利用弹性蛋白敏化和血管周围弹性蛋白酶可靠建立小鼠腹主动脉瘤模型

摘要

该方案为AAA模型结合了免疫致敏成分，为C57BL/6小鼠腹主动脉瘤（AAAs）的诱导提供了可重复且可靠的方法，利用弹性蛋白致敏和血管周围弹性蛋白酶。

摘要

腹主动脉壁弹性层状基质的退化是腹主动脉瘤（AAA）的一种组织病理特征。越来越多的证据表明，弹性蛋白降解及相关的宿主免疫反应与AAA的发病机制有关。有效建模这些过程对于加深对这一常见疾病的理解和治疗非常重要。虽然此前AAA模型曾使用弹性蛋白破坏技术诱导动脉瘤，但许多模型中仅使用弹性蛋白酶，并未解释对弹性蛋白及其降解产物（EDP）持续的免疫反应。为了模拟这种持续的免疫反应，我们开发了一个模型，通过在动脉瘤诱导手术前7天皮下注射EDP，使C57BL/6小鼠对EDP敏感。动脉瘤诱导手术通过暴露腹主动脉并在主动脉周围腔室涂抹局部弹性蛋白，目的是暴露小鼠主动脉上的弹性蛋白和EDP。暴露这些基层后，动物应对先前敏感的抗原产生免疫反应。7天后重复注射“加强剂”EDP有助于传播这种免疫反应。本文介绍了通过多次用EDP致敏，随后AAA诱导手术并施用血管周围弹性蛋白酶，在C57BL/6小鼠中可靠生成AAA的方案。该模型可以快速且成本适中，21天引产后第21天测量，82%的小鼠通过视频测微波和73%的主动脉扩张率，64%通过视频微米测量诱导主动脉扩张>>50%，超声增加27%。该技术还与95%的术中存活率相关。

引言

腹主动脉瘤（AAA）影响全球>3500万人，65至80岁男性中占4–8%。破裂是AAA最严重的并发症，通常发生在动脉瘤的机械壁应力超过主动脉组织强度时，导致大出血，整体死亡率为80−90^%3,4。目前的管理重点是预防，对高风险个体进行超声筛查，当破裂风险超过修复风险时进行手术修复，通常直径为5.5^厘米。然而，大多数AAA患者无症状，且许多人^是偶然被诊断的6。因此，应努力识别高风险患者，开发非手术治疗方法，以减少AAA生长，从而降低破裂风险。

要开发AAA的医疗治疗方法，必须更好地理解其发病机制。目前采用多种实验模型，包括使用血管紧张素II输注⁷、异种移植⁸、氯化钙应用⁹、输注¹⁰ 和/或弹性蛋白^酶11的局部应用的小型动物模型。这些模型各自采用了对AAA病理基础的不同理解，且大多数自诞生以来都被修改、改进或与其他方法结合。

重要的是，AAA组织学显示正常层状弹性蛋白基质丧失，这种结构在慢性阻塞性肺病的肺组织中也可见^12,13。通过基质金属蛋白酶活性进行弹性蛋白降解，是AAA发病机制与吸烟之间的重要联系，吸烟是AAA形成最重要的可调节风险因素^12,14。值得注意的是，人类AAA中主动脉弹性蛋白减少、弹性蛋白纤维破坏减少以及循环弹性蛋白肽增加，并与AAA壁面扩展性增加相关（^15,16）。因此，刺激弹性蛋白降解对于创建可翻译的AAA模型至关重要。现有依赖弹性蛋白降解的AAA模型虽然有效，但可能因动物死亡率高而复杂化，尤其是在使用主动脉导管的模型中，尤其是仅依赖局部弹性蛋白应用的模型中，¹⁸。此外，所有依赖诱导手术的模型都存在操作员的学习曲线和技术差异。

为解决这些问题，我们利用宿主免疫反应，通过注射弹性蛋白降解产物（EDP）使动物对弹性蛋白敏感。一周后，动脉瘤诱导手术以标准化的分阶段进行，利用主脑周围施加弹性蛋白酶，为敏感宿主建立EDP基，以发起免疫反应。诱导手术后一周进行的“加强”EDP敏化，确保宿主免疫反应持续。重复免疫致敏使主动脉扩张成为可靠的。我们采用小鼠AAA模型，因其成本更低、维护简便、疾病发展迅速且技术一致性高。

