简单且易于操作的卵孵化检测方法 秀丽隐杆线虫可变格式的药物筛选

摘要

本研究介绍了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中灵活且标准化的卵孵化检测平台，该平台整合了多种实验形式。该方法提高了实验的可重复性、可扩展性和可及性，能够有效评估药物效应和发育过程，同时具备成本低、易于适应科研应用和教学环境的优点。

摘要

卵孵化实验（EHA）被广泛用于评估化学化合物对线虫早期发育阶段的影响，尤其在驱虫药物研究中具有重要应用。然而，现有的方法在形式、复杂性和可重复性方面存在显著差异，且通常以固定实验方案的形式呈现，而非可灵活调整的实验框架。本研究通过整合并直接比较三种实验配置，建立了一种针对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的简单、易操作且灵活的卵孵化实验平台：（i）在微量离心管中进行受控孵育，随后接种至琼脂平板；（ii）在含药物的琼脂平板上直接暴露处理；（iii）基于多孔板的液体实验体系。实验中采用两种代表性化合物以展示该方法的应用效果：一种可抑制卵的孵化，另一种则无明显可检测的作用。每种配置在实验控制性、通量和可及性方面均具有独特优势。基于微量离心管的方法可实现对药物暴露的精确控制，适用于定量药理学分析；基于琼脂的实验方法操作简便、成本低廉，适合持续暴露处理及教学环境；多孔板格式则支持可扩展、标准化的高通量筛选，符合现代药物发现流程的需求。通过对这些格式的直接比较，我们阐明了方法学选择如何影响实验的可重复性、药物暴露动力学以及生物学结果的解读，尤其涉及特定发育阶段的相关因素，例如卵壳的保护作用以及分子靶点表达在发育过程中的变异。总体而言，本研究确立了秀丽隐杆线虫（C. elegans）卵孵化实验作为一种多功能且可扩展的实验平台，可适应多种应用场景，包括驱虫药物筛选、毒理学评估、发育生物学研究以及教学实验，从而促进该方法更广泛且更合理的使用。

引言

卵孵化实验（EHA）长期以来一直是线虫学中评估化学化合物杀卵活性及早期发育影响的核心方法。该方法最初为寄生性线虫设计，用于在受控条件下定量分析胚胎发育或幼虫孵化的抑制情况 体外 条件，提供诸如孵化率或浓度-反应分析（如EC）等稳健且具有生物学意义的终点指标₅₀ 或 IC₅₀)^{1,2,3,4,5,6,7}.

在捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）和蛇形毛圆线虫（Trichostrongylus colubriformis）等寄生性线虫中，传统的基于虫卵的研究方法已被广泛用于评估合成药物和天然产物的驱虫效果，并监测抗驱虫药耐药性^1,2,

方案

1. 秀丽隐杆线虫 品系与培养

1. 使用野生型 N2（Bristol）菌株和/或转基因菌株 PD4251（ccIs4251; dpy-20(e1282)）来建立并验证本方法^25,26。PD4251 表达 GFP，便于在需要时进行可视化观察和潜在的成像应用，且在本研究采用的实验条件下，其卵孵化和发育反应与野生型 N2 菌株无显著差异²⁷。
2. 从由美国国立卫生研究院研究基础设施项目资助的Caenorhabditis遗传中心（CGC）（P40 OD010440）获取菌株 （例如野生型 N2 菌株）。
3. 将线虫在标准实验室条件下，于 18–25 °C 的新鲜制备的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上培养，以大肠杆菌 OP50 作为食物来源。制备 NGM 时，将 16 g 琼脂、3 g NaCl 和 2.5 g 胰蛋白胨溶解于 975 mL 蒸馏水或超纯水中，高压灭菌。待培养基冷却至 55 °C 后，加入无菌的磷酸钾缓冲液（25 mL，1 M，pH 6.0）、CaCl₂（1 mL，1 M）、MgSO₄（1 mL，1 M）和胆固醇（1 mL，5 mg/mL，溶于无水乙醇）。充分混匀后，在无菌条件下倒平板。
4. 按照....

