网络药理学与实验研究：β-谷固醇通过糖皮质激素受体治疗慢性阻塞性肺疾病的机制

摘要

β-谷甾醇可缓解慢性阻塞性肺疾病（COPD），并增强地塞米松的疗效，该作用由糖皮质激素受体介导。此外，β-谷甾醇在香烟烟雾提取物刺激的支气管上皮细胞和香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型中均减轻了炎症、氧化应激和细胞衰老。

摘要

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的呼吸系统疾病，其特征为持续性炎症、氧化应激以及进行性肺功能下降。β-谷固醇在COPD中的治疗潜力尚不明确。本研究旨在探讨β-谷固醇对COPD的保护作用，并阐明其潜在机制。通过数据库筛选发现糖皮质激素受体（GR）可能是β-谷固醇的潜在作用靶点。本研究建立了香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型以及香烟烟雾提取物（CSE）刺激的BEAS-2B细胞模型。采用 （RT-qPCR）、DCFH-DA荧光探针法和细胞衰老检测试剂盒评估肺功能、肺损伤相关标志物、炎症、氧化应激及细胞衰老情况。同时评估了β-谷固醇单独使用或与地塞米松（DEX）联合使用的效应。结果显示，β-谷固醇在CSE刺激的BEAS-2B细胞和香烟烟雾暴露的小鼠中均显著改善肺功能，使肺损伤相关标志物恢复正常，并减轻炎症、氧化应激和细胞衰老。这些保护作用伴随GR表达的增加。此外，β-谷固醇增强了对DEX的反应性，联合使用β-谷固醇与DEX相较于单独使用DEX，在改善肺功能、肺损伤标志物、炎症、活性氧水平及细胞衰老方面效果更显著。综上所述，本研究结果提示，β-谷固醇至少部分通过上调GR表达并增强DEX的治疗效果，从而缓解COPD相关的病理改变，凸显其作为COPD治疗辅助策略的潜在价值。

引言

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种进行性呼吸系统疾病，其特征是持续的气道炎症、肺泡损伤和不可逆的气流受限，导致呼吸功能受损并降低生活质量¹。其患病率随年龄增长显著上升，65岁及以上人群的患病风险约为40岁以下人群的五倍²。这一人口学趋势与疾病发病率、死亡率和致残率的上升密切相关³。流行病学预测表明，到2030年，COPD可能成为全球第四大死因，约占全球总死亡人数的5%^4,5,6。目前，已知的危险因素包括遗传易感性、肺部发育异常、颗粒物暴露、慢性支气管炎以及呼吸道感染⁷。

在诸多危险因素中，香烟烟雾是慢性阻塞性肺疾病（COPD）最重要的致病因素⁸。香烟烟雾含有数千种化学物质，可导致支气管上皮损伤，促进炎性细胞浸润，并引起肺组织重塑⁹。长期暴露可诱发持续且不可逆的上皮损伤，促进大量促炎性趋化因子的释放，显著增加 (ROS) 的产生，并诱导细胞凋亡¹⁰。大量研究表明，促炎性趋化因子（如白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））水平升高，伴随活性氧（ROS）的过度产生和细胞衰老，与COPD的严重程度密切相关^11,12。这凸显了开发能够有效且安全地调节这些关键致病因素的药物的重要性，以在COPD中发挥保护和治疗作用。

植物甾醇是普遍存在于植物细胞膜中的天然生物活性化合物。其中，β-谷甾醇含量最为丰富，广泛分布于富含脂质的植物性食物中，如蔬菜、坚果、种子和橄榄油^13,14,15,16。研究证实，在大鼠和小鼠中给予剂量高达1000 mg/kg的β-谷甾醇未发现与细胞毒性或遗传毒性相关的作用¹⁷。此外，研究表明，β-谷甾醇可通过影响抗氧化酶和人雌激素受体而表现出抗氧化特性¹⁸。

β-谷甾醇具有广泛的药理活性，包括抗炎¹⁹、解热²⁰、镇痛²¹以及抗糖尿病作用¹³。在多种疾病模型中，如结肠炎和肠道炎症，β-谷甾醇也显示出治疗潜力²²，并具有抗动脉粥样硬化²³和免疫调节特性²⁴。此外，其安全性良好。鉴于这些特性，β-谷甾醇作为潜在药物候选物已引起广泛关注。然而，其在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的确切作用及潜在机制仍尚不明确。

