和专用设备。而在另一端，离体（ex vivo）心脏组织切片最忠实地保留了天然组织的结构和细胞组成，但依赖于原代心脏组织的获取，体外培养存活时间有限，且难以大规模扩展。

近年来，心脏类器官作为一种易于获取的三维模型系统应运而生，能够重现心脏组织结构和功能的关键特征14。心体（Cardioids）是一类自组装的心脏类器官，主要由心肌细胞构成，可通过内在的特化、空间模式形成和形态发生过程，发育为具有腔室样结构并包含空腔的组织15,16。心体的构建方法通常依赖于初始激活Wnt信号通路以诱导中胚层特化，随后通过抑制该通路促进心脏谱系的定向分化。心体可在静态或搅拌悬浮培养体系中生成，后者有利于规模化生产并增强组织的自我组织能力15,16,17,18,19。包含内皮细胞、心外膜细胞或其他细胞类型的更复杂的多谱系心脏类器官可进一步提高生理相关性，但需要更复杂的分化方案、更长的培养周期以及大量的优化工作13,14。

本文介绍了一种简单、可重复且高效的方案，用于从人诱导多能干细胞（iPSCs）生成基于心肌细胞的自组织心脏类器官，并将其应用于评估荧光标记寡核苷酸的摄取情况。该方案对于致力于优化寡核苷酸化学修饰及递送策略以用于心血管领域的研究人员具有重要价值。本研究中使用的所有材料均列于材料表中。

方案

1. 诱导多能干细胞分化前的培养与准备

警告：所有细胞和培养基的开放操作均须在经认证的II级生物安全柜中进行。穿戴实验服和手套。使用适当的消毒剂对工作台面和液体废物进行去污染处理。

  1. 维持iPSCs。
    1. 根据制造商说明，使用适当的基底膜基质包被培养板。
    2. 使用成分明确、无饲养层的多能干细胞培养基培养iPSCs，每24小时更换一次培养基。
    3. 保持培养物未达到过度融合状态，当细胞融合度达到70–80%时进行传代。
      ​注意：在启动分化前，应确保iPSCs保持高质量、未分化形态，并经确认无支原体污染。
  2. 分化前传代。
    1. 解冻iPSCs，并在启动心肌分化前至少扩增两代。
    2. 使用与iPSC维持相容的无酶解离方法（如PBS-EDTA）进行细胞传代。
      暂停点：将iPSCs在培养中维持至融合度达到70–80%，且保持典型形态，无自发分化迹象。

2. 在微孔板中制备iPSC聚集体

  1. 将iPSCs解离为单细胞悬液。
    1. 吸除培养基，用1 mL 1× PBS洗涤细胞一次。
    2. 每6孔板孔加入500 µL细胞解离溶液（Accutase），在37 °C孵育5–7分钟。
    3. 每孔加入1.5 mL洗涤培养基，轻柔吹打重悬，形成单细胞悬液。
    4. 将悬液转移至15 mL锥形管中，在室温下以200 × g离心3分钟。
    5. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于添加ROCK抑制剂（终浓度10 µM）的无饲养层iPSC培养基中。
      注意：通过在5分钟时检查细胞解离情况，针对每种iPSC细胞系调整解离孵育时间，必要时以短时间增量延长。
  2. 细胞计数并准备接种密度。
    1. 使用标准细胞计数方法计数活细胞。
    2. 将单细胞悬液调整至0.9 × 106 个细胞/mL，用于800 µm微孔聚集板（24孔格式，约300个微孔/孔）的每孔接种。
      注意：优化每孔接种细胞数量，因为不同iPSC细胞系的聚集体大小或分化效率可能存在差异。
  3. 预润微孔板并去除气泡。
    1. 向每孔加入含ROCK抑制剂（终浓度10 µM）的无饲养层iPSC培养基500 µL。
    2. 将微孔板在室温下以300 × g离心3分钟，以去除微孔中的气泡。
      ​关键步骤：必须完全去除所有气泡，以确保细胞均匀沉降到每个微孔底部，并支持高效聚集体形成。
  4. 将iPSCs接种至微孔中。
    1. 向每孔加入1.0 mL已制备的单细胞悬液（0.9 × 106 个细胞/mL），即每孔接种0.9 × 106 个细胞。
    2. 使用P1000移液器在孔内轻柔吹打3–5次，避免引入气泡。
    3. 将培养板在室温下以200 × g离心3分钟，使细胞沉降至微孔中。
    4. 在将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下培养24小时之前，需在显微镜下确认细胞已沉入微孔中。
      关键步骤：离心后需小心操作培养板，避免振荡或摇晃，以防细胞从微孔中脱离。

