本实验方案旨在通过优化的饲养方法、单次产卵感染实验以及RNAi介导的基因敲低技术，促进对Asobara japonica与Drosophila melanogaster之间寄生蜂-寄主相互作用的功能分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
高效培育及功能分析内寄生蜂Asobara japonica及其宿主Drosophila melanogaster的实验方案
本文内容
摘要
摘要
寄生是一种生物相互作用，其中一个生物体利用另一个生物体（宿主）的身体或资源，导致宿主遭受严重损害甚至死亡。在寄生性动物中，拟寄生蜂是物种多样性最丰富的类群之一，约占所有昆虫物种的20%。特别是内寄生蜂，可直接将卵产入宿主体内，并利用多种多样的毒液因子来操控宿主的发育、免疫和生理过程。作为对蜂类攻击的响应，宿主会尝试通过先天免疫机制清除拟寄生卵。然而，单个毒液成分如何在分子和细胞层面调控宿主生物学功能并促进成功寄生，目前仍知之甚少。本文介绍了一种标准化的实验室方案，用于饲养内寄生蜂Asobara japonica及其宿主Drosophila melanogaster。A. japonica 存在孤雌生殖和有性生殖两种品系，其中孤雌生殖品系具有较高的寄生成功率，便于稳定维持实验室种群，适用于基因组分析和寄生实验。我们优化了单次产卵感染实验以及基于双链RNA的基因敲低方法，用于毒液基因的功能分析。这些实验方案共同构建了一个实用的研究框架，可用于解析拟寄生蜂与宿主相互作用的分子机制，并将推动发育生物学、免疫学和生理学领域的后续研究。
引言
寄生是一种生活方式，指一种生物利用另一种生物的营养资源，这种现象在各类生物中广泛存在。据估计，所有已知生物中多达一半在其生命周期中表现出寄生行为1。在寄生生物中，寄生蜂是一类特别多样化的类群，约占所有昆虫的20%2。它们利用多种节肢动物作为寄主，例如昆虫、蜘蛛和螨类，并在生活史和寄生策略上表现出显著的多样性3。这些特征使寄生蜂成为进化上和生态上最成功的昆虫类群之一。
寄生蜂与其宿主之间的相互作用被广泛研究，作为进化“军备竞赛”的模型系统。特别是，内寄生蜂会释放多种因子，包括毒液、共生病毒和胚细胞4,5。这些因子可调控宿主的生理和发育过程，从而确保其在宿主体内成功发育。尽管已有上述进展，大多数寄生蜂物种中寄生现象背后的分子机制仍不清楚。其中一个主要限制因素是寄生蜂体型微小，阻碍了对其毒液成分进行生化鉴定。此外，在实验室条件下维持寄生蜂及其宿主发育阶段的同步也存在技术上的挑战。
下一代测序及其他组学技术的最新进展，使得即使在体型微小的寄生蜂物种中也能开展全基因组范围的分析。这些方法为研究以往难以触及的分子机制开辟了新的途径，使寄生蜂与宿主相互作用的研究达到前所未有的分....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
D. melanogaster 和 A. japonica 的同步化培养方法的示意图见图1。
1. 实验室中培养宿主果蝇 Drosophila melanogaster
- 将所有实验动物饲养在 25 °C 、相对湿度 50–60% 的环境中，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。使用野生型品系 Oregon-R (OR) 作为 A. japonica 的宿主（图 2A）。
- 将成虫转移至含有标准玉米粉-酵母-琼脂培养基（0.55% 琼脂， 表 1）的新培养管中。在管壁上标注转移日期和品系名称 "OR"。
- 转移后一天清除这些成虫，以防止食物中卵的数量过多。确保后代幼虫在食物表面取食。
注意：作为参考标准，每管培养基（φ30×100 mm）中保留约 200–250 枚卵。较高的卵密度可能降低寄生成功率，并增加宿主和寄生蜂发育的变异性。 - 在步骤 1.2 之后第四天，将一勺果蝇幼虫（产卵后 4 天，dAEL）转移至新的食物管中。将这些幼虫保持不接触寄生蜂的状态，....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
无性系与有性系 Asobara japonica
A. japonica 广泛分布于日本各地。在主岛上以孤雌生殖的雌核发育品系为主，而在包括奄美大岛和西表岛在内的亚热带岛屿上则分布着两性生殖的雄核发育品系。8,12在有性生殖品系中，雄性比雌性早数天羽化，因此这些品系成虫转移的时间有所不同。孤雌生殖中的雌性生殖 A. japonica 由感染诱导 Wolbachia一种母系遗传的内共生细菌13消除 Wolbachia 通过抗生素处理导致雄性个体的产生9,14，以及移植 Wolbachia 诱导孤雌生殖进入性状菌株15无性繁殖和有性繁殖的菌株 A. japon.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究建立了一个多功能实验平台，用于在分子水平上研究寄生蜂与宿主之间的相互作用。通过优化饲养条件、单次产卵感染实验以及RNAi实验方案，我们提供了一个可靠的系统，用于研究寄生蜂来源因子的功能。该平台将有助于未来揭示寄生蜂调控宿主发育机制的研究，同时也可能为生物害虫防治策略的开发提供支持。