因此，本研究旨在探讨β-谷固醇在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的潜在治疗作用及其作用机制。具体而言，采用香烟烟雾提取物（CSE）诱导的BEAS-2B细胞损伤模型，评估β-谷固醇是否能有效缓解CSE介导的细胞损伤，从而为COPD的治疗策略鉴定一种新的候选分子。

方案

本研究遵循《基础与临床药理学及毒理学》（Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology）关于实验与临床研究的指南²⁵。所有动物实验方案均经浙江大学医学院附属第二医院动物伦理委员会批准（批准号：20230102），所有实验操作均按照动物伦理委员会的指导原则进行。本研究符合ARRIVE指南的要求。

通过网络药理学筛选关键组分和靶点

从中药系统药理学数据库（TCMSP；访问时间：2024年3月12日）中获取了川贝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）、金银花（Lonicera japonica Thunb.）、北沙参（Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.）和南沙参（Adenophora stricta Miq.）的活性成分。根据以下ADME标准筛选候选化合物：口服生物利用度（OB）≥ 30%，类药性（DL）≥ 0.18，以及Caco-2细胞渗透性 ≥ −0.4²⁵。同时满足上述三项标准的化合物被保留作为后续分析的候选活性成分。

β-谷甾醇的规范简化分子线性输入规范（SMILES）结构取自 PubChem（访问于 2024 年 3 月 18 日），并导入 SwissTargetPrediction（访问于 2024 年 3 月 21 日）进行靶点预测。选择智人（Homo sapiens）作为目标物种。根据 β-谷甾醇与数据库中已知配体在二维和三维结构上的相似性，预测其潜在作用靶点。保留预测概率大于 0 的靶点，并去除重复条目。

使用关键词“慢性阻塞性肺疾病”从治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database, TTD；访问时间：2024年3月25日）和比较毒物基因组学数据库（Comparative Toxicogenomics Database, CTD；访问时间：2024年3月28日）中检索与慢性阻塞性肺疾病（COPD）相关的基因。去除重复基因后，将COPD相关基因与预测的β-谷甾醇作用靶点取交集，以鉴定可能参与β-谷甾醇对抗COPD治疗作用的候选靶点。

β-谷甾醇与GR的分子对接

β-谷甾醇的三维结构（SDF格式）从PubChem数据库中获取（访问日期：2026年6月2日），而糖皮质激素受体（GR）的晶体结构则来自结构生物信息学研究协作蛋白质数据库（RCSB PDB；访问日期：2026年6月3日）。在对配体和受体结构进行标准预处理后，使用CB-Dock2在线平台（访问日期：2026年6月3日）进行分子对接。将预处理后的配体和受体文件上传至该平台，并采用默认参数进行对接计算。

基因本体（Gene Ontology, GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）的功能富集分析

对β-谷甾醇的所有预测靶基因进行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。富集结果，包括显著富集的生物过程、细胞组分、分子功能及信号通路，已整理并存储于补充文件1中，供后续生物信息学分析使用。

动物模型建立与分组

每组样本量设定为六只动物，该设定基于先前一项研究，该研究使用 G*Power 软件进行事前功效分析（α = 0.05，功效 = 0.80），结果表明在相似的实验条件下，n = 6 已足以检测出具有生物学意义的差异²⁶。将6至8周龄、体重为20 ± 2 g的雄性C57BL/6小鼠随机分为五组：对照组、慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型组、COPD + 地塞米松（DEX）组、COPD + β-谷固醇组以及COPD + DEX + β-谷固醇组。小鼠饲养于标准实验室条件下（25 °C，12小时光照/黑暗循环），可自由摄取标准饲料和水，并在实验开始前适应环境1周。

为建立慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型，将小鼠置于全身香烟烟雾暴露箱（63 cm × 55 cm × 45 cm）中，每天进行两次（每周5天）主流香烟烟雾暴露，每次于上午9:30和下午3:00进行，连续暴露12周。每支香烟含有10 mg焦油、0.9 mg尼古丁和10 mg一氧化碳。每次暴露持续90分钟，烟雾由18支香烟产生并导入暴露箱中²⁷。

为评估干预措施的治疗效果，药物干预在香烟烟雾暴露8周后开始，并持续至后续的4周。从第9周开始，各治疗组小鼠在每天香烟烟雾暴露前1小时，接受每日一次的经口胃内给药，分别给予地塞米松（DEX，1 mg/kg）²⁸ 或 β-谷固醇（β-sitosterol，50 mg/kg）^29,30。既往药代动力学研究报道，β-谷固醇在啮齿类动物中的口服生物利用度约为4%³¹。此外，已有多个小鼠研究采用20至50 mg/kg剂量范围的β-谷固醇³²。因此，选择50 mg/kg的剂量旨在确保足够的全身暴露水平，同时保持在临床前研究中常用的剂量范围内。

