内寄生蜂Asobara japonica及其宿主Drosophila melanogaster高效饲养及功能分析的方案

Summary

该方案的目标是促进对 日本龙 粉蛾和 果蝇黑腹 中寄生蜂-宿主相互作用的功能分析。通过优化的饲养方法、单产卵感染检测和RNAi介导的基因敲低。

Abstract

寄生是一种生物相互作用，其中一种生物利用另一个生物体（宿主）的身体或资源，导致宿主遭受重大损伤甚至死亡。在寄生动物中，寄生蜂是物种最丰富的谱系之一，占所有昆虫物种的近20%。特别是，内寄生蜂直接产卵进入宿主体内，并释放多种毒液因子以调节宿主发育、免疫和生理功能。面对黄蜂攻击，宿主会通过先天免疫机制试图消灭寄生蜂卵。然而，单个毒液成分调节宿主生物学并促进成功寄生的分子和细胞机制仍不充分。本文介绍了一种标准化的实验室育种方案，用于饲养内寄生蜂日本 蜂（Asobara japonica ）及其宿主 果蝇（Drosophila melanogaster）。 日本 单纯雌生殖和有性菌株均可获得，孤雌生殖菌株具有较高的寄生成功率，使实验室存活物种稳定，用于基因组分析和寄生检测。单产卵感染检测和基于双链RNA的基因敲低方法被优化用于毒液基因的功能分析。这些方案共同提供了切实的实验框架，用于剖析寄生蜂-宿主相互作用的分子机制，并将促进未来发育生物学、免疫学和生理学的研究。

Introduction

寄生是一种生活方式，一种生物利用另一种生物的营养资源，这种生活方式在多个分类单元中普遍存在。据估计，多达一半已知生物在其生命周期中表现出寄生行为¹。在寄生虫中，寄生蜂是特别多样化的群体，约占所有昆虫的20%。它们利用昆虫、蜘蛛和螨虫等多种节肢动物宿主，生活史和寄生策略表现出惊人的多样性^3。这些特征使寄生蜂成为进化和生态上最成功的昆虫群体之一。

寄生蜂与宿主之间的相互作用已被广泛研究为进化“军备竞赛”的模型系统。特别是，内寄生蜂会部署多种因素，包括毒液、共生病毒和畸形细胞^4,5。这些因素操控宿主的生理和发育，从而确保宿主内的成功发育。尽管取得了这些进展，大多数寄生蜂物种对寄生背后的分子机制仍然了解不足。其中一个主要限制是体型较小，这阻碍了对毒液成分的生化鉴定。此外，在实验室条件下维持寄生蜂及其宿主同步发育阶段的技术挑战。

新一代测序和其他组学技术的最新进展，现在甚至使得在极小的寄生蜂物种中也能进行全基因组分析。这些方法为研究此前难以接近的分子机制开辟了新途径，使得以前所未有的分辨率研究寄生蜂-宿主相互作用。在此背景下，我们的实验室专注于膜翅目（Braconidae）的Asobara japonica Belokobylskij （膜翅目：Braconidae），该物种最初在日本被鉴定 ^6,7,8。日本甲菌（A. japonica）包括一种thelytokous孤雌生殖品系，雌性在不交配的情况下产生后代。这一特性使我们能够收集大量遗传上均匀的基因组DNA，用于全基因组测序^9。此外，该物种寄生于多种果蝇属，包括模式生物D. melanogaster， 其成熟的养育条件和精确定义的发育阶段带来了重大实验优势，使得可重复的感染检测和寄生蜂发育的精确控制成为可能¹⁰。

在A . japonica寄生期间，雌蜂将毒液与单个卵一起注入蝇幼虫体内，幼虫与寄主一起生长。值得注意的是， 日本寄 生蜂在宿主 D. melanogaster 上表现出较高的寄生成功率，使这对寄生蜂-宿主组合成为一个强大的实验模型。本文介绍了日本单株的稳定育育、单产卵感染检测以及基于双股RNA（dsRNA）基因敲低方法 的方案。 这些方案为剖析寄生蜂-宿主相互作用的分子机制提供了可靠的框架。