3. 在微孔中扩增iPSC聚集体

  1. 小心吸除培养基并更换，注意不要扰动或移出聚集体。
    1. 倾斜培养板，使用 P1000 移液器从每个孔中缓慢吸出约 1.0 mL 培养基，确保聚集体仍停留在微孔中。
    2. 使用 P1000 移液器缓慢吸除剩余的约 500 µL 培养基。
    3. 使用刻度移液器沿孔壁缓慢加入 1.5 mL 无饲养层的 iPSC 培养基。
    4. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，并每日重复更换培养基。
      关键步骤：将培养基沿孔壁加入，避免直接冲到聚集体上。

4. iPSC 细胞聚集体的心脏分化（第 0 天至第 12 天）

  1. 中胚层诱导（第0天）。
    1. 使用步骤3.1.1–3.1.2中所述的轻柔吸液方法去除培养基。
    2. 每孔加入1.5 mL基础培养基，添加2%不含胰岛素的B27补充剂以及Wnt/β-catenin信号通路激活剂（CHIR99021，终浓度：11 µM）。
      注意：配制CHIR99021（一种糖原合成酶激酶-3（GSK-3）的小分子抑制剂）的10 mM储存液。为达到11 µM的终浓度，将1.65 µL储存液加入1.5 mL培养基中。
  2. 诱导后换液（第1天）。
    1. 加入CHIR99021后24小时，轻柔吸去每孔中的培养基。
    2. 每孔加入1.5 mL新鲜基础培养基，添加2%不含胰岛素的B27补充剂，然后继续培养48小时。
      关键步骤：必须严格遵守Wnt信号调控步骤的时间安排，任何偏差均可能影响分化效率。
      注意：在Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理后，部分细胞死亡属正常现象。若观察到大量类器官丢失，建议在后续实验中降低激活剂浓度。
  3. 通过抑制WNT实现心源性定向分化（第3天）。
    1. 将每孔中已使用的培养基各取760 µL转移至无菌50 mL锥形管中，以制备条件培养基。
    2. 向每管含有混合条件培养基的锥形管中加入760 µL新鲜基础培养基（含2%不含胰岛素的B27补充剂），并轻轻混匀。
    3. 向混合后的培养基中加入Wnt信号通路抑制剂IWP4，使其终浓度为5 µM，并轻轻倒置管子数次以充分混匀。
    4. 小心吸去每孔中残留的培养基，然后每孔加入1.5 mL含IWP4的条件培养基。
    5. 在37 °C、5% CO₂条件下培养48小时。
      ​注意：配制Wnt信号通路抑制剂IWP4的1 mM储存液。为达到5 µM的终浓度，每1.52 mL总培养基（760 µL条件培养基 + 760 µL新鲜基础培养基）中加入7.6 µL储存液。
  4. 微孔板中换液（第5天）。
    1. 使用步骤3.1.1–3.1.2中所述的轻柔吸液方法更换培养基。
    2. 每孔加入1.5 mL含2%不含胰岛素的B27补充剂的基础培养基，然后在37 °C、5% CO₂条件下继续培养48小时。
  5. 将类器官从微孔转移至6孔板（第7天）。
    1. 使用步骤3.1.1–3.1.2中所述的轻柔吸液方法，小心吸去每孔中的培养基。
    2. 向微孔板的每孔中加入1.0 mL含2%含胰岛素B27补充剂的基础培养基。使用P1000移液器，在孔表面以环形移动移液枪头的方式，轻柔吹打液体上下五次，使微孔中的类器官脱落并悬浮于液体中。
    3. 将类器官悬浮液转移至一个未经处理的6孔培养板的单个孔中。
    4. 用额外1.0 mL新鲜培养基冲洗微孔板每孔2至3次，以回收残留的类器官，并将每次冲洗液均转移至6孔板的同一孔中。
    5. 在37 °C、5% CO₂条件下培养72小时。
      注意：类器官转移后出现死细胞和细胞碎片属正常现象。大部分碎片将在后续换液过程中被清除。
  6. 悬浮培养期间换液（第10天）。
    1. 轻柔振荡培养板，使松散附着的类器官脱落。
    2. 倾斜培养板，使类器官依靠重力沉降至孔底。
    3. 小心吸去废液，避免扰动或吸走类器官。
    4. 每孔加入2.0 mL新鲜基础培养基，添加2%含胰岛素的B27补充剂，并在37 °C、5% CO₂条件下继续培养48–72小时。
      注意：通常从第10天起可观察到自发性搏动。
      暂停点：通过每2–3天更换一次培养基，可将搏动的心类器官在悬浮培养中维持较长时间以促进其成熟。