对照组小鼠暴露于过滤后的室内空气中，而模型组和治疗组小鼠则接受等体积的生理盐水作为溶剂。实验周期结束时，小鼠通过吸入异氟烷进行深度麻醉，直至足底反射消失，并通过腹主动脉放血法实施安乐死。立即打开胸腔，仔细分离完整双侧肺组织，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后置于冰上。为收集支气管肺泡灌洗液（BALF），对气管进行插管，用冷的无菌PBS反复灌洗，轻柔注入并回抽以收集灌洗液。肺组织和BALF样本均保持在冰上，随后进行后续分析处理。

BEAS-2B 细胞培养

BEAS-2B 人支气管上皮细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基/F12（DMEM/F12）中培养，培养条件为 37 °C、5% CO₂ 环境。

CSE 制备及 BEAS-2B 细胞暴露

BEAS‑2B 细胞用磷酸盐缓冲液洗涤后，以每孔 5 × 10⁴ 个细胞的密度接种于 24 孔板中，每组设三个重复孔。培养 12 小时后，细胞汇合度达到约 60%，随后暴露于香烟烟雾提取物（CSE）中。CSE 按照先前所述方法新鲜配制，并稍作修改³³。简言之，将一支未过滤的市售香烟持续燃烧，利用真空泵以 1.05 L/min 的恒定流速（约 −11 kPa 负压）将主流烟雾通入 10 mL 无血清培养基中，持续约 5 分钟，直至香烟完全燃尽。所得溶液首先进行预过滤以去除较大的颗粒杂质，再通过 0.22 µm 无菌微孔滤膜过滤以清除残留颗粒；所得原液定义为 100% CSE。所有新鲜制备的 CSE 均在过滤后立即用于细胞处理，不进行储存。细胞用含 2.5% CSE 的培养基进行刺激。CSE 处理 24 小时后，收集培养上清液并储存在 -40 °C 用于后续分析³⁴。

定量实时聚合酶链式反应（RT‑qPCR）

使用总RNA提取试剂盒从BEAS-2B细胞中提取总RNA，并根据制造商说明书利用逆转录试剂盒将其反转录为cDNA。随后使用实时PCR检测系统和基于SYBR Green的qPCR预混液进行RT-qPCR 检测。所有RT-qPCR实验均对每个样本设置三个生物学重复和三个技术重复，以确保数据的可靠性。

每个qPCR反应的总体积为20 µL，包含10 µL SYBR Green qPCR预混液、0.4 µL正向引物、0.4 µL反向引物、2 µL稀释后的cDNA模板以及7.2 µL无RNase的水。扩增条件如下：95 °C预变性3分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性10秒，以及60 °C退火/延伸30秒。相对基因表达水平采用 2^−ΔΔCt 法计算，以GAPDH作为内参基因。本研究中所用引物序列见补充表1。

细胞内活性氧（ROS）分析

细胞内活性氧 使用荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测BEAS-2B细胞中的活性氧生成，并通过流式细胞术进行分析。在流式细胞术数据采集过程中，采用标准的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设门策略，以排除细胞碎片并选择完整单细胞。每份样本采集总计10,000个有效细胞事件。激发波长和发射波长分别设定为488 nm和525 nm。随后分析流式细胞术数据，以定量细胞内活性氧的荧光强度。

丙二醛（MDA）水平测定

根据制造商说明书，使用脂质过氧化检测试剂盒测定细胞内丙二醛（MDA）含量。简言之，收集经处理的BEAS-2B细胞并进行裂解，随后在低温下离心以收集上清液。然后进行硫代巴比妥酸（TBA）比色反应，并使用酶标仪在532 nm处测定吸光度。根据标准曲线计算相对MDA水平。

细胞衰老评估

采用基于衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的衰老检测试剂盒评估细胞衰老。通过流式细胞术定量SA-β-gal阳性细胞。同时，采用RT-qPCR检测衰老相关标志物p53和p21的mRNA表达水平。