Protocol

图1展示了D. melanogaster和A. japonica同步饲养方法的示意概述。

1. 在实验室中饲养寄主果蝇Drosophila melanogaster

1. 所有实验动物保持在25°C和50-60%相对湿度，采用12：12小时的明暗循环。使用野生型株Oregon-R（OR）作为 A. japonica的宿主（见图2A）。
2. 将成蝇转移到一个新食物小瓶，内含标准玉米粉-酵母-琼脂培养基（0.55%琼脂，见表1）。在小瓶上标注转移日期和菌株名称“OR”。
3. 转移后一天清理这些成虫，以防止食物中卵过多。确保幼虫在食物表面觅食。
   注意：作为参考，每瓶食物保持约200-250枚鸡蛋（φ30×100毫米）。更高的卵密度可能降低寄生成功率，增加寄主和黄蜂发育的变异。
4. 步骤1.2后四天，将一勺蝇幼虫（产卵后4天，dAEL）转移到新食物瓶中。让这些幼虫避免暴露于寄生蜂，供下一代使用。该程序还有助于控制瓶内宿主幼虫的密度。

2. 在实验室中饲养内寄生蜂（Asobara japonica）

1. 使用孤雌生殖的东京株（TK）和有性株的西表岛株（IR）（见图2B）。前者由雌性组成，后者则由雌性和雄性组成。雄鸟比雌鸟早2-4天羽化。因此，转移前应通过产卵器确认雌虫的存在。
2. 将10-20只成蜂直接从储备瓶转移到含有蝇幼虫的小瓶中，剂量为4 dAEL。在小瓶上标注转移日期和菌株名称“TK”或“IR”。保持黄蜂处于与步骤1.1相同的环境。
3. 允许成虫黄蜂产卵于苍蝇幼虫体内。在一到两天后清除这些黄蜂，以防止超级寄生，因为超级寄生可能导致宿主死亡。移除在第2.2步后10天或更长时间逃脱寄生的封闭成蝇。
4. 步骤2.2后两周，成虫黄蜂开始从寄主蝇蛹壳中脱茧。将这些新封闭的成虫黄蜂转移到一个含有25%葡萄糖和50 mM维生素C溶液的滤纸小瓶中。滤纸片应在130°C下消毒2小时。在滤纸上提供溶液可以促进产卵行为并延长成虫黄蜂的寿命。我们利用维生素C促进产卵的方法灵感来自果 蝇研究¹¹的观察。

3. 单产卵感染检测

1. 同步用于感染实验的苍蝇幼虫发育阶段。
   1. 将成蝇放入50毫升管内，内含葡萄汁琼脂平板（3%琼脂），抹上新鲜酵母膏，让它们产卵24小时。
   2. 在葡萄汁琼脂培养皿上采集新孵化的第一龄幼虫，并将其转移到一个小瓶（12毫升），内含2-3克苍蝇食膏（蝇食与适当量的水混合）。小瓶中放置20至30只幼虫。蝇幼虫在25°C下生长。
2. 在适当时间点，准备一个4厘米的培养皿，内含一层薄薄均匀铺布的蝇食膏，覆盖直径约1.5-2.0厘米的区域（以下称为感染检测场）。除了感染检测场外，还准备一个新的小瓶（12毫升），内含适量的苍蝇饲料膏。该小瓶用于感染检测后饲养宿主幼虫。
3. 收集分阶段的幼虫，并将其转移到装有去离子水（电阻率=15 MΩ·cm，25 °C）的皿中。用轻轻的搅拌冲洗幼虫，去除体内残留的食物。
4. 冲洗后，使用无绒纸巾轻柔去除幼虫多余水分，因为过多水分会影响黄蜂在感染检测场上的产卵行为。然后将幼虫转移到竞技场。这一步骤在感染实验中增加了幼虫的活跃度。
5. 用_CO2 气体以5升·分钟^-1 的流量和0.2兆帕压力麻醉成虫黄蜂。然后，轻柔地将大约三只雌蜂放入感染检测场。盖上盘子盖子，让它们在飞蝇食物酱上恢复。
6. 在立体显微镜下观察这些黄蜂的产卵行为（变焦档位：10×至15×）。
   注意：当黄蜂触摸移动的苍蝇幼体时，会迅速将产卵器插入体内并注入毒液成分。虽然苍蝇幼虫挣扎挣扎，但立即瘫痪。随后，黄蜂振动腹部，将卵产入宿主幼体，随后收回产卵器。这种产卵行为称为感染。
7. 感染后，打开盖子，将感染的蝇幼虫转移到步骤3.2中准备的新小瓶中装有蝇食膏。为了标准化感染时间，请在15分钟内完成感染实验。
8. 在小瓶上标注实验信息，如日期、样本名称、感染时间和个体数量。这些小瓶被塞好后放入潮湿容器中，保持在25°C。