该模型无法可靠地导致主动脉破裂，因此不用于研究与AAA破裂相关的因素。然而，该模型确实能可靠地在诱导手术后21天内实现渐进性主动脉扩张。因此，该模型最适合研究可能在动脉瘤形成过程中减少或逆转主动脉扩张的治疗方法。

方案

1. 超声成像

1. 准备老鼠
   1. 将老鼠放入麻醉诱导舱。
   2. 吸入1.8−2%的异氟醚和氧气，直到小鼠麻醉。确保麻醉气体罐与麻醉装置相连，以减少操作员在使用异氟醚时暴露于挥发性麻醉剂。
   3. 将小鼠仰卧放置在加热至37°C的舞台上，鼻子置于麻醉鼻锥中。
   4. 用标签胶带将后肢贴在舞台上。
   5. 用棉尖的脱毛器涂抹在腹部，等待30秒。
   6. 用5厘米×5厘米的棉纱布垫去除腹部毛发。
   7. 将加热过的超声传输凝胶放在小鼠腹部。
2. 将38 MHz超声探头放在腹部，识别盆带。
3. 将主动脉识别为一个管状中线结构，通过超声探头施加适度的后向压力时，该结构不可压缩。
   注意：下腔静脉（IVC）将以腔状结构的形式出现在小鼠主动脉右侧，通过超声探头施加适度的后方压力时可被压缩。
4. 测量腹主动脉的前后直径，刚好在头侧直到分叉点。
5. 将探针沿主动脉近端移动，识别左肾静脉穿过主动脉前方进入下腔静脉。
6. 测量腹主动脉的前后直径，直到左肾静脉前方与腹主动脉交叉点。
7. 将探头向近端移动，识别隔膜。
   注意：膈肌可以被识别为肝脏的头部高回声带。
8. 测量腹主动脉的前后直径，刚好在尾部，直到进入腹部的位置。
9. 将老鼠放入笼子或用毛巾铺设的回收篮中，放置在加热至37°C的舞台上。
10. 观察小鼠直到它从麻醉中出来。

2. 初始弹性蛋白敏化

1. 在佩戴个人防护装备（包括手套、眼部保护和口罩）的情况下准备弹性蛋白降解产品（EDP）。
   1. 获取小鼠胰腺弹性蛋白酶的PBS悬浮液制剂，浓度为0.475单位/毫升（蛋白质4.75单位/毫克）。
   2. 取168微升弹性蛋白，加入5毫克小鼠弹性蛋白中。再加入200微升1X磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后用移液器混合。
   3. 将弹性蛋白和弹性蛋白混合物在37°C下孵育20分钟，间歇性轻微搅拌。
   4. 向弹性蛋白混合物中加入632微升冷1X PBS。
   5. 加入1毫升完整的弗洛因德佐剂。
2. 将老鼠放入麻醉诱导舱。
3. 吸入1.8−2%的异氟醚和氧气，直到小鼠麻醉。
4. 将小鼠置于加热至37°C的舞台上，将小鼠鼻子放入麻醉鼻锥中。
5. 在每个腰椎皮下注射50微升EDP，每只小鼠共注射100微升EDP。
6. 将老鼠放入一个铺有毛巾的回收篮中，放置在加热至37°C的舞台上。
7. 观察小鼠直到它从麻醉中出来。

