秀 丽隐杆线虫的简单易用孵化检测方法：可适应的药物筛查格式

摘要

本研究展示了一个灵活且标准化的秀 丽隐杆 线虫孵化测定平台，集成了多种实验格式。该方法提升了可重复性、可扩展性和可及性，使药物效应和开发过程能够稳健评估，同时在成本效益高且易于适应研究和教育环境。

摘要

卵孵化测定（EHA）被广泛用于评估化学化合物对线虫早期发育阶段的影响，尤其是在抗虫学研究中。然而，现有方法论在格式、复杂性和可重复性方面差异较大，且常被呈现为固定方案，而非可适应的实验框架。本研究通过整合并直接比较三种实验配置，建立了一个简单、易用且灵活的秀 丽隐杆线虫 卵孵化实验平台：（i）在微离心管中受控培养后在琼脂板上播种，（ii）在含药物琼脂板上直接暴露，以及（iii）多孔液体测定。用了两种代表性化合物来说明该检测：一种抑制卵孵化，另一种无明显效果。每种配置在实验控制、吞吐量和可及性方面都有明显优势。基于微离心管的方法能够精确控制药物暴露，并支持定量药理学分析。琼脂基测定法提供了一种简化且低成本的替代方案，适合持续暴露和教育环境。多孔格式实现了可扩展、标准化的筛选，符合现代药物发现流程。通过直接比较这些格式，我们展示了方法学选择如何影响测定的重复性、药物暴露动态和生物学解释，特别是在阶段特异因素中，如蛋壳的保护作用和分子靶点表达的发育变异。总体而言，这项工作确立了秀 丽隐杆线虫 孵化测验作为一个多功能且可扩展的平台，适用于抗虫筛查、毒理学评估、发育研究和教学实验室等多种应用，从而促进该方法的更广泛和合理应用。

引言

卵孵化测定（EHA）长期以来已被确立为线虫学中评估杀卵活性和化合物早期发育效应的基石方法。这些测定最初为寄生线虫开发，能够量化在受控体外条件下胚胎或幼虫孵化的抑制，提供稳健且生物学相关的终点，如孵化率或浓度-反应分析（如EC₅₀或IC₅₀^）1,2,3,4,5,6,7。

经典的基于卵的方法在寄生线虫如扭曲的海蒙库斯和三强菌（Trichostrongylus colubriformis）中被广泛用于评估合成药物和天然产物的疗效，以及监测抗驱^{虫抗性1,2,6,8,9,10}.这些方法涵盖了多种读数，从直接评估卵子的存活率和孵化，到粪便培养后幼虫发育的评估。它们在将药物暴露与寄生虫生殖产出和传播潜力联系起来方面发挥了核心作用。然而，这些方法通常需要从感染宿主中进行复杂的样本制备、延长的孵育期和专业基础设施，这可能限制其可及性、可扩展性和实验室间的重复性。

将秀丽隐杆线虫作为模式生物的使用，已成为克服寄生线虫若干局限性的有力策略。其短生命周期、遗传易处理、易于培养以及与寄生物种共享的关键分子靶点的保护性，使其特别适合药理学、毒理学和发育学研究。重要的是，秀丽隐杆线虫的胚胎发生速度快且高度可重复，使卵子的存活率和孵化测试能够作为定量且可靠的早期发育过程及其被异种生物干扰的读数（^{11,12,13,14,15,16,17}）。

此外，经过充分描述的突变株的存在，使得对药物作用和耐药机制有了新的见解。以往研究表明，对生物活性化合物的抗药性可以以阶段依赖的方式出现，胚胎和幼虫阶段的敏感性差异。例如，谷氨酸能信号的改变与幼虫的耐药表型有关，而卵孵化则未受影响 14,18,19,20。这凸显了药物敏感性的阶段特异性，并表明胚胎阶段可能涉及不同的靶点或与晚期发育阶段的可及性差异。