结果

TCA在所有实验条件下均表现出明显的浓度依赖性抑制卵孵化作用，如图1所示。每种检测配置的代表性浓度-反应曲线分别展示如下：微量离心管（图1A）、在琼脂平板上的直接暴露（图1B）以及多孔板（图1C）。

在微量离心管中测得的IC₅₀值为0.19 ± 0.0262 mM，在琼脂平板上为0.1758 ± 0.0463 mM，在多孔板中为0.2267 ± 0.0093 mM。这些数值作为每种检测方法所获得的浓度-反应关系的代表性示例展示。尽管观察到一些微小差异，但所有数值均落在相对较窄的范围内，表明不同实验配置之间具有整体一致性。重要的是，化合物特异性的反应可能随其理化性质和检测条件而变化；因此，这些数值不应被解释为在所有检测格式中对活性具有普遍预测性。

对照条件（水和DMSO）在所有实验条件下孵化率.......

讨论

本研究提出了一种针对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的简单且可适应的卵孵化检测平台，该平台基于三种互补的实验形式，分别在控制性、暴露动态和可扩展性方面有所不同。我们的结果支持这样一种观点：卵孵化检测应被视为一种灵活的方法学框架，可根据特定的实验目标进行调整，而非定义单一的最优方案。

基于微量离心管的实验体系为药物暴露提供了高度可控的环境，能够精确定义孵育时间、化合物浓度以及洗涤步骤。该配置特别适用于定量药理学分析和机制研究，因为它能够将暴露阶段与后续发育阶段分离开来。采用此体系获得的IC₅₀值（0.19 mM）反映了这些受控条件，其中化合物暴露时间受限，并在孵化前通过洗涤步骤降低残留药物水平。该设计最大限度地减少了因长期暴露带来的干扰效应，并有利于后续应用，例如将幼虫转移至接种细菌的培养板，以进一步评估其运动能力、生长情况或发育进程。类似地，将暴露阶段与恢复阶段分离的方法此前已在C. elegans药理学检测中得到应用^19,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌学琼脂	不列颠尼亚	B0101406	应新鲜配制（1.7 克溶于 100 毫升） H2O
漂白剂溶液	N/A	N/A	1.2 % (v/v) NaOH 和 0.5 M NaOH
离心	赛默飞世尔科技	Sorvall ST16R
离心	BiofugePICO 转移至离心管	Heraeus 75003235
数码相机	ToupCam	TP605100A	工业数字相机，可调焦距 USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	分子量：78.13
乙酸芳樟酯	SIGMA	CAS号：115-95-7	应新鲜配制
LB 培养基	N/A	N/A	10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，加去离子水至 1 L
M9 缓冲液	N/A	N/A	3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g  NaCl，0.25 g MgSO₄4 至1 L蒸馏水
小型旋转仪	BioSan	Bio RS-24
线虫生长培养基（NGM）	N/A	N/A	3 g NaCl，17 g 琼脂，2.5 g  将Bacto-Peptone加入1 L蒸馏水中，高压灭菌。添加1 mL胆固醇（5 mg/mL）。  1 mL CaCl₂ (1 M)、25 mL 磷酸钾缓冲液 (1 M, pH 6.0) 和 1 mL  MgSO4 (1 M)
培养皿（3 - 5 mm）	ThermoScientific. Nunclon Delta 表面	153066
培养皿（90 mm × 15 mm）	ExtraGene	1026160305	仅限实验室使用，聚苯乙烯。
移液器	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	版本 12.0
体视显微镜	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	三目体视显微镜（10×）–40倍总放大倍数；LED透射与反射照明
蔗糖	Cicarelli 实验室	艺术 841	60 %（v/v）蔗糖
96 孔组织培养板	生物膜	TCP 012096	聚苯乙烯，低蒸发盖。
ToupView	图普科技	N/A
反式肉桂醛（TCA）	Santa Cruz Biotechnology	J1712	应新鲜配制