网络药理学与实验研究：β-谷固醇通过糖皮质激素受体治疗慢性阻塞性肺疾病的机制

摘要

β-谷甾醇可缓解慢性阻塞性肺疾病（COPD），并增强地塞米松的疗效，该作用由糖皮质激素受体介导。此外，β-谷甾醇在香烟烟雾提取物刺激的支气管上皮细胞和香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型中均减轻了炎症、氧化应激和细胞衰老。

摘要

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的呼吸系统疾病，其特征为持续性炎症、氧化应激以及进行性肺功能下降。β-谷固醇在COPD中的治疗潜力尚不明确。本研究旨在探讨β-谷固醇对COPD的保护作用，并阐明其潜在机制。通过数据库筛选发现糖皮质激素受体（GR）可能是β-谷固醇的潜在作用靶点。本研究建立了香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型以及香烟烟雾提取物（CSE）刺激的BEAS-2B细胞模型。采用 （RT-qPCR）、DCFH-DA荧光探针法和细胞衰老检测试剂盒评估肺功能、肺损伤相关标志物、炎症、氧化应激及细胞衰老情况。同时评估了β-谷固醇单独使用或与地塞米松（DEX）联合使用的效应。结果显示，β-谷固醇在CSE刺激的BEAS-2B细胞和香烟烟雾暴露的小鼠中均显著改善肺功能，使肺损伤相关标志物恢复正常，并减轻炎症、氧化应激和细胞衰老。这些保护作用伴随GR表达的增加。此外，β-谷固醇增强了对DEX的反应性，联合使用β-谷固醇与DEX相较于单独使用DEX，在改善肺功能、肺损伤标志物、炎症、活性氧水平及细胞衰老方面效果更显著。综上所述，本研究结果提示，β-谷固醇至少部分通过上调GR表达并增强DEX的治疗效果，从而缓解COPD相关的病理改变，凸显其作为COPD治疗辅助策略的潜在价值。

引言

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种进行性呼吸系统疾病，其特征是持续的气道炎症、肺泡损伤和不可逆的气流受限，导致呼吸功能受损并降低生活质量¹。其患病率随年龄增长显著上升，65岁及以上人群的患病风险约为40岁以下人群的五倍²。这一人口学趋势与疾病发病率、死亡率和致残率的上升密切相关³。流行病学预测表明，到2030年，COPD可能成为全球第四大死因，约占全球总死亡人数的5%^4,5,6。目前，已知的危险因素包括遗传易感性、肺部发育异常、颗粒物暴露、慢性支气管炎以及呼吸道感染⁷。

在诸多危险因素中，香烟烟雾是慢性阻塞性肺疾病（COPD）最重要的致病因素⁸。香烟烟雾含有数千种化学物质，可导致支气管上皮损伤，促进炎性细胞浸润，并引起肺组织重塑⁹。长期暴露可诱发持续且不可逆的上皮损伤，促进大量促炎性趋化因子的释放，显著增加 (ROS) 的产生，并诱导细胞凋亡¹⁰。大量....

方案

本研究遵循《基础与临床药理学及毒理学》（Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology）关于实验与临床研究的指南²⁵。所有动物实验方案均经浙江大学医学院附属第二医院动物伦理委员会批准（批准号：20230102），所有实验操作均按照动物伦理委员会的指导原则进行。本研究符合ARRIVE指南的要求。

通过网络药理学筛选关键组分和靶点

从中药系统药理学数据库（TCMSP；访问时间：2024年3月12日）中获取了川贝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）、金银花（Lonicera japonica Thunb.）、北沙参（Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.）和南沙参（Adenophora stricta Miq.）的活性成分。根据以下ADME标准筛选候选化合物：口服生物利用度（OB）≥ 30%，类药性（DL）≥ 0.18，以及Caco-2细胞渗透性 ≥ −0.4²⁵。同时满足上述三项标准的化合物被保留作为后续分析的候选活性成分。

β-谷甾醇的规范简化分子线性输入规范（....

结果

β-谷甾醇是一种治疗慢性阻塞性肺疾病的潜在天然产物

由于报道显示川贝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）、忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花、海滨藜（Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.）的干燥根以及沙参（Adenophora stricta Miq.）在治疗肺部疾病方面具有显著疗效^35,36,37,38，本研究利用TCMSP数据库系统筛选上述中药的有效成分，发现β-谷甾醇是这些中药共有的重要活性成分（图1A）。为系统探究β-谷甾醇的潜在分子机制，从PubChem数据库获取其.......

