β-谷甾醇可缓解慢性阻塞性肺疾病（COPD），并增强地塞米松的疗效，该作用由糖皮质激素受体介导。此外，β-谷甾醇在香烟烟雾提取物刺激的支气管上皮细胞和香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型中均减轻了炎症、氧化应激和细胞衰老。
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研究文章
* These authors contributed equally
β-谷甾醇可缓解慢性阻塞性肺疾病（COPD），并增强地塞米松的疗效，该作用由糖皮质激素受体介导。此外，β-谷甾醇在香烟烟雾提取物刺激的支气管上皮细胞和香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型中均减轻了炎症、氧化应激和细胞衰老。
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的呼吸系统疾病，其特征为持续性炎症、氧化应激以及进行性肺功能下降。β-谷固醇在COPD中的治疗潜力尚不明确。本研究旨在探讨β-谷固醇对COPD的保护作用，并阐明其潜在机制。通过数据库筛选发现糖皮质激素受体（GR）可能是β-谷固醇的潜在作用靶点。本研究建立了香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型以及香烟烟雾提取物（CSE）刺激的BEAS-2B细胞模型。采用 （RT-qPCR）、DCFH-DA荧光探针法和细胞衰老检测试剂盒评估肺功能、肺损伤相关标志物、炎症、氧化应激及细胞衰老情况。同时评估了β-谷固醇单独使用或与地塞米松（DEX）联合使用的效应。结果显示，β-谷固醇在CSE刺激的BEAS-2B细胞和香烟烟雾暴露的小鼠中均显著改善肺功能，使肺损伤相关标志物恢复正常，并减轻炎症、氧化应激和细胞衰老。这些保护作用伴随GR表达的增加。此外，β-谷固醇增强了对DEX的反应性，联合使用β-谷固醇与DEX相较于单独使用DEX，在改善肺功能、肺损伤标志物、炎症、活性氧水平及细胞衰老方面效果更显著。综上所述，本研究结果提示，β-谷固醇至少部分通过上调GR表达并增强DEX的治疗效果，从而缓解COPD相关的病理改变，凸显其作为COPD治疗辅助策略的潜在价值。
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种进行性呼吸系统疾病，其特征是持续的气道炎症、肺泡损伤和不可逆的气流受限，导致呼吸功能受损并降低生活质量1。其患病率随年龄增长显著上升，65岁及以上人群的患病风险约为40岁以下人群的五倍2。这一人口学趋势与疾病发病率、死亡率和致残率的上升密切相关3。流行病学预测表明，到2030年，COPD可能成为全球第四大死因，约占全球总死亡人数的5%4,5,6。目前，已知的危险因素包括遗传易感性、肺部发育异常、颗粒物暴露、慢性支气管炎以及呼吸道感染7。
在诸多危险因素中，香烟烟雾是慢性阻塞性肺疾病（COPD）最重要的致病因素8。香烟烟雾含有数千种化学物质，可导致支气管上皮损伤，促进炎性细胞浸润，并引起肺组织重塑9。长期暴露可诱发持续且不可逆的上皮损伤，促进大量促炎性趋化因子的释放，显著增加 (ROS) 的产生，并诱导细胞凋亡10。大量研究表明，促炎性趋化因子（如白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））水平升高，伴随活性氧（ROS）的过度产生和细胞衰老，与COPD的严重程度密切相关11,12。这凸显了开发能够有效且安全地调节这些关键致病因素的药物的重要性，以在COPD中发挥保护和治疗作用。
植物甾醇是普遍存在于植物细胞膜中的天然生物活性化合物。其中，β-谷甾醇含量最为丰富，广泛分布于富含脂质的植物性食物中，如蔬菜、坚果、种子和橄榄油13,14,15,16。研究证实，在大鼠和小鼠中给予剂量高达1000 mg/kg的β-谷甾醇未发现与细胞毒性或遗传毒性相关的作用17。此外，研究表明，β-谷甾醇可通过影响抗氧化酶和人雌激素受体而表现出抗氧化特性18。
β-谷甾醇具有广泛的药理活性，包括抗炎19、解热20、镇痛21以及抗糖尿病作用13。在多种疾病模型中，如结肠炎和肠道炎症，β-谷甾醇也显示出治疗潜力22，并具有抗动脉粥样硬化23和免疫调节特性24。此外，其安全性良好。鉴于这些特性，β-谷甾醇作为潜在药物候选物已引起广泛关注。然而，其在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的确切作用及潜在机制仍尚不明确。