细胞增殖检测

采用比色法细胞活力检测试剂盒评估细胞增殖。使用酶标仪在450 nm处测量吸光度。

GR 基因敲低实验

采用基于脂质的转染试剂进行细胞转染。转染的寡核苷酸包括：靶向糖皮质激素受体的小干扰RNA（si-GR）和阴性对照小干扰RNA（si-NC）。靶向GR的候选siRNA序列使用在线生物信息学平台siDirect 2.0设计。转染后，细胞培养48小时，所有siRNA的终浓度均为50 nM。通过RT-qPCR检测GR mRNA的表达水平，验证基因敲低效率。

在β-谷固醇处理和转染实验中均设置了溶剂对照组。对于β-谷固醇干预，仅用溶剂处理的细胞作为溶剂对照组（记为CSE+0）。统计分析证实，溶剂对照组与空白对照组之间无显著差异。

统计分析

所有定量结果均表示为三次生物学独立实验的均值 ± 标准差 体外 实验。统计分析使用统计分析软件进行。在统计检验前，采用Shapiro-Wilk检验来评估数据集分布的正态性；采用Bonferroni事后校正进行调整 P 方差分析（ANOVA）后用于多重比较的显著性检验。两组之间的比较采用非配对Student t检验，而多组比较则采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）。A pP 值 ≤ 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

β-谷甾醇是一种治疗慢性阻塞性肺疾病的潜在天然产物

由于川贝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）、忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花、北沙参（Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.）的干燥根以及杏叶沙参（Adenophora stricta Miq.）在治疗肺部疾病方面具有已报道的疗效^35,36,37,38，本研究利用TCMSP数据库系统筛选这些中药的有效成分，发现β-谷甾醇是这些中药共有的重要活性成分（图1A）。为系统探究β-谷甾醇的潜在分子机制，从PubChem数据库获取其SMILES结构信息，并导入SwissTargetPrediction数据库进行靶点预测；保留所有预测概率大于0的靶点用于后续分析。β-谷甾醇与其候选靶点之间的成分-靶点相互作用网络被可视化并展示于图1B。通过SwissTargetPrediction数据库共预测出43个β-谷甾醇的潜在靶基因。随后对β-谷甾醇的靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，所有完整的富集数据均存档于补充文件1中。值得注意的是，类固醇代谢过程被识别为显著富集的通路之一。已有大量文献表明，类固醇代谢异常与慢性阻塞性肺疾病（COPD）中糖皮质激素抵抗密切相关³⁹。此外，糖皮质激素受体（GR）在类固醇代谢相关功能簇中显著富集。该结果为后续开展的细胞实验提供了关键的生物信息学依据，用以研究β-谷甾醇改善地塞米松（DEX）敏感性及调节GR表达水平的作用机制。

与慢性阻塞性肺疾病（COPD）相关的基因从TTD和CTD数据库中获取。随后的维恩交集分析（图1C）显示，β-谷固醇作用靶点与TTD来源的COPD相关基因之间存在两个重叠基因，β-谷固醇靶点与CTD来源的COPD相关基因之间也存在两个重叠基因，而TTD与CTD数据集之间共有五个共同的COPD相关基因。最终，糖皮质激素受体（GR）是唯一在三个数据集中均存在的共同基因，被定义为β-谷固醇抗COPD的核心靶点。维恩分析的详细数值数据见补充文件2。为进一步验证结合亲和力，进行了β-谷固醇与GR的分子对接分析（图1D）。结合位点的Vina评分低于−7.0 kcal/mol时被认为具有良好的结合亲和力。C1和C5位点的Vina评分分别为−8.8和−7.2 kcal/mol，表明β-谷固醇与GR之间具有较强的预测结合相互作用。

β-谷甾醇可保护BEAS-2B细胞免受CSE损伤，该作用可能与GR表达水平升高有关

β-谷甾醇在CSE诱导的BEAS-2B细胞损伤模型中表现出显著的保护作用。CSE + 0组作为溶剂对照组，接受CSE处理并同时加入等体积不含β-谷甾醇的药物溶剂。如预期所示，CSE组与CSE + 0组之间未观察到显著差异。该化合物以浓度依赖性方式抑制CSE诱导的TNF-α和IL-6生成（图2A），并降低细胞内ROS水平（图2B）。β-谷甾醇还显著降低MDA含量（图2C），抑制CSE诱导的细胞衰老（图2D），并下调衰老相关标志物p53和p21的表达（图2E）。这些效应伴随GR mRNA表达上调（图2F），提示其保护作用可能与GR的转录水平上调密切相关。在测试的浓度范围内，β-谷甾醇对BEAS‑2B细胞活力未表现出明显细胞毒性（图2G），表明该化合物具有良好的细胞耐受性。鉴于20 µg/mL（约48.2 µM）浓度表现出最强的抑制效果，后续实验选择该剂量。尽管在抑制促炎细胞因子方面，10 µg/mL与20 µg/mL组之间未观察到统计学显著差异，但20 µg/mL的β-谷甾醇在炎症因子水平上呈现轻微下降趋势。此外，与10 µg/mL相比，20 µg/mL在抑制CSE诱导的ROS和MDA积累、减少细胞衰老以及上调GR mRNA表达方面表现出更优的效应。因此，选择20 µg/mL作为后续挽救实验的最优工作浓度。