5. 类心脏体的显微表征

注意：本方法提供了利用冷冻切片对类心脏体进行组织学表征的工作流程。所获得的切片可用于多种组织学分析，包括苏木精和伊红（H&E）染色以评估整体组织结构，以及免疫荧光标记以鉴定心肌细胞身份。

  1. 固定与冷冻切片。
    1. 将类心脏器官在4%多聚甲醛中于4 °C过夜固定。
      警告：多聚甲醛具有毒性且可能为致癌物；操作时须在化学通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。所有含多聚甲醛的废弃物（固定液及洗涤液）应收集于明确标识的醛类/化学危险废物容器中，并按照机构规定的危险废物处理程序进行处置。
      安全提示：所有多聚甲醛的固定与操作步骤均须在化学通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。
    2. 用PBS洗涤三次，并将固定的类心脏器官在含30%（w/v）蔗糖的PBS中于4 °C过夜冷冻保护。
    3. 将类心脏器官包埋于明胶中，冷冻后在载玻片上切取10 µm厚的冷冻切片。切片储存于−20 °C，待用。
  2. 免疫标记。
    1. 将切片在室温下解冻15分钟。
    2. 在37 °C的PBS中洗涤切片，每次10分钟，共两次。
    3. 使用疏水笔在每张载玻片上圈出感兴趣区域，形成可保留封闭液和抗体溶液的液滴区域。
    4. 在Coplin染色缸中的通透缓冲液（PB；含0.1% Tween-20的PBS）中重新水化切片2–3分钟。
    5. 将载玻片从PB中取出，沥干多余液体，并置于湿盒中。
      关键步骤：自此步骤起，必须避免切片干燥。
    6. 在湿盒中，用200–300 µL含5%胎牛血清（FBS）的PB封闭切片，室温孵育90分钟。
    7. 去除封闭液，加入100 µL用封闭液（含1% FBS的PB）稀释的一抗（抗cMYBP-C；1:50），于4 °C孵育过夜。
    8. 用PB洗涤三次，室温下加入绿色荧光抗小鼠二抗（1:200）、远红荧光鬼笔环肽（1:400）和DAPI（1 µg/mL），孵育2小时。
    9. 用PB洗涤三次，用抗荧光淬灭封片剂封片。
      ​警告：所有含荧光染料的溶液（二抗、鬼笔环肽、DAPI染色液及其相应的洗涤液）应收集于容器中，并根据机构规定作为化学废物进行处置。
  3. 图像采集。
    1. 使用配备阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜，结合10×和63×/1.40油浸物镜，进行超分辨率成像。
    2. 分别使用639 nm、488 nm和405 nm激光线，以4.0%、4.0%和1.0%的激光透射率激发远红荧光团、绿色荧光团和核染料。
    3. 采集单层光学切片，像素尺寸为0.0353 × 0.0353 µm2，单向扫描，扫描速度为6，放大倍数为1.7，线平均次数为1，像素驻留时间为0.935 µs/像素。
    4. 采用自动维纳滤波进行阵列探测器超分辨率图像处理。