因此，本研究旨在探讨β-谷固醇在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的潜在治疗作用及其作用机制。具体而言，采用香烟烟雾提取物（CSE）诱导的BEAS-2B细胞损伤模型，评估β-谷固醇是否能有效缓解CSE介导的细胞损伤，从而为COPD的治疗策略鉴定一种新的候选分子。
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本研究遵循《基础与临床药理学及毒理学》（Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology）关于实验与临床研究的指南25。所有动物实验方案均经浙江大学医学院附属第二医院动物伦理委员会批准（批准号：20230102），所有实验操作均按照动物伦理委员会的指导原则进行。本研究符合ARRIVE指南的要求。
通过网络药理学筛选关键组分和靶点
从中药系统药理学数据库（TCMSP；访问时间：2024年3月12日）中获取了川贝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）、金银花（Lonicera japonica Thunb.）、北沙参（Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.）和南沙参（Adenophora stricta Miq.）的活性成分。根据以下ADME标准筛选候选化合物：口服生物利用度（OB）≥ 30%，类药性（DL）≥ 0.18，以及Caco-2细胞渗透性 ≥ −0.425。同时满足上述三项标准的化合物被保留作为后续分析的候选活性成分。
β-谷甾醇的规范简化分子线性输入规范（SMILES）结构取自 PubChem（访问于 2024 年 3 月 18 日），并导入 SwissTargetPrediction（访问于 2024 年 3 月 21 日）进行靶点预测。选择智人（Homo sapiens）作为目标物种。根据 β-谷甾醇与数据库中已知配体在二维和三维结构上的相似性，预测其潜在作用靶点。保留预测概率大于 0 的靶点，并去除重复条目。
使用关键词“慢性阻塞性肺疾病”从治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database, TTD；访问时间：2024年3月25日）和比较毒物基因组学数据库（Comparative Toxicogenomics Database, CTD；访问时间：2024年3月28日）中检索与慢性阻塞性肺疾病（COPD）相关的基因。去除重复基因后，将COPD相关基因与预测的β-谷甾醇作用靶点取交集，以鉴定可能参与β-谷甾醇对抗COPD治疗作用的候选靶点。
β-谷甾醇与GR的分子对接
β-谷甾醇的三维结构（SDF格式）从PubChem数据库中获取（访问日期：2026年6月2日），而糖皮质激素受体（GR）的晶体结构则来自结构生物信息学研究协作蛋白质数据库（RCSB PDB；访问日期：2026年6月3日）。在对配体和受体结构进行标准预处理后，使用CB-Dock2在线平台（访问日期：2026年6月3日）进行分子对接。将预处理后的配体和受体文件上传至该平台，并采用默认参数进行对接计算。
基因本体（Gene Ontology, GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）的功能富集分析
对β-谷甾醇的所有预测靶基因进行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。富集结果，包括显著富集的生物过程、细胞组分、分子功能及信号通路，已整理并存储于补充文件1中，供后续生物信息学分析使用。
动物模型建立与分组
每组样本量设定为六只动物，该设定基于先前一项研究，该研究使用 G*Power 软件进行事前功效分析（α = 0.05，功效 = 0.80），结果表明在相似的实验条件下，n = 6 已足以检测出具有生物学意义的差异26。将6至8周龄、体重为20 ± 2 g的雄性C57BL/6小鼠随机分为五组：对照组、慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型组、COPD + 地塞米松（DEX）组、COPD + β-谷固醇组以及COPD + DEX + β-谷固醇组。小鼠饲养于标准实验室条件下（25 °C，12小时光照/黑暗循环），可自由摄取标准饲料和水，并在实验开始前适应环境1周。