RT-qPCR 结果（图 2H）证实了 GR 基因敲低成功。与 si-NC 对照组相比，si-GR 组的 GR mRNA 水平降低了约 78%，验证了 GR 沉默在后续挽救实验中的有效性。在 GR 敲低后，β-谷甾醇对炎症因子和活性氧（ROS）的抑制作用显著被逆转（图 2I、J）。同样，β-谷甾醇对细胞衰老的缓解作用也被消除（图 2K）。综上所述，这些结果表明，β-谷甾醇通过 GR 介导的抗炎、抗氧化和抗衰老机制，在香烟烟雾提取物（CSE）诱导的支气管上皮细胞损伤中发挥了保护作用。

β-谷甾醇增强了地塞米松在COPD小鼠模型中对肺功能和炎症的治疗效果

在通过香烟烟雾暴露建立的慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型中，β-谷固醇、DEX 或其联合治疗均表现出明显的保护作用。多组间的统计学比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。使用五种不同的符号样式来区分实验队列：圆形代表对照组，三角形代表模型组，星号代表模型+DEX组，正方形代表模型+β-谷固醇组，菱形代表模型+DEX+β-谷固醇组。每条水平括号表示两个相连实验组之间的统计学比较。

与对照组相比，COPD模型组小鼠的0.1秒用力呼气容积（FEV₀.₁）、用力肺活量（FVC）、峰值呼气流速（PEF）以及FEV₀.₁/FVC比值均显著降低。如图3A–D所示，FEV₀.₁/FVC比值低于70%证实COPD模型成功建立。单独给予DEX或β-谷固醇均能显著逆转模型小鼠的肺功能损伤，而联合给药较单药治疗进一步改善了上述指标。此外，MMP-9/TIMP-1比值的改变是气道重塑的特征性分子标志，MUC5AC表达升高则代表黏液过度分泌^40,41。我们进一步检测了MMP-9、TIMP-1及黏液标志物MUC5AC的mRNA水平，并计算了MMP-9/TIMP-1比值（图3E、F）。模型组小鼠MMP-9/TIMP-1比值显著升高，MUC5AC表达亦上调。DEX或β-谷固醇单药治疗均能有效降低这两项指标，而联合治疗相比单药治疗表现出更优的抑制效果。

与对照小鼠相比，COPD模型小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α和IL-6水平显著升高，肺组织活性氧（ROS）含量也增加。单独使用DEX或β-谷固醇均可显著降低炎症细胞因子水平和氧化应激，而联合治疗的抑制作用更强（图3G，H）。此外，COPD模型小鼠肺组织中糖皮质激素受体（GR）mRNA表达明显下调。单独使用DEX或β-谷固醇均可显著上调GR表达，联合治疗进一步提高了GR水平（图3I）。

综上所述，这些研究结果表明，β-谷固醇通过维持肺功能、抑制炎症、缓解氧化应激以及上调GR表达，对小鼠慢性阻塞性肺疾病相关的病理改变具有保护作用。此外，在该模型中，β-谷固醇与DEX联合使用可增强DEX的保护效果。

β-谷甾醇通过调节CSE诱导的BEAS-2B细胞模型中的GR通路，可能增强了地塞米松的治疗效果

在CSE诱导的BEAS-2B细胞模型中，DEX单药治疗显著下调了促炎性细胞因子的mRNA表达，降低了细胞内ROS和MDA水平，并减少了衰老细胞的比例以及衰老标志物p53和p21的表达。这些结果证实了DEX具有抗炎、抗氧化和抗细胞衰老的活性。值得注意的是，联合使用β-谷固醇可进一步增强DEX的保护作用，与DEX单药治疗相比，对炎症、氧化应激和细胞衰老的抑制作用更强。在DEX联合β-谷固醇治疗组中进行GR基因敲低（si-GR）后，细胞对联合治疗的反应明显减弱。如图4A–E所示，DEX与β-谷固醇共同介导的对炎症、氧化应激和细胞衰老的抑制作用显著被逆转，表明GR缺失削弱了β-谷固醇对DEX疗效的增效作用。