6. 荧光寡核苷酸摄取实验

  1. 制备与棕榈酸偶联的荧光标记寡核苷酸储备液，以提高其脂溶性。
    1. 将冻干的荧光标记寡核苷酸用无核酸酶水溶解，配制成终浓度为 1 mM 的溶液。短暂涡旋混匀后，在 3,000 × g 离心 30 秒，使溶液沉至管底。
    2. 将 1 mM 储备液分装为单次使用量，避光保存于 −20 °C。
    3. 实验当天，取 1 µL 的 1 mM 储备液加入 1 mL 心球培养基中，使寡核苷酸终浓度为 1 µM。通过轻轻振荡培养板混匀。
  2. 在无血清培养基中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下，将心球与终浓度为 1 µM 的荧光标记寡核苷酸共同孵育 24 小时。
  3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤心球三次，以去除细胞外的寡核苷酸。
  4. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定心球 20 分钟，PBS 洗涤三次，随后在成像前继续进行荧光标记。
  5. 将完整且已固定的心球置于含 5 µg/mL 与绿色荧光染料偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）和 1 µg/mL DAPI 的 PBS 溶液中，4 °C 避光孵育过夜。用 PBS 洗涤三次后，使用抗荧光淬灭封片剂封片。
    注意：所有含寡核苷酸和荧光染料的培养基及洗涤液，包括步骤 6.2 中的寡核苷酸孵育液以及 WGA/DAPI 染色液，均应收集于单独容器中，并根据机构规定作为化学/生物危害废物处理。
  6. 采集寡核苷酸摄取与分布的共聚焦图像。
    1. 使用配备阵列探测器用于超分辨率成像和 40× 水浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜采集图像。以 2 µm 的 z 轴步长获取共 8 层的 z 轴层扫图像，总成像深度为 16 µm。
    2. 分别使用 405 nm、488 nm 和 639 nm 激光线，以 0.9%、0.2% 和 3.0% 的激光透射率激发细胞核染料、膜标记物和远红荧光标记的寡核苷酸。
    3. 以 0.0449 × 0.0449 × 2 µm3 的体素尺寸、双向扫描、扫描速度 5、线平均 1 和每像素 1.51 µs 的像素驻留时间采集图像。采用自动维纳滤波进行 Airyscan/超分辨率图像处理。
    4. 在整个 z 轴范围及所有样品间保持所有采集参数（激光功率、探测器增益、z 轴步长和体素尺寸）一致，以便在不同条件下对寡核苷酸信号进行有效比较。

结果

图1 总结了分化流程，并展示了从诱导多能干细胞（iPSC）聚集到自组织心形类器官形成的各个阶段预期的典型形态学变化。基于悬浮培养的微孔聚集法为并行生成大量尺寸可控的心形类器官提供了一种简单且标准化的方法。成功的分化表现为形成大小均一的细胞聚集体，随后出现内部腔隙并开始自发搏动，通常从第10天左右开始。这些形态学特征共同构成了评估心形类器官生成效率与可重复性的实用质量控制节点。