3. 手术准备

1. 准备手术工具。
   1. 组装一套手术工具包，包括2个带齿产钳、1个锋利直柄产钳、1个锐角产钳、1把带刺刀、剪刀、至少3个自固定磁性牵开器、1个皮肤订书机和1个聚丙烯瓶盖。
   2. 手术前立即以无菌方式将4-0多乙醇酸编织缝线加入套包。
   3. 注意：3-0或5-0缝线尺寸也足够。
   4. 用无菌加热的1倍PBS填充聚丙烯瓶盖。
      注意：一瓶无菌1X PBS需保存在37°C的保温箱中以供补充。
2. 准备弹性蛋白酶。
   1. 将27微升5.1 mg/mL（≥4.0单位/mg蛋白质）猪胰弹性蛋白酶稀释至73微升1X PBS，最终体积为100 μL，用于10只小鼠（10 μL/小鼠）手术。
   2. 准备手术室。
   3. 在手术前将棉尖导管、锥形棉头导管和5厘米纱布和纱布制成的高压灭菌器，放在手术托盘旁。
   4. 将磁性手术台放置在显微镜台上加热垫，温度为37°C。将加热垫用胶带固定在显微镜台上，但保持磁性部件不固定，以便手术时调整位置。
   5. 在加热垫上铺一块吸水垫或纸巾。将一块5厘米×5厘米的纱布对折，放在麻醉鼻锥下方。
   6. 在手术区域附近放置一个装有脱毛剂的30毫升杯、装有5%聚维酮碘的30毫升杯、一管眼部润滑剂、手术胶带、非无菌的5厘米×5厘米纱布、非无菌棉质导管、密封的5厘米×5厘米酒精棉签、一卷胶带食品服务膜和一瓶70%乙醇喷雾瓶。
   7. 将1.3 mg/mL的缓释丁丙诺啡以每只小鼠75微升的体积抽入1毫升注射器，30克小鼠剂量为3.25 mg/kg。
3. 准备老鼠手术。
   1. 测量并记录老鼠的重量（克）。
   2. 将老鼠放入麻醉诱导舱。
   3. 吸入1.8−2%的异氟醚和氧气，直到小鼠麻醉。
   4. 将小鼠仰卧放置在加热至37°C的舞台上，鼻子置于麻醉鼻锥中。
   5. 皮下注射75微升丁丙诺啡。
   6. 用标签胶带将后肢贴在舞台上。
   7. 用棉尖的脱毛器涂抹在腹部，等待30秒。
   8. 用5厘米×5厘米的棉纱布垫去除腹部毛发。
   9. 给老鼠的眼睛涂抹眼部润滑剂。
   10. 用5厘米×5厘米的纱布垫将波维酮碘涂抹在小鼠腹部，并让其干燥。
   11. 用5厘米×5厘米的酒精棉签擦拭腹部。重新涂抹聚维酮碘并让它干燥。
   12. 通过捏住老鼠的脚趾，确保没有反应来测试麻醉效果。
   13. 在手术台上贴上一张胶片。
   14. 用70%乙醇喷洒手术台，让它干燥。
   15. 勤洗手，戴无菌手术手套。