综上所述，这些研究结果表明，β-谷甾醇可能通过调控糖皮质激素受体（GR）相关过程来增强地塞米松（DEX）的疗效，从而加强DEX对香烟烟雾提取物（CSE）诱导的支气管上皮细胞损伤的保护作用。

数据可用性：

本研究结论所依据的所有原始数据均提供在补充材料中（补充文件1，补充文件2）。

图1：β-谷甾醇在慢性阻塞性肺疾病（COPD）治疗中的关键作用。（A）通过TCMSP数据库筛选川贝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）、忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花以及南沙参（Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.）和北沙参（Adenophora stricta Miq.）的干燥根中的活性成分。（B）β-谷甾醇的潜在作用靶点。（C）β-谷甾醇下游靶点与COPD相关基因的交集分析。（D）β-谷甾醇与糖皮质激素受体（GR）蛋白之间的分子对接分析。请点击此处查看该图的高清版本。

图2糖皮质激素受体在β-谷甾醇拮抗香烟烟雾提取物诱导的细胞损伤中的作用 (A) β-谷甾醇对CSE诱导的炎症介质（TNF-α、IL-6）的浓度依赖性调节。B) β-谷甾醇对CSE暴露细胞中ROS水平的剂量效应。C) β-谷甾醇对CSE上调的MDA含量的影响。Dβ-谷甾醇对CSE诱导的细胞衰老的影响E) β-谷甾醇在香烟烟雾提取物刺激下对衰老相关p53和p21的调控作用。F在CSE刺激下β-谷固醇浓度依赖性调控GR表达。GBEAS-2B细胞中β-谷甾醇在测试浓度范围内的细胞活力。H) 转染靶向GR的siRNA后，通过RT-qPCR检测GR mRNA表达以验证基因敲低效率。我GR与β-谷甾醇对CSE诱导的炎症因子的调控关联。JGR与β-谷甾醇在抑制CSE诱导的ROS累积中的调控关联。KGR与β-谷甾醇在抵抗CSE诱导的细胞衰老中的调控关联。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001；ns，无显著性差异。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3β-谷甾醇联合地塞米松对COPD模型小鼠肺功能、炎症、氧化应激及GR表达的影响 (A) 慢性阻塞性肺疾病小鼠0.1秒用力呼气容积（FEV₀.₁）的变化。B) 慢性阻塞性肺疾病小鼠用力肺活量（FVC）的变化。C) 慢性阻塞性肺疾病小鼠峰值呼气流速（PEF）的影响。D) COPD 模型小鼠中的 FEV₀.₁/FVC 比值。E) 反映气道重塑的 MMP-9/TIMP-1 相对 mRNA 比值。F小鼠肺组织中 MUC5AC 的相对 mRNA 表达水平表明黏液过度分泌。 (G) 支气管肺泡灌洗液（BALF）中 TNF-α 和 IL-6 的水平。H) COPD小鼠肺组织中ROS的产生。 (我) 小鼠肺组织中GR的相对mRNA表达水平。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. 请点击此处以查看此图的放大版本。

图4β-谷甾醇对CSE诱导的BEAS-2B细胞中GR介导的DEX耐药性的影响 (A) 各组炎症因子（TNF-α、IL-6）mRNA 的相对表达水平。B) 各组中的ROS水平。 (C) 各实验组中 MDA 含量。 (D各组中衰老的BEAS-2B细胞百分比。Ep53 和 p21 衰老相关标志物的相对 mRNA 水平。**p < 0.01; ***p < 0.001. 请点击此处查看此图的放大版本。

补充表 1：用于 RT-qPCR 分析的引物序列。请点击此处下载该文件。

补充文件 1：β-谷固醇靶基因的完整 GO 和 KEGG 富集分析数据集。请点击此处下载该文件。

补充文件2：Venn分析的详细数值结果，用于鉴定β-谷甾醇与慢性阻塞性肺疾病（COPD）之间的共同作用靶点。请点击此处下载该文件。

讨论

慢性阻塞性肺疾病（COPD）造成了巨大的全球疾病负担，仍是世界范围内的重要健康挑战¹。目前对COPD的管理包括药物治疗和非药物干预措施⁴²。在药物治疗中，糖皮质激素（GCs）广泛用于慢性炎症性疾病。其作用机制是通过与糖皮质激素受体（GR）结合，并将组蛋白去乙酰化酶2招募至转录复合物中，从而逆转组蛋白乙酰化⁴³。然而，多项研究表明，COPD患者对GC的敏感性降低^44,45，且已有研究提供了该疾病中存在GC耐药性的证据⁴⁶。这些发现表明，克服GC耐药性是一项重要的临床挑战，凸显了开发新型治疗药物的迫切需求。因此，寻找更有效的COPD治疗方案具有重要意义。