可通过冷冻切片的组织学分析来评估心形体的结构和组织形态。如图2所示，成功分化的心形体经苏木精和伊红（H&E）染色后，显示出结构良好的三维组织，包含一个或多个由致密细胞层包围的内部腔室，符合类似心腔的组织特征。成功形成的心形体通常无坏死区域，且结构碎裂极少。相比之下，分化效果不佳时，常产生不规则或塌陷的结构，缺乏可辨识的腔室，提示组织自我组装能力受损。

可通过冷冻切片的免疫荧光染色进一步评估心肌细胞的分化情况。如图3A–B所示，成功形成的心形类器官（cardioids）表现出肌节标志物cMYBP-C的广泛表达，并组织成高度有序、具有周期性条纹结构的典型肌节特征。这些条纹状结构在整个组织中广泛分布，通常沿心肌细胞的长轴方向排列，反映出高效的心脏分化。相比之下，分化不佳的心形类器官则表现出微弱、斑块状或局限于特定区域的肌节染色，常局限于组织周边区域，且存在大片无明显信号的区域，表明心肌细胞分化效率低下。

可通过活细胞成像或固定心形体的共聚焦显微镜观察荧光标记寡核苷酸的摄取情况。如图4所示，成功摄取的特征是细胞内出现明显可检测的寡核苷酸相关荧光，呈离散点状分布，符合内体定位特征。WGA标记细胞膜，DAPI对细胞核进行复染，从而确认寡核苷酸的细胞内定位。除了提供寡核苷酸摄取的定性可视化结果外，所获得的图像堆栈还可用于定量分析，包括每个点状结构的荧光强度、每个细胞的点状结构数量以及寡核苷酸阳性细胞的百分比。如图5A–C所示，Z轴层扫成像可进一步评估寡核苷酸在整个三维组织中的分布情况，从心形体表面至内部多个光学切片中均检测到荧光信号，表明寡核苷酸有效穿透了组织。

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图1：人iPSC来源心形体的生成流程图。将人诱导性多能干细胞（iPSCs）在微孔板中进行聚集（第−2天），并通过时间特异性调控Wnt信号通路实现定向心脏分化。在第0天，于添加了不含胰岛素B27的基礎培养基中使用Wnt通路激活剂CHIR99021处理，启动中胚层诱导；在第1天撤除激活剂。在第3天，使用Wnt通路抑制剂IWP4处理，诱导心脏特化，并于第5天撤除抑制剂。在第7天，将细胞聚集体转移至6孔板中，并在添加了含胰岛素B27的基礎培养基中维持培养。至第14天，形成自组织的心形体，可用于后续实验应用，包括寡核苷酸摄取实验。本图由作者使用Biorender绘制，所需版权许可已附。在指定时间点拍摄的代表性明场图像展示了从大小均一的iPSC聚集体到形成空腔、自组织心形体的预期形态学演变过程。比例尺 = 500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2： 人iPSC来源心形体的组织学表征。 第14天心形体的代表性苏木精和伊红（H&E）染色冷冻切片显示，致密的细胞层包围着内部腔隙，符合类似心腔的组织结构。图像使用成像显微镜获取。对分化结果的定量分析显示，94.0 ± 2.6%的心形体表现出自发性搏动，60.3 ± 20.6%含有一个或多个可见的内部腔隙。数据来自三次独立的分化实验，每次分化约分析115个心形体，以均值±标准差表示。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：心肌细胞分化的免疫荧光表征。 第14天心形类器官的代表性冷冻切片。(A) DAPI染色显示细胞核的分布情况。(B) 免疫荧光图像显示以DAPI标记的细胞核（蓝色）和以抗心肌肌球蛋白结合蛋白C抗体标记的肌节结构（cMYBP-C，绿色），表明分化后的心肌细胞具有有序排列的肌节结构。图像采用10×/0.30干式物镜（左）和63×/1.40油浸物镜（右）通过激光扫描共聚焦荧光显微镜获取。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：类心脏器官对寡核苷酸摄取的成像。 共聚焦图像显示第14天类心脏器官中荧光标记的反义寡核苷酸（ASOs，黄色）的细胞内定位。细胞膜用荧光标记的小麦胚芽凝集素（WGA，品红色）标记，细胞核用DAPI染色（蓝色）。与ASO相关的荧光表现为离散的细胞内点状信号（箭头）。底部图板显示未与荧光ASO孵育的阴性对照类心脏器官。右图图板中的图像对应于左图图板中方框区域的高倍放大视图。代表性图像采用40×水浸物镜，通过激光扫描共聚焦显微镜结合阵列探测器超分辨率成像获得。比例尺 = 10 µm（左）和5 µm（右）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：评估寡核苷酸在心形体中的穿透情况。（A）示意图，展示在心形体内不同深度获取光学切片的过程。该图像由作者使用Biorender绘制，并已附上所需的版权许可。（B）代表性共聚焦图像，显示荧光标记的反义寡核苷酸（ASO）在距组织表面z位置为0 µm、6 µm和10 µm处的分布情况。所有z位置的成像参数保持一致。比例尺 = 10 µm。（C）在每个成像深度下，含有至少一个与ASO相关的点状信号的细胞百分比的定量分析显示，组织各层间的寡核苷酸摄取水平相当，在0 µm、6 µm和10 µm处ASO阳性细胞的比例分别为83.1 ± 2.5%、84.9 ± 4.5%和84.0 ± 4.5%。数据来自三个心形体，每个心形体分析三个光学切片，共定量1,305个细胞，以均值±标准差表示。代表性图像采用40×水浸物镜，通过激光扫描共聚焦显微镜结合阵列探测器超分辨率成像获得。请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：延时序列。 以每秒 40 帧采集的视频展示了心形体中的自发收缩活动。成像使用配备 sCMOS 相机的宽场显微镜进行。请点击此处下载该视频。