4. 手术程序（初次弹性蛋白敏化后7天）

1. 露出腹主动脉。
   1. 用剪刀或手术刀沿腹部中线切开皮肤，切开~3厘米，从头部0.5⁻1厘米处开始，延伸至尾骨0.5厘米至剑骨。
   2. 用带齿镊子抓住皮肤，轻轻向上拉以识别白线，它会呈现为直肌之间的无血管面。
   3. 用剪刀切开白线，同时继续向上拉皮肤。注意只切除白线，避免腹部内结构。
   4. 放置磁性自固定牵开器，一个收回腹壁右侧，一个收回腹壁左侧，另一个收回切口尾侧结构，如膀胱和精囊。
   5. 用湿润的棉花头涂抹器，将肠道从身体外切开，并用湿润的5厘米×5厘米纱布覆盖。或者，用卷起的湿润纱布（5厘米×5厘米）将肠道塞入小鼠腹部左侧。
      注意：根据小鼠的解剖结构和牵开器的位置，肠道可能会被切除或反方向填充，以获得最佳的视觉效果。
   6. 在中线后方识别下腔静脉和腹主动脉。
   7. 使用棉尖导管，轻轻打开覆盖后血管结构的组织面进入腹膜后部。
      注意：对目标组织施加后方压力，然后将棉花涂抹器的尖端分开，会获得更大的牵引力。为了更温和的抓地力，可以将棉质涂抹器的尖端朝相反方向旋转。
   8. 将侧牵开器放得更深，以获得更好的牵引力和主动脉的可见性。
   9. 继续使用棉尖导引器轻柔分离下腔静脉和腹下主动脉，避免此阶段释放主动脉的外侧附着物。
   10. 继续在下腔静脉与主动脉之间形成平面，直到主动脉与下腔静脉之间出现三角形空隙（见图1）。
       注意：这一步通常最容易完成的是左肾静脉尾部。
   11. 使用钝器清扫或锋利产钳，将主动脉从小鼠左侧的结缔组织和腰部肌肉中拉开，从而释放外侧主动脉附着物。
   12. 将倾斜锋利的产钳放置在主动脉与下腔静脉之间形成的空隙中，并反复轻轻地开合镊子，以打开后主动脉附着体。
   13. 使用相同的开合技术，沿主动脉发展后平面，从头瓣到尾侧。
   14. 获取整个主动脉的视频微观图像并保存以供分析。
2. 涂抹血管周围弹性蛋白酶。
   1. 使用移液管沿暴露主动脉长度滴入10微升弹性蛋白酶溶液。
      注意：仅解剖主动脉内侧和外侧组织时，会形成一个排水沟，弹性蛋白酶会积聚其中。
   2. 将湿润的5厘米×5厘米纱布垫覆盖开放式腹部，让弹性蛋白酶溶液孵育10分钟。
   3. 去除纱布垫覆盖物，用无菌1X PBS冲洗腹部三次，以去除残留的弹性蛋白酶溶液。
3. 闭合腹部。
   1. 将腹部器官恢复到原位。观察并消除肠道是否有扭曲或弯曲。
   2. 使用带齿镊子，将直肌和筋膜从皮肤上剥离，形成0.25厘米的皮瓣。
   3. 用4-0编织多乙醇酸（或类似）缝线简单地闭合腹部筋膜，注意包合切口角，咬合间距不超过2毫米。
   4. 用3⁻4订书钉将外层表皮钉在一起。

5. 术后护理

1. 将小鼠从手术台移出，放入铺有毛巾的恢复篮中，放置在加热至37°C的台上。
2. 观察小鼠直到它从麻醉中出来。
3. 术后每天监测小鼠4天，记录其整体健康状况和腹部切口状况。
4. 术后，如上所述重复超声，监测动脉瘤的生长情况。
5. 手术后一周或在第1次超声检查时取出订书钉。

6. 重复弹性蛋白敏化（动脉瘤诱导手术后7天）

1. 按照上述步骤进行初始弹性质敏化，以同样方式制备EDP溶液，只需将不完全弗洛因德佐剂替换为完全弗洛因德佐剂。

7. 组织采集程序

1. 术后第21天采集组织进行各种分析。
2. 按照引产手术时的方法准备小鼠。
3. 再次暴露主动脉，方式与诱导手术时相同，注意不损坏任何用于组织学分析的标本。
   注意：此时小鼠已形成粘性疤痕，因此可能需要更多使用镊子锐利的解剖，而非钝器解剖。
4. 获取视频微度图像。
5. 进行心脏穿刺采集血液分析并安乐死老鼠。
6. 在佩戴适当的个人防护装备（包括手套、护目镜和口罩）时，给小鼠灌注进行分析。
   1. 如果组织指定用于流式细胞术（或类似分析），请以100−120 mm Hg的1X PBS灌注左心室，不使用血管扩张器，体积为8 mL。
   2. 如果组织指定用于PCR分析，先用1X血管扩张剂（0.1 M腺苷和0.01 mM硝基苯丙钠）灌注左心室，随后注入RNA稳定液。
   3. 若组织指定进行组织学分析，先用1X血管扩张剂灌注左心室1XPBS，随后注入10%缓冲福尔马林磷酸。
7. 采集所需组织，注意不要对任何用于组织学分析的组织造成结构性损伤。用缝线或标记剂进行标记定向。

结果

共有28只雄性C57BL/6J小鼠接受了该手术方案，其中1只因下腔静脉损伤（3.6%）为围手术期死亡率。另外有3例延迟死亡，其中1例因切口疝气，另外2例因不明原因，总21天生存率为85.7%。麻醉开始到麻醉结束的平均时间为46.4±8.0分钟。假手术小鼠接受的方案几乎与动脉瘤组相同，包括初始EDP致敏、腹腔切开、主动脉暴露及重复EDP致敏。关键区别在于，假组在诱导手术时未接受外用血管周围弹性蛋白酶。