4. 通过dsRNA注射生成RNA干扰（RNAi）黄蜂

1. 利用体 外 转录的dsRNA合成系统合成400碱基及以上的dsRNA，进行dsRNA介导的基因敲低（RNA干扰，RNAi）。dsRNA样本应在使用前保持在-20至-80°C。详细的协议如前所述⁹.
2. 准备一个5.5厘米的培养皿，含有2%琼脂，用于放置黄蜂尸体。每个培养皿的三分之二填满琼脂，形成一层厚厚的琼脂平板用于注射。
3. 将无绒毛的湿纸巾浸湿在塑料盘的盖子上。
4. 感染后7天（DPI）从小瓶中采集寄主蝇蛹，并将其置于步骤4.3中准备的无绒纸湿巾上。在小瓶壁上滴一滴水有助于将寄主蝇蛹壳从小瓶中取出。
5. 在立体显微镜下（变焦档：20×），取出寄主蝇蛹壳，用镊子暴露黄蜂体。在7 dpi时，大多数黄蜂处于蛹期，头部、胸部和腹部部分可辨识。黄蜂的身体是固定的。
6. 将取回的黄蜂体放置在步骤4.2中准备的琼脂平板上，使其体轴对齐一致。将20-30个黄蜂的背侧朝上排列成一到两列。用无绒纸巾去除琼脂板上的多余水分，防止黄蜂滑动。
7. 按照制造商说明，安装注射装置和立体显微镜（见图3A）。使用配备玻璃毛细针的微注射系统，以精确控制注射量和注射速度。将黄蜂头朝向注射针尖的琼脂平板放置。注入体积为50 nL·黄蜂^-1 ，注入速度为50 nL·^sec-1 。
8. 用拉针器准备玻璃毛细针。玻璃毛细管的形状可根据加热器温度调节。
9. 将玻璃毛细针以30-35°的角度放置在针磨机上。磨针直到针尖长度达到0.04毫米（目镜十字线上的四段， 见图3B）。
10. 注射前解冻dsRNA。dsRNA的浓度为0.25-1 μg·^μL-1。为了直观观察，dsRNA溶液会用蓝色染料（Erioglaucine 二钠盐，2%重量·体积^-1）染色。使用微装载移液器吸头，将含蓝色染料的dsRNA溶液填充玻璃毛细管。4微升足够注入30个黄蜂体。确保溶液中没有气泡。
    注意：装入dsRNA溶液后，用指甲轻轻敲击针头侧面，去除被困气泡。残留的气泡会阻碍溶液流动，干扰注射成功。
11. 用1毫升注射器和针头，将玻璃毛细管空闲部分注入矿物油，确保毛细管内无气泡残留。
12. 将含有dsRNA溶液和矿物油的玻璃毛细针连接到针架上，然后安装到注射装置上。
13. 调整琼脂平板和注射器上玻璃毛细针的位置，使玻璃针相对于黄蜂体呈30-45°角（见图3A）。
14. 将玻璃毛细针插入黄蜂身体的背部一侧，稍偏向背部中线。将dsRNA溶液微注射到体内。注入的dsRNA溶液可见，带有蓝色染料 （见图3C）。
15. 注射后，将琼脂平板放入湿度较高的容器（相对湿度70-80%），并在25°C的培养箱中保存一周，直到成虫蜂脱茧。受损的黄蜂体应从琼脂板中移除，以防止细菌污染。
    暂停点：在第4.6步中，黄蜂蛹可以在琼脂平板上保持数小时后再注射。针可以提前准备（步骤4.8和4.9）;但它们容易随着时间堵塞。新制备的针头通常能提供更可靠的注射性能。

Results

日本龙草的无性与有性菌株
日本土豆广泛分布于日本各地。主岛以单性生殖菌株为主，亚热带岛屿如奄美大岛和西表岛则发现有性生殖菌株 ^8,12。在有性品系中，雄性比雌性早几天羽化，因此成虫转移的时间在不同品系之间是不同的。日本虎皮草的孤雌生殖是由母系传播的内共生细菌沃尔巴希亚（Wolbachia）感染诱导的。通过抗生素治疗消除沃尔巴赫病后产生雄性^9,14，将沃尔巴赫亚移植到有性菌株中诱导孤雌生殖¹⁵。无性和有性日本果蝇菌株在多种果蝇种类中均表现出高寄生成功率。例如，它们可以寄生于经济上重要的果实害虫——铃木豆，并被视为农业中的潜在生物防治剂¹⁶。在现有的菌株中，我们主要使用了感染沃尔巴奇亚的TK菌株进行实验。与红外病毒^株14相比，TK菌株对宿主幼虫的寄生活动更高，适合进行分析。