为建立慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型，将小鼠置于全身香烟烟雾暴露箱（63 cm × 55 cm × 45 cm）中，每天进行两次（每周5天）主流香烟烟雾暴露，每次于上午9:30和下午3:00进行，连续暴露12周。每支香烟含有10 mg焦油、0.9 mg尼古丁和10 mg一氧化碳。每次暴露持续90分钟，烟雾由18支香烟产生并导入暴露箱中27。
为评估干预措施的治疗效果，药物干预在香烟烟雾暴露8周后开始，并持续至后续的4周。从第9周开始，各治疗组小鼠在每天香烟烟雾暴露前1小时，接受每日一次的经口胃内给药，分别给予地塞米松（DEX，1 mg/kg）28 或 β-谷固醇（β-sitosterol，50 mg/kg）29,30。既往药代动力学研究报道，β-谷固醇在啮齿类动物中的口服生物利用度约为4%31。此外，已有多个小鼠研究采用20至50 mg/kg剂量范围的β-谷固醇32。因此，选择50 mg/kg的剂量旨在确保足够的全身暴露水平，同时保持在临床前研究中常用的剂量范围内。
对照组小鼠暴露于过滤后的室内空气中，而模型组和治疗组小鼠则接受等体积的生理盐水作为溶剂。实验周期结束时，小鼠通过吸入异氟烷进行深度麻醉，直至足底反射消失，并通过腹主动脉放血法实施安乐死。立即打开胸腔，仔细分离完整双侧肺组织，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后置于冰上。为收集支气管肺泡灌洗液（BALF），对气管进行插管，用冷的无菌PBS反复灌洗，轻柔注入并回抽以收集灌洗液。肺组织和BALF样本均保持在冰上，随后进行后续分析处理。
BEAS-2B 细胞培养
BEAS-2B 人支气管上皮细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基/F12（DMEM/F12）中培养，培养条件为 37 °C、5% CO₂ 环境。
CSE 制备及 BEAS-2B 细胞暴露
BEAS‑2B 细胞用磷酸盐缓冲液洗涤后，以每孔 5 × 104 个细胞的密度接种于 24 孔板中，每组设三个重复孔。培养 12 小时后，细胞汇合度达到约 60%，随后暴露于香烟烟雾提取物（CSE）中。CSE 按照先前所述方法新鲜配制，并稍作修改33。简言之，将一支未过滤的市售香烟持续燃烧，利用真空泵以 1.05 L/min 的恒定流速（约 −11 kPa 负压）将主流烟雾通入 10 mL 无血清培养基中，持续约 5 分钟，直至香烟完全燃尽。所得溶液首先进行预过滤以去除较大的颗粒杂质，再通过 0.22 µm 无菌微孔滤膜过滤以清除残留颗粒；所得原液定义为 100% CSE。所有新鲜制备的 CSE 均在过滤后立即用于细胞处理，不进行储存。细胞用含 2.5% CSE 的培养基进行刺激。CSE 处理 24 小时后，收集培养上清液并储存在 -40 °C 用于后续分析34。
定量实时聚合酶链式反应（RT‑qPCR）
使用总RNA提取试剂盒从BEAS-2B细胞中提取总RNA，并根据制造商说明书利用逆转录试剂盒将其反转录为cDNA。随后使用实时PCR检测系统和基于SYBR Green的qPCR预混液进行RT-qPCR 检测。所有RT-qPCR实验均对每个样本设置三个生物学重复和三个技术重复，以确保数据的可靠性。
每个qPCR反应的总体积为20 µL，包含10 µL SYBR Green qPCR预混液、0.4 µL正向引物、0.4 µL反向引物、2 µL稀释后的cDNA模板以及7.2 µL无RNase的水。扩增条件如下：95 °C预变性3分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性10秒，以及60 °C退火/延伸30秒。相对基因表达水平采用 2−ΔΔCt 法计算，以GAPDH作为内参基因。本研究中所用引物序列见补充表1。
细胞内活性氧（ROS）分析