既往研究表明，γ-谷甾醇对慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的支气管上皮细胞具有抗增殖作用⁴⁷。由于γ-谷甾醇和β-谷甾醇均为植物甾醇中常见的生物活性成分，本研究进一步拓展了目前对植物甾醇在COPD中作用机制的认识，并凸显了β-谷甾醇在疾病发病过程中的潜在保护价值。我们的研究结果显示，β-谷甾醇显著抑制了炎症因子的释放，减轻了氧化应激，并抑制了细胞衰老。这与早期报道一致，即β-谷甾醇能有效抑制脂多糖诱导的炎症介质（如IL-6、诱导型一氧化氮合酶和TNF-α）的上调⁴⁸。这些发现证实了其抗炎活性，并表明其在不同炎症模型中具有作用的一致性。

吸入性糖皮质激素（GCs）是控制气道炎症的有效抗炎药物，其主要通过结合并激活糖皮质激素受体（GR⁴⁹）发挥作用。然而，慢性阻塞性肺疾病（COPD）的一个关键病理特征是细胞对GCs抗炎作用的敏感性降低⁴⁴。糖皮质激素受体（GR）的下调或功能受损被认为是导致COPD患者出现GC抵抗的主要机制之一⁵⁰。既往研究表明，某些药物可增强GC的敏感性。例如，阿奇霉素与布地奈德联合使用对IL‑4和CXCL8产生的抑制作用显著强于任一单药⁵¹。

值得注意的是，本研究发现，在香烟烟雾暴露的COPD小鼠模型和CSE诱导的BEAS-2B细胞模型中，β-谷固醇与DEX联合使用对炎症因子、氧化应激和细胞衰老的抑制作用均显著强于单独使用DEX。该联合处理还显著增强了DEX对小鼠COPD相关病理改变及支气管上皮细胞损伤的保护作用。该结果提示，β-谷固醇可能提高支气管上皮细胞对DEX的敏感性，为解决部分COPD患者中糖皮质激素不敏感或耐药问题提供了新思路。与 体外 定量PCR结果显示，β-谷甾醇以浓度依赖的方式提高糖皮质激素受体（GR）mRNA水平，而非直接作为GR激动剂或拮抗剂发挥作用。经验证的si-GR敲低效率及后续功能挽救实验进一步证实，β-谷甾醇通过增加细胞内总GR水平来增强细胞对糖皮质激素的反应性，而非直接激活GR，因此与经典的GR激动剂地塞米松（DEX）联用时可产生更强的治疗效应。据此，GR表达水平的变化可能与β-谷甾醇的作用相关，这与先前观察到的慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者气道平滑肌细胞中GR及其活性亚型GRα显著降低的现象一致。⁵²重要的是，GR 沉默实验进一步揭示了该受体在β-谷固醇介导的细胞保护作用中的核心作用，表明β-谷固醇的某些生物学功能依赖于GR通路的完整性。

综上所述，本研究不仅揭示了糖皮质激素受体（GR）可能在β-谷甾醇干预慢性阻塞性肺疾病（COPD）中发挥关键介导作用，而且为克服临床中地塞米松（DEX）耐药性的难题提供了潜在的新策略，为开发靶向GR通路的天然辅助疗法奠定了实验基础。

然而，本研究存在若干局限性。首先，肺功能检测仅用于确认慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型的成功建立，未进行苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色以进一步验证肺气肿、气道重塑和黏液高分泌等典型病理特征。由于此前实验已耗尽所有固定的肺组织标本，在本研究周期内无法重建12周香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型。为部分弥补这一局限，本研究利用保存的肺组织RNA样本，定量检测了MMP-9/TIMP-1比值和MUC5AC mRNA的表达水平。其次，体内实验仅评估了β-谷固醇与DEX 的单一联合剂量，未系统研究剂量-效应关系或协同作用。未来有必要开展包含多种剂量组合的研究，以明确潜在的协同效应。第三，由于实验条件和研究成本的限制，每组仅纳入六只小鼠。相对较小的样本量可能增加了个体间变异的敏感性，并限制了研究结果的统计学效力。未来需要更大样本量的研究进一步验证本研究结果。第四，未建立稳定的DEX耐药细胞系，因此无法直接评估β-谷固醇逆转已建立的糖皮质激素耐药性的能力。还需利用经过验证的糖皮质激素耐药模型开展进一步研究，以深入探讨这一潜在机制。