除了寄生虫学之外，秀丽隐杆线虫的卵子存活性检测在毒理学和早期药物发现中也日益重要。这些检测方法不仅用于评估驱虫活性，还用于评估发育毒性和药物诱导的胚胎缺陷，其结果可与更高毒性的生物体特征相关（^15,16）。同时，卵壳的存在带来了重要的生物学约束，因为它作为包围胚胎的保护性和选择性渗透屏障^21,22。因此，尽管在发育后期阶段^{14、19、23、24}表现出活性，某些生物活性分子可能未能到达胚胎。因此，胚胎的获取可能取决于每种化合物的物理化学性质，包括分子大小和极性。这可能导致孵化实验中观察到的活性与后期发育阶段的活性差异。这一区分强调了明确定义实验背景和被测量生物学终点的重要性。

在方法学上，秀丽隐杆线虫的孵化测定采用了多种实验形式，包括同步卵液培养、直接暴露于含药物琼脂板以及适用于中高通量筛选的多孔测定法，编号^{为11,13,14,16,19,23,24}。

液体基和微板格式已被广泛应用于药理学筛选研究，因为它们提供了均匀的暴露条件，便于精确控制药物浓度，并允许对浓度-反应关系进行定量分析。与此同时，针对寄生线虫的类似多孔策略也被广泛开发，从传统的96孔板测定到采用384孔格式的超高通量平台^4,5。这些方法共同强调了不同线虫种类卵孵化检测的多样性和可扩展性，以及它们对从小规模机制研究到大规模化合物筛选等多样化实验环境的适应性。

每种格式在实验控制、可重复性、通量和可及性方面各有优势和局限性。液体测定法提供均匀的暴露条件，非常适合定量药理分析，而琼脂法则允许在开发过程中持续暴露，但会引入与药物扩散和生物利用度相关的变异性。多孔格式则促进并行化并减少试剂消耗，符合现代筛选策略。

尽管广泛应用，孵蛋测试常被介绍为固定方案，而非灵活的方法论框架。格式之间的直接比较很少，针对从机制研究到高通量筛选或教学环境等具体应用选择最合适配置的指导仍然有限。

本研究提出一个简单、易用且可适应的秀 丽隐杆线虫卵孵化实验平台，整合并比较三种实验配置：（i）在微离心管中受控孵育后在琼脂板上播种，（ii）直接暴露于含药物琼脂板，以及（iii）多孔液体测定。

通过系统评估这些配置，我们旨在建立一个实用框架，突出实验控制、简易性和可扩展性之间的权衡。这一综合视角将传统寄生虫学方法与现代基于模型的筛选方法相结合，将孵化卵子检测定位为一个灵活的平台，可适应多种研究环境，包括驱虫发现、毒理学评估、发育生物学和教育应用。

方案

1. 秀丽隐杆线虫 的菌株与文化

1. 使用野生型N2（布里斯托尔）菌株和/或转基因菌株PD4251（ccIs4251;dpy-20（e1282））来开发和验证方法^25,26。PD4251表达GFP，便于在需要时的可视化和潜在成像应用，同时表现出与本研究实验条件下野生型N2菌株观察到的卵孵化和发育反应无异²⁷。
2. 从美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）支持的 线虫 病遗传中心（CGC）获取株（例如野生型N2株）。
3. 在标准实验室条件下，将线虫在18–25°C的标准实验室条件下，使用新鲜制备的线虫培养基（NGM）琼脂平板，并以大肠杆菌OP50为食物来源进行保存。通过将16克琼脂、3克NaCl和2.5克双链肽溶解于975毫升蒸馏水或超纯水中制备NGM。用高压菌灭菌。将培养基冷却至55°C后，加入无菌溶液：磷酸钾缓冲液（25毫升，1米，pH6.0）、CaCl₂（1毫升，1米）、MgSO₄（1毫升，1米）和胆固醇（1毫升，5毫克/毫升，绝对乙醇）。彻底搅拌后在无菌条件下倒入盘子。
4. 按照WormBook及相关研究^{24、26、28、29}中描述的既定程序，进行常规的搬运、繁殖和维护。通过确保细菌持续的食物供应和避免盘子过于拥挤，保持蚯蚓处于非饥饿的条件下。保持培养物温度在推荐温度范围内（18–25°C），避免过于干燥，因为这可能加速琼脂脱水。
5. 开始分析前的一般考虑
   1. 事先确定所有实验参数，包括温度（18–25°C）、潜伏时间（4–8小时）、湿度（50–70%）以及操作程序。
   2. 在开始检测前准备所有材料，以确保时间和工作流程协调。
   3. 在所有复制中保持实验条件一致，以最大限度减少变异性。