寄生的成功取决于养育条件
日本蝇的寄生成功率普遍较高，但其受宿主蝇饲养条件的强烈影响。在营养贫乏条件下，蝇幼虫的生长期延长，化蛹时间延迟¹⁷。在这种情况下，黄蜂可能无法正确利用宿主资源，也无法与宿主同步发育。为了考察这种可能性，我们在正常酵母（1×）和酵母贫（0.1×）条件下饲养了苍蝇和黄蜂。随后，我们评估了寄生成功率和发育时机（见图2C，2D）。寄生成功率通过羽化成虫与寄主幼虫的比例计算。

在正常酵母条件下，单产卵感染检测的寄生成功率为81.7%（见图2C，左侧;表2）。当酵母含量降至10%（酵母状况不良）时，寄生成功率降至35.0%（右图2C;表2）。这种减少可能是因为大约50%的宿主幼虫在感染后死亡。这些结果表明，在营养贫乏条件下，宿主与寄生蜂之间的资源分配会扰。

值得注意的是，在酵母稀少条件下，黄蜂化殖的延迟幅度与正常酵母条件下相比。虽然苍蝇的化粪定时延迟最多9天，但黄蜂的化殖时间仅延迟4-5天。这一结果表明养分的可用性主要影响宿主的发育。在正常酵母条件下，蝇和黄蜂的化殖时间一致，但在酵母稀少条件下则不一致，表明寄生蜂与宿主之间的同步发育取决于养分的可用性。

基于RNAi的毒液基因功能分析方法
尽管毒腺的转录组和蛋白质组分析已识别出众多候选分子，但目前尚不清楚哪些是成功寄生所必需的。为了确定这些候选分子的生理作用，需要使用基因敲低方法进行 体内 功能分析。

我们最近报告称， 日本单胞菌 的寄生会诱导D . melanogaster 幼虫想象椎间盘的凋亡、自噬和有丝分裂停止，导致严重的组织退化，这一现象称为想象椎间盘降解（IDD）¹⁰。为识别导致IDD的分子，我们对通过转录组学、蛋白质组学和比较基因组分析鉴定的候选基因进行了RNAi筛选。结果，发现了两个基因，想象 椎间盘降解因子 （IDDF1）-1 和 IDDF-2 。IDDF-1和IDDF-2都包含未知功能域4803（DUF4803）。值得注意的是，在我们最初报告之后，一项独立研究发现了多种与IDD相关的日本 单胞菌毒液蛋白（称为毒液诱导降解，VID），这些蛋白都具有DUF4803结构域¹⁸。

基于这些结果，我们进一步优化了RNAi协议，以提高重复性和效率。特别是，使用Nanoject III实现了对注射体积和速度的精确控制，从而实现了更一致的敲低效果。

为评估优化后的RNAi协议的效率，我们对IDDF-1进行了敲低。在封闭成虫中，IDDF-1的表达水平显著低于对照组（见图3D）。为功能验证，我们利用这些RNAi黄蜂和表达凋亡报告器GC3Ai的寄主蝇幼虫在翼囊区¹⁹进行了单产卵感染检测。在对照（GFP RNAi）黄蜂感染后，在翼囊中检测到GC3Ai信号。相比之下，感染IDDF-1 RNAi黄蜂后GC3Ai信号显著降低（见图3E，3F）。这些结果与之前的发现一致，证实了 RNAi 有效抑制了 IDDF-1 功能。

图1。黑腹龙和日本黑腹龙的饲养程序示意概述。 
根据D. melanogaster的发育阶段，展示了分阶段的操作步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

图2。日本 黑疣 蝇寄生。（A） 黑腹 泻与其寄生蜂日本螺旋藻发育关系的示意 图。 雌蜂会向蝇幼虫投放毒液和单个卵。孵化后，黄蜂幼虫与寄主幼虫同步发育，随后化蛹化。化蛹后，黄蜂会吃掉整个苍蝇的身体，最终从蛹壳中脱离。 （B） 无性菌株（左）和有性菌株（右）的成虫黄蜂 。 比例尺，1毫米。 （C） 在正常（1×）和酵母贫困（0.1×）条件下，苍蝇或黄蜂的出现率。在产卵后4天使用寄主蝇幼虫进行单产卵感染检测（dAEL）。 n = 267只（1×蝇）、120只（0.1×蝇）、85只（1×只黄蜂）和80只（0.1×黄蜂）。 （D） 在（ C）所示两种营养条件下，蝇和黄蜂的蜂巢化时间。标明了成虫与蛹的比例。 n = 250、107、61 和 41。黑色箭头表示黄蜂感染的时间。请点击此处查看该图的放大版本。