Wolbachia感染的A. japonica TK品系为研究寄生现象提供了一个高度可重复的实验系统。在许多寄生蜂-寄主研究中，实验结果往往存在较大变异，寄主存活率和寄生蜂成功率对环境和生理条件高度敏感。相比之下，TK品系表现出持续稳定的高寄生成功率，有效地形成了一种“寄生蜂主导”的状态，使感染结果基本一致。此外，由于该品系为孤雌生殖品系，个体间具有相同的遗传背景，从而减少了实验中的个体差异。这种可重复性使得寄生过程能够被可靠地追踪，并有助于对寄主应答及寄生蜂来源因子进行定量分析。
此外，孤雌生殖通过产生高度均一的基因组DNA，极大地促进了基因组分析，这对于高质量的基因组组装至关重要
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们没有需要披露的利益冲突。
致谢
作者谨此感谢高尾要太、工藤诗音、牧野俊哉、依本俊太、重信修司、川村明子、藤野有里以及饭田正子提供的技术协助。同时，我们也感谢实验室所有其他成员的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 离心管 | Greiner Bio-One | 210261 | 感染实验 |
| 1 mL 注射器 | TERUMO | SS-01T | dsRNA 注射 |
| 琼脂 | Daisin, Ltd. | P-700 | 饲养 |
| Asnol 培养皿 φ40×13.5 mm | As One Corporation | 1-8549-01 | 感染实验 |
| Asnol 培养皿 φ55×17 mm | As One Corporation | 1-8549-02 | dsRNA 注射 |
| 蓝色染料（依柔红二钠盐） | Sigma-Aldrich Co. Llc. | 861146-25G | dsRNA 注射 |
| 对羟基苯甲酸丁酯 | Nacalai Tesque, Inc. | 06327-15 | 饲养 |
| CO2 减压调节器 | YAMATOSANGYO | YR-507F-2 | 感染实验 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | LSM700 | 图像分析 |
| 玉米粉 | Sunny Maize Co., Ltd. | No.4M | 饲养 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | PI62247 | 细胞核染色，1:10000 |
| 去离子水 | Millipore Inc. | ZLXEV030WW | 感染实验 |
| 双级玻璃毛细管拉制仪 | Narishige | PC-10 | dsRNA 注射 |
| Fiji | NA | https://fiji.sc | 图像分析 |
| 滤纸 | Advantec | ITEM 526 | 饲养 |
| 果蝇饲养管 | Chiyoda Science Co., Ltd. | KFB-3M | 饲养 |
| 果蝇饲养管塞 | Chiyoda Science Co., Ltd. | AS-275 | 饲养 |
| 镊子 | Dumont Biologie | 11252-20 | 解剖 |
| 冷冻柜，-20 °C | Nihon Freezer | GS-3120HC | 样品储存 |
| 冷冻柜，-80 °C | Nihon Freezer | CLN-52UD2 | 样品储存 |
| 载玻片 | Matsunami Glass Ind., Ltd | S7213 | 感染实验 |
| 葡萄糖 | Showa Sangyo Co., Ltd. | 不可用 | 饲养 |
| KOD Plus Neo | Toyobo | KOD-401 | dsRNA 合成 |
| 培养箱 | Panasonic | MIR-254-PJ | 饲养 |
| Ligation high Ver.2 | Toyobo | LGK-201 | dsRNA 合成 |
| 玻璃毛细管研磨仪 | Narishige | EG-401 | dsRNA 注射 |
| 矿物油 | Nacalai Tesque, Inc. | 23306-84 | dsRNA 注射 |