2. 测试化合物和对照的制备

1. 实验当天将所有化合物新鲜准备。溶解原料于M9缓冲液中（22 mM KH₂PO₄，42 mM Na₂HPO₄，86 mM NaCl，1 mM MgSO₄）或无菌蒸馏水中，具体取决于化合物的相容性和检测条件^30,31。
   注意：水溶液培养基的选择会影响秀 丽隐杆线虫 检测中的化合物活性。例如，血清素等化合物在无菌蒸馏水中与M9缓冲液中制备时，可能表现出不同的有效浓度。因此，在测定优化过程中，应通过实证评估载体兼容性和生物响应。此外，对于水溶性较低的化合物，可以使用合适的载体，如二甲基亚硫酸酯（DMSO）或乙醇。最终溶剂浓度应保持较低（通常低于0.2% v/v），以避免毒性。此前关于 秀丽隐杆线虫 的研究报告称，在标准实验室条件下，DMSO浓度高达0.5%的效果极小¹⁷。
2. 每种化合物至少准备五个浓度，以便构建浓度-响应曲线并估算IC₅₀ 或IC₉₀ 值。以序列稀释为起点，浓度步长为2到3倍，并根据每种化合物的预期效力、溶解度和实验反应调整最终浓度范围。
   注意：如果测试化合物对光敏感，所有制备步骤应在昏暗光线下进行，以防止降解。这包括制备原料溶液、稀释液和含药琼脂平板。尽可能，盘子应用铝箔覆盖并存放在黑暗中。同样，多孔板在孵化期间应保持覆盖（例如用箔盖或不透明盖子）。建议使用密封容器或减少光照的湿气腔室，以在整个实验过程中保持化合物的稳定性。
3. 每个实验中应包含以下对照：仅缓冲液对照（M9或水）和载体对照（例如DMSO或乙醇，处理中使用的浓度相同）。
   注意：溶剂的选择至关重要。DMSO和乙醇常被使用，因为它们能溶解疏水性化合物，同时在低浓度下保持生物相容性。替代方法如Tween 20或环糊精，可考虑以提高溶解度。药物溶液应在制备后立即使用，因为稳定性随时间可能变化，影响复原性。