细胞内活性氧 使用荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测BEAS-2B细胞中的活性氧生成，并通过流式细胞术进行分析。在流式细胞术数据采集过程中，采用标准的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设门策略，以排除细胞碎片并选择完整单细胞。每份样本采集总计10,000个有效细胞事件。激发波长和发射波长分别设定为488 nm和525 nm。随后分析流式细胞术数据，以定量细胞内活性氧的荧光强度。
丙二醛（MDA）水平测定
根据制造商说明书，使用脂质过氧化检测试剂盒测定细胞内丙二醛（MDA）含量。简言之，收集经处理的BEAS-2B细胞并进行裂解，随后在低温下离心以收集上清液。然后进行硫代巴比妥酸（TBA）比色反应，并使用酶标仪在532 nm处测定吸光度。根据标准曲线计算相对MDA水平。
细胞衰老评估
采用基于衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的衰老检测试剂盒评估细胞衰老。通过流式细胞术定量SA-β-gal阳性细胞。同时，采用RT-qPCR检测衰老相关标志物p53和p21的mRNA表达水平。
细胞增殖检测
采用比色法细胞活力检测试剂盒评估细胞增殖。使用酶标仪在450 nm处测量吸光度。
GR 基因敲低实验
采用基于脂质的转染试剂进行细胞转染。转染的寡核苷酸包括：靶向糖皮质激素受体的小干扰RNA（si-GR）和阴性对照小干扰RNA（si-NC）。靶向GR的候选siRNA序列使用在线生物信息学平台siDirect 2.0设计。转染后，细胞培养48小时，所有siRNA的终浓度均为50 nM。通过RT-qPCR检测GR mRNA的表达水平，验证基因敲低效率。
在β-谷固醇处理和转染实验中均设置了溶剂对照组。对于β-谷固醇干预，仅用溶剂处理的细胞作为溶剂对照组（记为CSE+0）。统计分析证实，溶剂对照组与空白对照组之间无显著差异。
统计分析
所有定量结果均表示为三次生物学独立实验的均值 ± 标准差 体外 实验。统计分析使用统计分析软件进行。在统计检验前，采用Shapiro-Wilk检验来评估数据集分布的正态性；采用Bonferroni事后校正进行调整 P 方差分析（ANOVA）后用于多重比较的显著性检验。两组之间的比较采用非配对Student t检验，而多组比较则采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）。A pP 值 ≤ 0.05 被认为具有统计学显著性。
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β-谷甾醇是一种治疗慢性阻塞性肺疾病的潜在天然产物
由于报道显示川贝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）、忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花、海滨藜（Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.）的干燥根以及沙参（Adenophora stricta Miq.）在治疗肺部疾病方面具有显著疗效35,36,37,38，本研究利用TCMSP数据库系统筛选上述中药的有效成分，发现β-谷甾醇是这些中药共有的重要活性成分（图1A）。为系统探究β-谷甾醇的潜在分子机制，从PubChem数据库获取其...
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慢性阻塞性肺疾病（COPD）造成了巨大的全球疾病负担，仍是世界范围内的重要健康挑战1。目前对COPD的管理包括药物治疗和非药物干预措施42。在药物治疗中，糖皮质激素（GCs）广泛用于慢性炎症性疾病。其作用机制是通过与糖皮质激素受体（GR）结合，并将组蛋白去乙酰化酶2招募至转录复合物中，从而逆转组蛋白乙酰化43。然而，多项研究表明，COPD患者对GC的敏感性降低44,45，且已有研究提供了该疾病中存在GC耐药性的证据46。这些发现表明，克服GC耐药性是一项重要的临床挑战，凸显了开发新型治疗药物的迫切需求。因此，寻找更有效的COPD治疗方案具有重要意义。
既往研究表明，γ-谷甾醇对慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的支气管上皮细胞具有抗增殖作用47<...