| Nanoject III | Drummond Scientific Company | 3-000-207 | dsRNA 注射 |
| Nanoject 玻璃毛细管 | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | dsRNA 注射 |
| pBluescript KS (+) 质粒 | 不可用 | 不可用 | dsRNA 合成 |
| pBluescript SK (-) 质粒 | 不可用 | 不可用 | dsRNA 合成 |
| PrimeScript 逆转录酶 | Takara | 2680A | dsRNA 合成 |
| 丙酸 | Nacalai Tesque, Inc. | 29018-55 | 饲养 |
| PROWIPE | Daio Paper Corporation | 2-2624-02 | 感染实验，dsRNA 注射 |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（含gDNA去除剂） | Toyobo | FSQ-301 | qRT-PCR |
| RNAiso Plus 试剂 | Takara | 9108 | qRT-PCR |
| 小瓶（12 mL 试管） | Sarstedt | REF 58.487 | 感染实验 |
| 小瓶塞 | Chiyoda Science Co., ltd. | QD-S4 | 感染实验 |
| 刮勺 | As One Corporation | 6-522-02 | 饲养 |
| 方形培养皿 | Eiken Chemical Co., Ltd. | 64-2192-55, AW2000 | dsRNA 注射 |
| 体视显微镜 | Leica Microsystems | lvesta3 (C-Mount) | 感染实验 |
| 体视显微镜 | Nikon Solutions Co., Ltd. | SMZ1000 | dsRNA 注射 |
| T7 RiboMAX Express RNAi 系统 | Promega | P1700 | dsRNA 合成 |
| Thermal Cycler Dice Real Time 系统 | Takara | TP815 | qRT-PCR |
| Thermal Cycler GeneAtlas | Astel | G02 | dsRNA 合成，qRT-PCR |
| THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix | Toyobo | QPS-201 | qRT-PCR |
| TissueLyser II | Qiagen | 不可用 | qRT-PCR |
| 维生素C，L-抗坏血酸 | Nacalai Tesque, Inc. | 03420-65 | 饲养 |
| Welch's 100% 葡萄汁 | Asahi Soft drinks Co., Ltd. | 32390 | 感染实验 |
| 酵母 | Asahi Group Foods, Ltd. | HB-P02 | 饲养 |
参考文献
- Hasik AZ, et al. Parasitism as a driver of host diversification. Nat Rev Biodivers. 2025;1(6):401-410.
- Pennacchio F, Strand MR. Evolution of developmental strategies in parasitic Hymenoptera. Annu Rev Entomol. 2006;51:233-258.
- Quicke DL. Parasitic Wasps. 1997:221-255.
- Moreau S, Asgari S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological functions. Toxins. 2015;7(7):2385-2412.
- Huang J, Chen XX, Zhan S. Molecular mechanisms underlying parasitoid-derived host manipulation strategies. Annu Rev Entomol. 2026;71:51-68.
- Belokobylskij SA. Key to the Insects of Russian Far East. Tribe Alysiini. In: Ler PA, ed. 1998;4(3):163-....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