3. 同步采集秀 丽隐杆线虫 卵

注：秀丽隐杆线虫卵的分离过程在以往研究中有大量描述，^29,32。本文总结了主要步骤，并结合了小幅修改，以优化清洁、无杂质的卵子回收，以便进行孵化检测。

1. 孕虫收集
   1. 从3–5个NGM板开始，内含孕卵成体的汇合培养物^25,26。偏好含有大量孕虫和可见卵的盘子，表明活跃繁殖，同时避免过度拥挤或饥饿的培养物。此阶段通常无法确定确切的线虫数量，因为秀丽隐杆线虫的卵分离方案通常依赖于融合的繁殖培养，而非精确的动物计数。一般来说，每块60毫米的板块应包含数百只怀孕的成虫。
   2. 在每个盘子中加入蒸馏水，轻轻将蚯蚓洗入15毫升锥形管中。避免刮除琼脂表面以减少杂质。
   3. 以266× 克 至3分钟（18–25°C）离心机沉淀蚯蚓。去除含有细菌的上清液。
   4. 取出上清液，重复洗涤步骤三次。每次轻柔地将颗粒重新悬浮，以更好地去除残留细菌。
2. 通过漂白分离卵子
   1. 将蚯蚓沉淀重新悬浮在新制备的漂白溶液中（1.2% NaOCl和0.5 M NaOH;最终体积5 mL）。使用前应立即准备溶液，以确保活性。
      注意：正确漂白样本定义为在未发育卵形态正常且具活性的情况下，破坏/消化成体尸体的制备。过度漂白的样本通过受损或裂解的卵、异常卵形态、孵化率下降或孵化后无活幼虫来识别²⁵。
   2. 用力搅动管子，促进成体溶解和卵子释放。培养过程中应持续混合，以确保均匀暴露。
   3. 密切观察反应，不超过5分钟。目视检查：成虫身体大部分应溶解，而卵仍保持完整。
   4. 密切监测反应，并在5分钟后通过加入冷无菌蒸馏水（最好是10°C）至最终容量14毫升停止。不要让孵化时间超过这个时间，以防止卵子受到损害。
   5. 盖上管子，轻轻倒置几次，快速稀释漂白溶液。请立即执行此步骤，以保持卵子的存活率。
   6. 在266× 克 离心3分钟（18–25°C），然后小心丢弃上清液。
   7. 用无菌蒸馏水清洗蛋丸三次，彻底去除残留漂白剂。确保洗涤间隙充分复吸。将卵重新悬浮在5毫升M9缓冲液或无菌水中。
      注意：漂白孕育雌雄同体可获得适合同步检测的无菌卵子制剂。在缺乏食物的情况下，孵化的幼虫进入L1发育停滞，并在摄食时同步恢复发育。
3. 纯化步骤（蔗糖浮选）
   1. 如果漂白后可见蚯蚓残骸，请执行此步骤。
   2. 通过稀释60%无菌蔗糖存液制备30%蔗糖溶液（例如，混合等量：5毫升60%蔗糖与5毫升蒸馏水）。
   3. 将蔗糖溶液加入沉淀中，轻轻倒置搅拌。避免涡旋。
      注意：由于该纯化步骤较短，且随后立即清洗去除残留蔗糖，在本研究所用条件下未观察到对卵子存活率的可检测效果。相比之下，清除蚯蚓残骸显著提升了卵的可视化、计数准确性以及样品间药物暴露的均匀性。
   4. 离心机温度为266× 克 ，5分钟（18–25°C）。
   5. 将蛋层识别为溶液顶部的一圈细白环。立即通过小心移动移液头沿环移动，收集含4毫升上清液的卵子。
   6. 此步骤要迅速完成，因为鸡蛋在离心后不久因重力开始下沉。
   7. 将收集的上清液转移到装有无菌蒸馏水的干净管子中。用冷无菌水清洗鸡蛋两次，去除残留的蔗糖。
      注意：此步骤为可选，但强烈建议。清除杂质提升了卵的可视化和计数准确性，并通过防止卵被残留的蚯蚓材料困住，确保更均匀地暴露于测试化合物。
4. 蛋汤溶液的制备
   1. 采样前应轻轻混合蛋液，因为蛋会迅速沉积。
   2. 将三滴20微升的液体滴在载玻片上，在立体显微镜下计数卵数。
   3. 计算平均值，并使用M9缓冲液将浓度调整为每100微升50–100个鸡蛋。在分割前再次混合，以保持均匀分布。
   4. 根据所选方案，计算每种实验条件下所需的卵子悬浮量。