讨论

基于寡核苷酸的治疗药物已成为一类强大的靶向基因的治疗手段，其发展得益于数十年来寡核苷酸化学的进步，这些进步提高了靶向特异性、代谢稳定性以及免疫耐受性7,8。尽管临床上获批的RNA治疗药物数量不断增加，但其更广泛的应用仍受限于细胞内递送效率低下7,8。由于寡核苷酸的尺寸、电荷和亲水性，它们无法被动扩散穿过质膜，而是通过内吞途径被细胞摄取9,10。摄取后，绝大多数（约99%）被内化的寡核苷酸仍被限制在内体区室中9,10。内体运输经历从早期内体到晚期内体并最终至溶酶体的成熟过程；然而，寡核苷酸从哪些确切的内体区室逃逸至胞质尚不完全清楚，且可能涉及多种内体群体9。这种有限的胞质释放构成了关键的限速屏障，凸显了建立生理相关性实验系统的必要性，以实现对寡核苷酸摄取、细胞内运输及内体逃逸的定量评估20。

本文所述方案旨在通过结合人iPSC来源的心球体与基于成像的寡核苷酸摄取检测方法，以满足这一需求。该系统的稳健性依赖于多个直接影响可重复性和实验结果的关键步骤。首先，起始iPSC培养物的质量是决定心脏分化成功与否的关键因素。作者建议定期进行核型分析，以确保长期的基因组稳定性，并常规评估克隆形态、完整性和生长动态。高质量的培养物应表现为结构紧凑、边界清晰的克隆，边缘平滑，自发分化极少，且增殖稳定。若培养物出现克隆边缘不规则、细胞形态异质或局部分化现象，应在启动分化前予以弃用，并更换为低代次的冻存细胞储备。