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作者声明不存在利益冲突。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BEAS-2B 人支气管上皮细胞 | SunnCell， 中国 | SC-0218 | 用于体外研究的人支气管上皮细胞系 |
| C57BL/6 小鼠 | 维通利华实验动物有限公司，中国 | 213 | 用于体内 COPD 实验的动物模型 |
| CB-DOCK2 | 中国 | https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php | 用于配体与受体蛋白之间的分子对接模拟 |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | 碧云天生物技术，中国 | C0038 | 检测细胞活力与增殖能力 |
| CellEvent™ 衰老绿色检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技，美国 | C10851 | 检测细胞衰老 |
| 香烟 | 红塔集团，中国 | 未提供 | 用于烟雾暴露及香烟烟雾提取物（CSE）制备 |
| CTD | 美国 | https://ctdbase.org/ | 用于检索与 COPD 相关的基因 |
| DCFH-DA 荧光探针 | Sigma-Aldrich，美国 | D6883-50MG | 检测细胞内活性氧（ROS）水平 |
| 地塞米松（DEX） | 翊圣生物，中国 | 40323ES03 | 用于联合干预的糖皮质激素 |
| DMEM/F12 培养基 | Gibco，美国 | 11330032 | BEAS-2B 细胞培养的基础培养基 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco，美国 | 10270106 | 细胞培养基的补充成分 |
| GraphPad Prism | GraphPad 软件公司，美国 | 9.3.1 | 数据统计分析与图表绘制 |
| 异氟烷 | RWD 生命科学，中国 | R510-22-10 | 用于动物安乐死的吸入性麻醉剂 |
| 脂质过氧化 MDA 检测试剂盒 | 碧云天生物技术，中国 | S0131S | 检测细胞内丙二醛（MDA）含量 |
| Lipofectamine 2000 | 赛默飞世尔科技，美国 | 11668030 | 用于 siRNA 转染的转染试剂 |
| 多功能酶标仪 | 赛默飞世尔科技，美国 | VL0000D0 | 检测吸光度与荧光值 |
| Navios EX 流式细胞仪 | 贝克曼库尔特，美国 | B80912 | 分析活性氧（ROS）与衰老细胞 |
| 青霉素/链霉素 | HyClone，美国 | SV30010 | 用于防止细菌污染的抗生素 |
| Power SYBR™ Green Master Mix | 赛默飞世尔科技，美国 | 4367659 | 荧光定量 PCR 扩增 |
| PrimeScript™ RT 试剂盒 | Takara， 日本 | RR037Q | 用于 cDNA 合成的逆转录反应 |
| PubChem 数据库 | 美国 | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ | 用于获取 β-谷甾醇的标准 SMILES 序列并下载其三维 SDF 结构信息 |
| QuantStudio Dx PCR 仪 | 赛默飞世尔科技， 美国 | 4479889 | 实时 RT-qPCR 检测 |
| RCSB PDB | 美国 | https://www.rcsb.org/ | 获取糖皮质激素受体（GR）晶体的三维结构文件 |
| RNA/蛋白提取试剂盒 | 碧云天生物技术，中国 | R0018S | 从细胞和肺组织中提取总 RNA |
| si-GR | 通过 siDirect 2.1 软件设计 | 定制合成 | 引导链：5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′； passenger 链：5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′，用于 GR 基因的沉默 |
| si-NC | 赛默飞世尔科技，美国 | 4390843 | 作为细胞和体内实验的阴性转染对照 |
| SwissTargetPrediction 数据库 | 瑞士 | http://swisstargetprediction.ch/ | 用于预测潜在的药物相关蛋白靶点（计算机模拟） |
| TCMSP 数据库 | 中国 | https://www.tcmsp-e.com/ | 用于中药成分筛选与靶点预测 |
| TTD | 新加坡 | https://db.idrblab.net/ttd/ | 用于收集已验证的与 COPD 相关的疾病基因 |
| 全身烟雾暴露舱 | Teague Enterprise， 美国 | TE-2 | 建立香烟烟雾诱导的 COPD 模型 |
| β-谷甾醇 | ChemicalBook，中国 | 83-46-5 | 用于药物治疗的活性植物甾醇 |
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