4. 孵蛋测定格式

1. 微离心管中的短期鸡蛋暴露（高控制格式）
   注意：此实验配置基于之前描述的程序²⁵，并进行了改进以改善暴露条件控制和重复性。
   1. 用于卵孵化测定的琼脂平板制备
      1. 仅用琼脂和蒸馏水制备无药物琼脂平板（1.7克琼脂加入100毫升水）。不要添加营养物质或细菌，因为目的是评估蛋孵化过程，避免食物干扰。每35毫米培养皿倒入约3毫升琼脂，以保持实验间琼脂深度的一致。
      2. 使用前12至24小时准备盘子。避免超过此时间窗口，因为过度干燥会降低卵的存活率并影响幼虫的活动。
      3. 凝固后将每块板分为四个象限以便计数。
      4. 将板材存放在8–10°C的密封环境中，以防止脱水。使用前让盘子达到室温平衡。
   2. 每种情况分别将500微升的卵悬浮液转移到1.5毫升微离心管中。在移液步骤间轻轻混合，防止鸡蛋沉淀，因为鸡蛋会因重力迅速沉降。保持均匀的悬浮液对于确保不同条件下卵数一致至关重要。
   3. 在500微升卵悬浮液中加入500微升处理溶液或对照组。在22°C下孵育4–8小时。提前定义潜伏时间，并在不同实验间保持恒定（例如6小时），因为时间的变化直接影响药物暴露。
      注意：处理溶液应以期望最终浓度的2倍调制，这样与蛋液混合后稀释后可获得预期的最终工作浓度。
   4. 在孵育期间使用管式旋转器（例如垂直旋转5–20转/分钟）或摇摆平台保持持续的轻柔搅拌。确保管子持续活动，以防止蛋沉降并促进均匀暴露。这一步至关重要，因为静止条件会导致卵子积累和药物暴露的异质性。
   5. 孵育后以3420× 克 离心3分钟（18–25°C）。识别出颗粒，它在管壁上呈现出一小块白色沉积物。离心前应持续定向（例如标记一侧），以促进快速定位颗粒，防止上清液清除时意外丢失。
   6. 小心地去除上清液，不要扰动沉积物。用M9缓冲液清洗鸡蛋三次以去除残留化合物。将最终沉淀重新置于240微升M9缓冲液中。
   7. 将悬浮液按琼脂板板，每个象限分配20微升。每个州用三块板。让滴液完全干燥后再移动或倒置盘子，以防止卵子在表面被移位。
      注意：起始时应将鸡蛋悬浮液总量大于洗涤过程中的卵子损失，并确保有足够的最终样本量用于摆盘和计数。为了简化流程并减少琼脂平板的使用，尤其是在教学环境中，应将重新浮起的卵子直接转移到多孔平板中，而非琼脂平板上。将最终体积调整为每井200微升，并用无菌水注满未使用的井，以减少蒸发。
2. 直接暴露于含药物琼脂平板上的卵子
   1. 准备仅含有琼脂和无菌蒸馏水的琼脂溶液（100毫升中1.7克琼脂）。加热至完全溶解，并保持溶液液态。加入任何化合物前，请让琼脂冷却至50–55°C，并用实验室温度计监测温度。这一步对于保持化合物稳定性并确保均匀掺入至关重要，如前所述²⁸。每种化合物至少准备五个浓度，以便进行浓度-响应分析和IC₅₀ 估计。
      注意：不要添加细菌性食物来源。在缺乏食物的情况下，孵化的幼虫会同步进入L1发育停止，阻止其在^26.33测试期间进入后期幼虫阶段。
   2. 向冷却后的琼脂中加入适当量的药物溶液或车辆控制液。通过慢速倒置轻柔混合，确保均匀分布。避免涡旋或剧烈摇晃，以防止气泡形成。
   3. 立即将约3毫升琼脂倒入35毫米培养皿中。持续工作以保持温度和板厚的一致性。每个州至少准备3到5个盘子。
   4. 板材的储存和处理方法如下：让板材在室温下平坦表面凝固。储存板倒置以防止冷凝水到达琼脂表面。
   5. 准备实验：直接在琼脂板上播种50–100枚卵。保持实验参数恒定，包括温度、培养时间、湿度和平板准备时间。在浓度-反应分析中至少使用五种浓度。
      注意：使用前12至24小时准备图版。避免过度干燥，因为这可能影响卵的存活率和幼虫的活动。使用感光化合物时，使用保护板以减少脱水并防光。将盘子存放在干净、最好加湿的环境中（例如密封容器，里面有湿纸），以减少变异。
3. 多孔板中的蛋孵化测定（中高通量格式）
   注意：该格式广泛应用于 秀丽隐杆线虫 和寄生线虫研究中高通量筛选，允许在标准化条件下并行评估多种化合物和浓度。
   1. 井板准备与实验设计：使用96孔板（或根据通量需求使用替代格式）。提前准备板状布局，定义药物浓度（跨列排列）、重复浓度（跨行）及对照组，包括仅缓冲液（M9或水）和载体对照组（例如DMSO或乙醇，且与处理中相同最终浓度）。
      注意：使用透明、平底多孔板，以便在透射LED照明下，立体显微镜直接观察和计数。卵和孵化的L1幼虫直接在井中定量，无需转移步骤，最大限度地减少样本损失并处理伪影。
   2. 每口井预装适当量的药物溶液或对照液。所有井的体积均等。
   3. 添加蛋悬浮液
      1. 准备一个均匀且浓度明确的蛋悬浮液（见第2节）。
      2. 向每个含有药物溶液的孔加入等量的卵悬浮液。每孔使用200微升的最终体积。
      3. 将卵密度调整为每孔至少30枚（理想为30至100枚）。每井不要超过100枚鸡蛋，因为过度拥挤会大大增加人工定量。单个卵难以区分，而活动性强的L1幼虫则活跃地在井中游动，降低计数准确性并增加实验变异性。
      4. 在分发前轻轻搅拌鸡蛋悬浮液，以确保均匀分布。
   4. 小心装盘子。避免引入气泡。移液器要持续使用，并在不同条件下更换吸头，以防止交叉污染。轻轻敲击板，确保所有内容物沉积在井底。
   5. 孵化条件：在20–22°C的受控潮湿条件下，从卵分离起孵化板，总共24小时。
      注意：通过避免使用外井或填充缓冲液以减少蒸发，以最大程度减少变异性。将平板放入加湿箱（例如密封容器，内含湿纸），并在处理感光化合物时保护免受光照。在孵蛋期间避免不必要的活动。在所有复制品中保持卵子制备和药物暴露时间的一致，因为差异可能影响发育阶段和数据解读。