第二个关键步骤是使用微孔板对诱导多能干细胞（iPSC）聚集体进行可控形成，这有助于生成大小均一、尺寸明确的三维结构，对于可重复的心肌分化至关重要21。基于微孔的聚集方法可生成具有确定直径（最佳为200–230 µm）的类胚体，从而在时间依赖性调控Wnt信号通路过程中标准化细胞间相互作用以及形态发生梯度的暴露。根据我们的经验，通过在每个单独的微孔中接种约3,000个细胞（步骤2.2），可稳定达到该尺寸，此条件已在多个不同的人源iPSC细胞系中通过实验优化并验证，包括商业获取的细胞系以及实验室内部重编程获得的细胞系。然而，由于iPSC的增殖速率可能存在差异，最佳接种密度可能需要相应调整，以维持理想的聚集体尺寸。若未能有效控制这些参数，则可能导致结构异质性增加、细胞活力下降以及分化效率受损。

如图2所示，组织学分析可作为心形体形成的便捷质量控制评估手段。特别是，若缺乏内部腔室，或出现塌陷或碎片化结构，可能提示聚集体形成不佳，或在分化步骤（步骤4.1–4.3）中Wnt信号通路的时间调控不充分。在某些失败的分化过程中，心形体内或周围会出现非收缩性细胞群体。这些细胞在明场显微镜下通常呈黄色，倾向于贴附于低吸附培养板；而富含心肌细胞的心形体通常呈灰色，保持致密的三维结构，且不易贴壁。如果大量聚集体表现出这种贴壁且非收缩的表型，则应认为分化效果不理想。此时，应首先检查分化前iPSC集落的形态，确认第−1天至第0天期间聚集体的大小，并在必要时针对特定iPSC细胞系重新优化接种密度以及CHIR99021和IWP4的浓度。

在第10至12天时自发搏动较弱或缺失，通常反映中胚层诱导或心肌特化效率低下，最常见的原因是Wnt调节剂的浓度或处理时机不当，或CHIR99021处理后细胞死亡过多（步骤4.2）。根据我们的经验，针对每种iPSC系将CHIR99021的浓度优化在9–13 µM范围内，并验证储备液的浓度与活性，可显著提高分化效率。如图3所示，通过肌节蛋白排列的免疫荧光分析，可便捷地评估心肌细胞分化的质量控制。肌节蛋白染色信号弱或呈斑片状分布，尤其是仅局限于类心脏器官体周边区域时，通常提示心肌细胞分化不完全或存在异质性。在此类情况下，建议在固定前延长悬浮培养成熟期（步骤4.6及暂停点），并核实固定及抗体染色条件。

尽管这种心形类器官模型提供了一个三维的人类心脏微环境，相较于传统二维心肌细胞培养有了显著改进，但它并不能完全重现成人人类心脏的复杂性。心形类器官代表了人类心脏发育的早期阶段，其中心肌细胞仍保持未成熟、类似胎儿的表型。14此外，这些组织缺乏血管灌注、神经支配、常驻免疫细胞以及成熟心肌所特有的完整腔室结构。因此，尽管该平台适用于在受控实验条件下研究寡核苷酸的细胞摄取和细胞内分布，但在将摄取动力学和递送机制直接外推至体内情况时应谨慎对待 体内 未来整合更多类型的心脏细胞、血管网络以及组织成熟策略，将进一步提升该平台的生理相关性。

根据本方案所述的心球样结构，对寡核苷酸摄取进行可靠评估，需要对反义寡核苷酸（ASO）浓度、孵育时间以及成像采集参数进行优化和标准化，如图 4和图5所示。荧光染料的选择尤为关键，因为不同染料在亮度、光稳定性和对环境效应的敏感性方面存在差异。在本研究中，我们使用了Janelia Fluor 646（JF646）22，这是一种远红光硅基罗丹明荧光染料，具有高亮度和高光稳定性，可在三维样本中实现稳定的信号检测，同时最大限度地减少组织自发荧光。这些特性使其非常适合用于活体或固定心球样结构中寡核苷酸摄取的成像。值得注意的是，荧光染料的偶联可能会影响寡核苷酸的行为，包括其摄取和转运过程，因此应在每种实验体系中对其进行验证。