讨论

慢性阻塞性肺疾病（COPD）造成了巨大的全球疾病负担，仍是世界范围内的重要健康挑战¹。目前对COPD的管理包括药物治疗和非药物干预措施⁴²。在药物治疗中，糖皮质激素（GCs）广泛用于慢性炎症性疾病。其作用机制是通过与糖皮质激素受体（GR）结合，并将组蛋白去乙酰化酶2招募至转录复合物中，从而逆转组蛋白乙酰化⁴³。然而，多项研究表明，COPD患者对GC的敏感性降低^44,45，且已有研究提供了该疾病中存在GC耐药性的证据⁴⁶。这些发现表明，克服GC耐药性是一项重要的临床挑战，凸显了开发新型治疗药物的迫切需求。因此，寻找更有效的COPD治疗方案具有重要意义。

既往研究表明，γ-谷甾醇对慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的支气管上皮细胞具有抗增殖作用^47<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BEAS-2B 人支气管上皮细胞	SunnCell， 中国	SC-0218	用于体外研究的人支气管上皮细胞系
C57BL/6 小鼠	维通利华实验动物有限公司，中国	213	用于体内 COPD 实验的动物模型
CB-DOCK2	中国	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	用于配体与受体蛋白之间的分子对接模拟
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	碧云天生物技术，中国	C0038	检测细胞活力与增殖能力
CellEvent™ 衰老绿色检测试剂盒	赛默飞世尔科技，美国	C10851	检测细胞衰老
香烟	红塔集团，中国	未提供	用于烟雾暴露及香烟烟雾提取物（CSE）制备
CTD	美国	https://ctdbase.org/	用于检索与 COPD 相关的基因
DCFH-DA 荧光探针	Sigma-Aldrich，美国	D6883-50MG	检测细胞内活性氧（ROS）水平
地塞米松（DEX）	翊圣生物，中国	40323ES03	用于联合干预的糖皮质激素
DMEM/F12 培养基	Gibco，美国	11330032	BEAS-2B 细胞培养的基础培养基
胎牛血清（FBS）	Gibco，美国	10270106	细胞培养基的补充成分
GraphPad Prism	GraphPad 软件公司，美国	9.3.1	数据统计分析与图表绘制
异氟烷	RWD 生命科学，中国	R510-22-10	用于动物安乐死的吸入性麻醉剂
脂质过氧化 MDA 检测试剂盒	碧云天生物技术，中国	S0131S	检测细胞内丙二醛（MDA）含量
Lipofectamine 2000	赛默飞世尔科技，美国	11668030	用于 siRNA 转染的转染试剂
多功能酶标仪	赛默飞世尔科技，美国	VL0000D0	检测吸光度与荧光值
Navios EX 流式细胞仪	贝克曼库尔特，美国	B80912	分析活性氧（ROS）与衰老细胞
青霉素/链霉素	HyClone，美国	SV30010	用于防止细菌污染的抗生素
Power SYBR™ Green Master Mix	赛默飞世尔科技，美国	4367659	荧光定量 PCR 扩增
PrimeScript™ RT 试剂盒	Takara， 日本	RR037Q	用于 cDNA 合成的逆转录反应
PubChem 数据库	美国	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	用于获取 β-谷甾醇的标准 SMILES 序列并下载其三维 SDF 结构信息
QuantStudio Dx PCR 仪	赛默飞世尔科技， 美国	4479889	实时 RT-qPCR 检测
RCSB PDB	美国	https://www.rcsb.org/	获取糖皮质激素受体（GR）晶体的三维结构文件
RNA/蛋白提取试剂盒	碧云天生物技术，中国	R0018S	从细胞和肺组织中提取总 RNA
si-GR	通过 siDirect 2.1 软件设计	定制合成	引导链：5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′； passenger 链：5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′，用于 GR 基因的沉默
si-NC	赛默飞世尔科技，美国	4390843	作为细胞和体内实验的阴性转染对照
SwissTargetPrediction 数据库	瑞士	http://swisstargetprediction.ch/	用于预测潜在的药物相关蛋白靶点（计算机模拟）
TCMSP 数据库	中国	https://www.tcmsp-e.com/	用于中药成分筛选与靶点预测
TTD	新加坡	https://db.idrblab.net/ttd/	用于收集已验证的与 COPD 相关的疾病基因
全身烟雾暴露舱	Teague Enterprise， 美国	TE-2	建立香烟烟雾诱导的 COPD 模型
β-谷甾醇	ChemicalBook，中国	83-46-5	用于药物治疗的活性植物甾醇