5. 评估与计数

1. 在卵分离后24小时评估卵的孵化情况，确保控制条件在规定温度下完全孵化。计算从采卵时刻起计算该时间点，以保证胚胎发育充足。将此阶段尚未孵化的卵视为受处理影响。
2. 用立体显微镜检查样本。对于每种条件（琼脂平板或多孔平板），量化未孵化卵数和孵化L1幼虫数。
3. 扫描整个观察区域，包括板块边缘和井边，因为活动性L1幼虫可能分布不均，并在这些区域积累。
   注意：在立体显微镜下进行直接计数，无需额外设备即可快速评估。在不同条件下保持卵密度一致，每个条件下至少使用3–5次技术重复，并至少进行三次不同卵子制剂的独立实验，以确保可靠比较。

6. 图像采集与文档

1. 使用配备数码相机的立体显微镜拍摄图像。琼天平板记录每个象限;对于多孔板，记录每口单独的井。确保所有区域都被捕获，包括板缘和井边，这些区域可能有幼虫聚集。
   注意：标准的10倍目镜和物镜，范围为0.6倍至5倍（总放大倍数为6倍至50倍），广泛使用，能够清晰观察计数区内的卵和L1幼虫。使用透射LED照明。在所有实验条件下保持恒定的相机采集设置（亮度、曝光和对比度），以确保图像质量一致和样品间的可靠比较。
2. 使用合适的采集软件来拍摄图像。使用图像分析软件处理和分析图像。在所有实验条件下保持相同的分析参数，包括亮度、对比度、放大率、相同的采集区域/场域以及计数标准。
3. 从获得的图像中量化未孵化的卵和L1幼虫数量。只有在完全脱壳后，幼虫才算是孵化出来。含有部分羽化幼虫的卵应归类为未孵化。在所有实验条件下应用相同的分类标准。
4. 在16至18°C下再孵育12至24小时，以评估观察到的卵孵化抑制是否可逆。在规定的实验条件下，此阶段未孵化的蛋被视为受处理影响。