图3。利用Nanoject III优化RNAi程序。（A）在立体显微镜下安装显微注射装置。玻璃毛细针相对于琼脂平板呈30-45°的角度放置。（B） 玻璃毛细针的尖端用磨针机磨尖。（C）蓝色染料溶液通过玻璃毛细针微注射到黄蜂体内。图中黄蜂的前侧用A表示。P，后方。尺度条，1毫米（D）。使用delta-delta C_t方法定量了GFP RNAi和IDDF-1 RNAi黄蜂中IDDF-1的表达水平。表达水平被归一化为RpL32-Aj。数据表示SD±均值，且有个别数据点（n = 5）。P < 0.005（学生t检验）。（E和F）GC3Ai信号在感染后6小时（hpi）中，在对照组（GFP RNAi） 或IDDF-1 RNAi黄蜂感染后6小时内，在未感染幼虫和宿主幼虫的翅盘中进行。翼盘的轮廓以基于核的DAPI染色法（1：10000,62247;Thermo Fisher Scientific）。量化了GC3Ai阳性面积与翼囊面积的比值。P < 0.005（单向方差分析加上Tukey多重比较检验）。n = 每个组11个生物复制。比例尺，100微米。请点击此处查看该图的放大版本。

组成部分	数量
水	1 L
琼脂	5.5克
酵母	40克
玉米粉	90克
葡萄糖	100克
丙酸	3毫升
10%丁基对羟基苯甲酸酯，含70%乙醇	3.5毫升

表1：标准玉米粉-酵母-琼脂培养基（飞蝇饲料）的成分。

食物类型	状况	# 总个体	# 封闭或已故个体				苍蝇或黄蜂的出现率（%）
			飞	黄蜂	蛹致死	幼虫致死
1×	未感染者	267	248	0	2	17	92.88389513
	感染日本土豆	120	0	98	9	13	81.66666667
0.1×	未感染者	85	38	0	23	24	44.70588235
	感染日本土豆	80	0	28	13	39	35

表2：正常（1x）和酵母贫困（0.1x）条件下个体数量及出现率。

引物名称	序列（5'>3'）	目的
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTCTCTACTACT（卡特克特克特）	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGTGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	CDS克隆
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	CDS克隆，dsRNA模板
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	嘎	dsRNA模板
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT 卡卡克特克塔卡卡特	dsRNA模板
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACACTCACTCACTATAGGGAG 嘎嘎嘎	dsRNA模板
※ 这些引物和dsRNA模板见Kamiyama 等人报道。2022.
※ gene007424 代表 IDDF-1。

表3：本研究中使用的引物序列和dsRNA模板。

Discussion

本研究建立了一个多功能的实验平台，用于分子层面上研究寄生蜂-宿主相互作用。通过优化育养条件、单产卵感染检测和RNAi协议，我们为寄生蜂衍生因子的功能性研究提供了稳健的系统。该平台将促进未来研究，旨在揭示寄生蜂如何操控宿主发育的机制，并可能促进生物害虫防治策略的发展。

感染 沃尔巴奇亚的日本 毛菌TK株为分析寄生虫提供了高度可重复的实验系统。在许多寄生蜂-宿主研究中，实验结果常常存在差异，宿主的存活率和寄生蜂的成功率敏感地依赖于环境和生理条件。相比之下，TK株持续表现出高寄生成功率，实际上形成了一种“寄生蜂显性”状态，感染结果大致均匀。此外，作为孤雌生殖菌株，由于其遗传背景均匀，它减少了个体间的实验变异。这种可重复性使得对寄生过程的可靠追踪成为可能，并便于对宿主反应和寄生蜂衍生因素进行定量分析。

此外，thelytokous复制极大地促进了基因组分析，能够生成高度均匀的基因组DNA，这对高质量基因组组装^{至关重要。}虽然并非所有寄生蜂物种都拥有此类孤雌生殖菌株，但我们的结果凸显了沃 尔巴基亚诱导的thelytoky作为改善基因组资源策略的潜力。因此，在其他寄生蜂物种中建立感染沃 尔巴希亚的谱系，可能是扩展基因组资源和加速跨寄生蜂分子比较研究的有力方法。