通过超声和视频测微测量主动脉直径。代表性的超声和术中图像见 图2。主动脉瘤定义为第21天主动脉直径比值为≥1.5，相较基线。动脉瘤组在第21天的超声平均主动脉直径比值为1.43±0.17，假手术组为1.04±0.11（见图3，p=0.00046）。根据第21天的超声测量，11只动脉瘤小鼠中有8只（72.7%）表现出主动脉直径>30%增加，而5只假手术对照组为0（p=0.026）。然而，11只小鼠中有3...

讨论

自1990年首次在大鼠中描述以来，基于弹性蛋白酶的AAA模型已被多次修改，并应用于多种动物，编号^{10、19、20、21、22、23}。部分改造包括主动脉导管，这可能增加死亡率，并为主动脉病理引入创伤性因素¹⁷。较不侵入性的修饰包括3-氨基丙腈腈富马酸盐（β-氨基丙腈腈（BAPN）），一种溶于动物饮用水中的赖氨基氧化酶抑制剂¹⁸。大多数模型修改的理由是提高动脉瘤形成的一致性、技术操作的简便性以及动物存活率。不同模型及使用同一模型的操作者间手术技术差异可能导致结果差异和研究解读困难。特别是主...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 结核菌素注射器	Becton Dickinson	309628
10% 磷酸缓冲福尔马林	Fisher Chemical	SF100-4
70% 异丙醇棉签	Cardinal Health	S-16183
尖头弯曲镊子	Dumont	I I25 I-35
AutoClip 9mm（皮肤钉钳）	MikRon	427630
贝达丁	Atlantis Consumer Healthcare	67618-155-16
棉纱布	Dynarex Corporation	3223
棉签	Puritan Medical Products	25-806 2WC
来自猪胰腺的弹性蛋白酶（≥4.0单位/毫克蛋白质）	Sigma-Aldrich	E1250	储存在4℃的水溶液中
来自小鼠胰腺的弹性蛋白酶（4.75单位/毫克蛋白质）	Elastin Products Co., Inc.	MS838	储存在4℃的水溶液中（0.1毫克在1毫升PBS中）
弹性蛋白	MP Biomedicals	101636	储存在4℃的水溶液中
Enersight 桌面软件	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/enersight/
Ethiqa XR（缓释丁丙诺啡）	Fidelis	NDC 86084-100-30
眼部润滑剂	OptixCare	Opx-4242
Flexacam i5（立体）	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-cameras/p/12730536-leica/
Freund's完全佐剂	MP Biomedicals	642851	储存在4℃的水溶液中
Freund's不完全佐剂	MP Biomedicals	642861	储存在4℃的水溶液中
手套（无菌）	Encore	7824PF
皮下针（23号）	Becton Dickinson	305145
皮下针（27号）	Becton Dickinson	305109
Isospire（异氟烷）	Dechra Veterinary	07-894-8943
标签胶带	Fisher Scientific	15959
口罩	Dukal Corp.	1540
针筒驱动器	Scanlan	6006-36
Omnicon F/air 麻醉气罐	A.M. Bickford Inc.	80120
Press'N Seal	Glad	12587704417
RC2 啮齿动物电路控制器	VetEquip Incorporated	922100
RNAlater 稳定化溶液	ThermoFisher Scientific	AM7021
剪刀	Fine Science Tools	14005-12
皮肤钉（夹）	MikRon	205016
小型啮齿动物加热器	Stoelting	53851
小型啮齿动物加热台	Stoelting	53812
立体显微镜 M60	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m80/
直头尖镊子	Dumont	I I 25 I-30
SurgiSuite 自保持磁性牵引器套件和台	Kent Scientific	13-005-180
Tahoe 便携式氧气浓缩器	Vetland Medical	595-2300A
齿状镊子	Fine Science Tools	11043-08, 11042-08
Vevo 2100 超声波	FUJIFILM Visualsonics	EDU00496
Visorb 聚乙烯醇酸缝合线	CP Medical	397A
VWR 吸收剂	VWR	95057-860