7. 数据分析

1. 计算孵化抑制效果如下：
   未孵化卵的比例 = （未孵化的蛋数） / （卵总数 + 幼虫）
2. 至少进行3到5次不同蛋批次的独立实验。将数据表达为平均±标准差（均值±标准差）。
3. 利用非线性回归生成浓度-响应曲线，确定IC₅₀ 值。
4. 使用Student的 t检验对各病症进行统计比较，并在 p < 0.05处定义统计显著性。
5. 使用适当的统计软件进行数据分析。

8. 使用转肉桂醛和醋酸酯进行卵孵化检测的应用

注：本研究并非聚焦于特定化合物，而是通过代表性药物说明每种实验形式如何在可比条件下实施、控制和解释。转肉桂醛（TCA）之所以被选为示范化合物，是因为它此前已被鉴定并能在上述三种检测配置中持续产生强健且可重复的卵孵化抑制作用。重要的是，纳入TCA的目的是展示协议的实施和代表性的集中-反应行为，而非建立不同格式之间的相对效力或性能比较。

1. 实验装置与化合物制备
   1. 提前12–24小时准备琼脂平板（每35毫米皿3毫升），使用纯琼脂培养基（蒸馏水中1.7%）。给盘子贴标签，分成四个象限以便计数，密封保存以防止脱水，并在使用前将其平衡至室温。
   2. 在DMSO中制备新鲜的反肉桂醛（TCA）液，并稀释于无菌水或琼脂中，获得八个最终浓度（0.05–0.7 mM）。在所有条件下，保持最终DMSO浓度低于0.2%。分别将水、琼气和/或DMSO作为负片和载体对照。
   3. 在5 mM下测试醋酸酯作为阴性对照，以评估在相同实验条件下区分活性和非活性化合物的能力。
   4. 如上所述准备同步的鸡蛋悬浮液，并将密度调整为每100微升50–100个鸡蛋。所有配方使用相同体积和可比的鸡蛋数，以确保各条件间的一致性。
2. 使用参考化合物的实验格式应用
   1. 微离心管中的短期暴露（高控制格式）
      1. 将500微升蛋悬浮液与含0.05–0.7毫米TCA的500微升处理溶液混合。在18–20°C下将试管孵育6小时，并在所有实验中保持潜伏时间一致。
      2. 培养期间，使用旋转器持续轻柔搅拌管。
      3. 暴露后以3420× 克 离心3分钟（18–25°C），并小心去除上清液。用蒸馏水清洗卵三次，以去除残留化合物，并在规定的孵化期内减少暴露。
      4. 将最终沉淀重新悬浮于240微升蒸馏水中，并以每象限20微升浓度的琼脂板板，使用三块板板，每个条件下。分离卵后，在16–18°C下孵育盘24小时。
   2. 直接暴露于含药物琼脂平板
      1. 通过将TCA溶液加入冷却至50–55°C的琼脂，并轻柔混合，以确保均匀分布，制备含药物琼脂板。每块平板倒约3毫升琼脂，并在使用前12–24小时准备平板。
      2. 种子卵直接放置在板面上，密度与其他格式相当（每100微升50–100个卵）。不要在这种配置下进行洗涤步骤。
      3. 在16–18°C下孵化盘子，直到卵分离后24小时。
   3. 多孔板测定（中高通量格式）
      1. 预装96孔板，并配备药物溶液和控制。添加卵悬浮液，最终体积为每孔200微升，密度为50–100个。
      2. 通过避免气泡和保持井间体积一致，确保装载时均匀分布。在卵分离后，在20–22°C湿度下孵育盘24小时。
3. 图像采集与定量
   1. 在控制条件下，在卵分离完成后24小时内评估孵化情况。在立体显微镜下统计每种情况的未孵化卵和L1幼虫数量。仔细检查板块边缘和井口边界，因为幼虫可能在这些区域积聚。
   2. 使用配备数码相机的立体显微镜拍摄图像以进行记录。记录每个象限的琼脂板，并系统地对每个孔进行多孔板成像。必要时使用图像分析软件支持量化。
   3. 图像采集后再潜伏板12至24小时，以评估观察到的孵化抑制是否可逆。
   4. 所有实验至少使用三个独立的生物复制体进行。