在当前形式下，本方案可同时对寡核苷酸的摄取进行定性和定量评估。通过共聚焦成像观察细胞内与反义寡核苷酸（ASO）相关的点状信号，可实现寡核苷酸在心形体内的定位可视化；而摄取效率则通过在 Fiji/ImageJ 中使用 Cell Counter 插件手动确定 ASO 阳性细胞的百分比来进行量化。尽管该方法适用于本文所展示的中等通量分析，但手动图像分析耗时耗力，且在处理大规模数据集时可能引入观察者偏差。近年来，针对三维显微成像的自监督深度学习技术取得了显著进展，为克服上述局限性提供了新的可能。基于人工智能的图像分析能够准确分割、识别并追踪复杂三维环境中的异质性亚细胞结构，从而实现对寡核苷酸摄取及细胞内运输过程（包括内体动态变化）的自动化定量分析23。将此类方法整合到本方案的后续应用中，有望显著提升实验通量、可重复性及分析精度。

展望未来，将人源iPSC衍生的心球模型与定量成像、基于机器学习的图像分析以及单颗粒分析方法相结合，为研究寡核苷酸在人心肌组织中递送的机制提供了一个强大的研究框架。将具有生理相关性的三维心肌模型与能够解析亚细胞结构和动态过程的先进分析工具相结合，将有望对寡核苷酸的摄取、细胞内转运，以及在适当辅助实验支持下对其内体逃逸过程进行系统性的定量表征。此类整合性方法有望促进递送效率决定因素的系统性鉴定，支持寡核苷酸化学结构和递送载体的理性优化，并为在心血管疾病背景下评估新兴寡核苷酸治疗药物提供一个可扩展的平台。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们感谢诺和诺德基金会优化寡核苷酸逃逸挑战中心的成员，特别是Knud Jensen在寡核苷酸设计与合成方面的贡献，以及Nikos S. Hatzakis和Tomas Kirchhausen在定量成像和细胞内运输分析方面的宝贵指导。本工作由诺和诺德基金会优化寡核苷酸逃逸挑战中心（NNF23OC0081287）资助。M.F. 获得了葡萄牙科学技术基金会（FCT）的博士后奖学金（2020.04836.BD）。我们感谢GIMM生物成像平台和GIMM组织病理学平台（葡萄牙里斯本）提供的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4',6-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸盐Thermo Scientific62248DAPI
10× 干式物镜ZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× 水浸物镜ZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× 油浸物镜ZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm 微孔聚集板STEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS 相机 AndorAndor Neo 5.5 
抗荧光淬灭封片介质Vector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片介质
B27 补充剂（不含胰岛素），50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 补充剂（含胰岛素），50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
基础培养基Gibco21875-034RPMI 1640
基底膜基质Gibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
明场显微镜 EVOSEVOS XL Core 成像显微镜
细胞解离液STEMCELL Technologies07922ACCUTASE
共聚焦显微镜ZEISSZEISS LSM 980 配备 Airyscan 2 显微镜
无饲养层定义型iPSC维持培养基STEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
未经处理的6孔板Avantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
鬼笔环肽Thermo ScientificA22287Phalloidin 标记探针 Alexa 647
磷酸盐缓冲液（1× PBS）Gibco14190-144DPBS 1×
一抗 c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 抗体 (F-1)
ROCK 抑制剂STEMCELL Technologies72304ROCK 抑制剂 (Y-27632)
二抗（绿色）Thermo ScientificA-11017F(ab')2-山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488
洗涤培养基补充剂Gibco10828028KnockOut 血清替代物
麦芽凝集素（WGA），Alexa Fluor™ 488 标记物Invitrogen W11261WGA
宽场显微镜NikonNikon Eclipse Ti 
WNT 通路抑制剂STEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin 通路激活剂SigmaSML1046CHIR99021

参考文献

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