综上所述，这些研究结果表明，GR信号通路可能参与了β-谷甾醇对CSE诱导的BEAS-2B细胞损伤的保护作用，包括抑制炎症因子释放、氧化应激和细胞衰老，以及改善肺功能和肺损伤生物标志物。此外，β-谷甾醇增强了这些细胞对地塞米松（DEX）的治疗敏感性。综合来看，这些发现表明β-谷甾醇是一种潜在的天然候选分子，可能有助于开发慢性阻塞性肺疾病（COPD）的新型治疗策略。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BEAS-2B 人支气管上皮细胞	SunnCell， 中国	SC-0218	用于体外研究的人支气管上皮细胞系
C57BL/6 小鼠	维通利华实验动物有限公司，中国	213	用于体内 COPD 实验的动物模型
CB-DOCK2	中国	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	用于配体与受体蛋白之间的分子对接模拟
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	碧云天生物技术，中国	C0038	检测细胞活力与增殖能力
CellEvent™ 衰老绿色检测试剂盒	赛默飞世尔科技，美国	C10851	检测细胞衰老
香烟	红塔集团，中国	未提供	用于烟雾暴露及香烟烟雾提取物（CSE）制备
CTD	美国	https://ctdbase.org/	用于检索与 COPD 相关的基因
DCFH-DA 荧光探针	Sigma-Aldrich，美国	D6883-50MG	检测细胞内活性氧（ROS）水平
地塞米松（DEX）	翊圣生物，中国	40323ES03	用于联合干预的糖皮质激素
DMEM/F12 培养基	Gibco，美国	11330032	BEAS-2B 细胞培养的基础培养基
胎牛血清（FBS）	Gibco，美国	10270106	细胞培养基的补充成分
GraphPad Prism	GraphPad 软件公司，美国	9.3.1	数据统计分析与图表绘制
异氟烷	RWD 生命科学，中国	R510-22-10	用于动物安乐死的吸入性麻醉剂
脂质过氧化 MDA 检测试剂盒	碧云天生物技术，中国	S0131S	检测细胞内丙二醛（MDA）含量
Lipofectamine 2000	赛默飞世尔科技，美国	11668030	用于 siRNA 转染的转染试剂
多功能酶标仪	赛默飞世尔科技，美国	VL0000D0	检测吸光度与荧光值
Navios EX 流式细胞仪	贝克曼库尔特，美国	B80912	分析活性氧（ROS）与衰老细胞
青霉素/链霉素	HyClone，美国	SV30010	用于防止细菌污染的抗生素
Power SYBR™ Green Master Mix	赛默飞世尔科技，美国	4367659	荧光定量 PCR 扩增
PrimeScript™ RT 试剂盒	Takara， 日本	RR037Q	用于 cDNA 合成的逆转录反应
PubChem 数据库	美国	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	用于获取 β-谷甾醇的标准 SMILES 序列并下载其三维 SDF 结构信息
QuantStudio Dx PCR 仪	赛默飞世尔科技， 美国	4479889	实时 RT-qPCR 检测
RCSB PDB	美国	https://www.rcsb.org/	获取糖皮质激素受体（GR）晶体的三维结构文件
RNA/蛋白提取试剂盒	碧云天生物技术，中国	R0018S	从细胞和肺组织中提取总 RNA
si-GR	通过 siDirect 2.1 软件设计	定制合成	引导链：5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′； passenger 链：5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′，用于 GR 基因的沉默
si-NC	赛默飞世尔科技，美国	4390843	作为细胞和体内实验的阴性转染对照
SwissTargetPrediction 数据库	瑞士	http://swisstargetprediction.ch/	用于预测潜在的药物相关蛋白靶点（计算机模拟）
TCMSP 数据库	中国	https://www.tcmsp-e.com/	用于中药成分筛选与靶点预测
TTD	新加坡	https://db.idrblab.net/ttd/	用于收集已验证的与 COPD 相关的疾病基因
全身烟雾暴露舱	Teague Enterprise， 美国	TE-2	建立香烟烟雾诱导的 COPD 模型
β-谷甾醇	ChemicalBook，中国	83-46-5	用于药物治疗的活性植物甾醇