结果

TCA在所有实验格式中均明显抑制了卵孵化，如 图1所示。为每种检测配置提供了代表性的浓度-响应曲线：微离心管（图1A）、琼脂平板直接暴露（图1B）和多孔板（图1C）。

估计IC₅₀值为微离心管中0.19 ± 0.0262 mM，琼脂板为0.1758± 0.0463 mM，多孔板为0.2267 ± 0.0093 mM。这些数值作为每种检测格式中浓度-反应关系的代表性示例。虽然观察到细微差异，但所有数值均处于相对狭窄的范围内，表明实验配置之间的整体一致性。重要的是，化合物特异性反应可能随物理化学性质和检测条件而异;因此，这些数值不应被解释为跨格式效力的普遍预测。

对照条件（水和DMSO组）在所有实验格式间孵化率无显著差异（

讨论

本研究提供了一个简单且可适应的秀 丽隐杆线虫孵化实验平台，围绕三种互补的实验形式构建，分别在控制、暴露动态和可扩展性上有所不同。我们的结果支持这样一种观点：孵蛋实验应被视为一种灵活的方法论框架，能够适应特定实验目标。

基于微离心管的结构为药物暴露提供了高度受控的环境，允许精确定义孵育时间、化合物浓度和清洗步骤。这种配置特别适合定量药理分析和机理学研究，因为它能够区分暴露阶段与后续显影阶段。使用该格式获得的IC₅₀ 值（0.19 mM）反映了这些受控条件，即化合物暴露有时间限制，随后通过清洗步骤降低孵化前残留药物浓度。该设计最大限度地减少了长期暴露带来的混杂效应，并便于后续应用，如将幼虫转移到细菌种子培养板上，以便进一步评估运动、生长或发育进展。类似的分离暴露和恢复阶段的方法此前已在秀 丽隐杆线虫 的药理学测定^19、23、...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌学琼脂	Britania	B0101406	应新鲜制备（1.7 克于 100 毫升 H2O 中）
漂白液	N/A	N/A	1.2 % (v/v) NaOH 和 0.5 M NaOH
离心机	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
离心机	BiofugePICO to eppendorf 试管	Heraeus 75003235
数码相机	ToupCam	TP605100A	工业数码相机。可调焦距 USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	分子量：78.13
芳樟醇醋酸酯	SIGMA	CAS 编号：115-95-7	应新鲜制备
溶菌肉汤（LB）培养基	N/A	N/A	10 克肉蛋白胨，5 克酵母提取物，10 克 NaCl 加至 1 升蒸馏水
M9 缓冲液	N/A	N/A	3 克 KH2PO4，6 克 Na2HPO4，5 克 NaCl，0.25 克 MgSO4 加至 1 升蒸馏水
迷你旋转器	BioSan	Bio RS-24
线虫生长培养基（NGM）	N/A	N/A	3 克 NaCl，17 克琼脂，2.5 克 Bacto-Peptone 加至 1 升蒸馏水。通过高压灭菌进行灭菌。补充 1 毫升胆固醇（5 毫克/毫升），  1 毫升 CaCl2（1 M），25 毫升钾磷酸盐缓冲液（1 M，pH 6.0）和 1 毫升 MgSO4（1 M）
培养皿（3 - 5 毫米）	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
培养皿（90 毫米 x 15 毫米）	ExtraGene	1026160305	仅供实验室使用，聚苯乙烯。
移液器	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	版本 12.0
立体显微镜	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	三眼立体显微镜（10x–40x 总放大倍数；LED 入射和透射光源）
蔗糖	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60 % (v/v) 蔗糖
96 孔组织培养板	Biofil	TCP 012096	聚苯乙烯，低蒸发盖。
ToupView	ToupTek Photonics	N/A
反式肉桂醛（TCA）	Santa Cruz Biotechnology	J1712	应新鲜制备