寄生结果深受宿主营养条件影响，表明养育条件是寄生蜂成功的关键因素。由于寄生成功依赖于宿主和黄蜂发育的精确时间协调，营养条件失控可能会干扰这一过程并降低复制性。因此，严格标准化寄主饲养条件对于建立可靠的实验系统研究寄生蜂-宿主相互作用至关重要。此外，苍蝇库存小瓶应与黄蜂库存瓶分开保存，因为黄蜂的存在会减少蝇类产卵行为^20,21。

为了实现寄生蜂-宿主相互作用的定量评估，我们设计了一种单产卵感染检测法，即将单个卵子产入每个宿主。该检测与传统大规模感染检测形成对比，后者通常涉及多次产卵事件，导致宿主损伤和死亡率过高。为了在有限的时间窗口（~15分钟）内促进高效产卵，新封闭的成蜂被预先用葡萄糖和维生素C溶液处理，从而提高产卵效率和整体重复性。

此外，我们优化了RNAi协议用于寄生蜂基因功能分析。通过采用微注射系统，我们实现了对注射体积的精确控制，并提高了敲击效率的一致性。使用 IDDF-1功能验证确认该方法有效抑制基因表达并产生可重复的表型结果。鉴于转录组学和蛋白质组学研究持续识别大量候选毒液因子，功能性筛选平台的可用性对于确定其生物学作用至关重要。

该RNAi协议的一个局限是不适合分析黄蜂发育早期阶段的基因，因为将dsRNA注入宿主体内的黄蜂卵中技术上具有挑战性。为克服这一问题，建立体外养殖系统可能是一个有用的方法²²。或者，使用直接父母（DIPA）-CRISPR的基因敲除方法可能提供补充策略，即将试剂注射到成年雌性体内，生成基因组编辑的后代²³。事实上，该方法通过向成虫雌虫或晚期蛹期²⁴的个体注射试剂，成功地在蛹体外寄生虫Nasonia vitripennis中生成基因敲除个体。结合我们基于RNAi的基因敲低方法，这些方法将促进对寄生过程相关基因功能的更全面分析。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL管	Greiner Bio-One	210261	感染检测
1 mL注射器	TERUMO	SS-01T	dsRNA注射
琼脂	Daisin, Ltd.	P-700	饲养
Asnol培养皿φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	感染检测
Asnol培养皿φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA注射
蓝色染料（Erioglaucine二钠盐）	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA注射
对羟基苯甲酸丁酯	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	饲养
CO2压力调节器	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	感染检测
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	LSM700	图像分析
玉米粉	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	饲养
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	核染色，1:10000
去离子水	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	感染检测
双段玻璃微管拉制器	Narishige	PC-10	dsRNA注射
Fiji	NA	https://fiji.sc	图像分析
滤纸	Advantec	ITEM 526	饲养
苍蝇食物瓶	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	饲养
苍蝇食物瓶塞	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	饲养
镊子	Dumont Biologie	11252-20	解剖
-20 ℃冷冻机	Nihon Freezer	GS-3120HC	样品存储
-80 ℃冷冻机	Nihon Freezer	CLN-52UD2	样品存储
玻璃载玻片	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	感染检测
葡萄糖	Showa Sangyo Co., Ltd.	未提供	饲养
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA合成
孵化器	Panasonic	MIR-254-PJ	饲养
连接高版2	Toyobo	LGK-201	dsRNA合成
微量移液器研磨器	Narishige	EG-401	dsRNA注射
矿物油	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA注射
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA注射
Nanoject玻璃毛细管	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA注射
pBluescript KS (+)质粒	未提供	未提供	dsRNA合成
pBluescript SK (-)质粒	未提供	未提供	dsRNA合成
PrimeScript逆转录酶	Takara	2680A	dsRNA合成
丙酸	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	饲养
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	感染检测，dsRNA注射。
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus试剂	Takara	9108	qRT-PCR
小瓶（12 mL试管）	Sarstedt	REF 58.487	感染检测
小瓶塞	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	感染检测
铲子	As One Corporation	6-522-02	饲养
方形培养皿	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA注射
立体显微镜	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	感染检测
立体显微镜	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA注射
T7 RiboMAX Express RNAi系统	Promega	P1700	dsRNA合成
Thermal Cycler Dice Real Time系统	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA合成，qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	未提供	qRT-PCR
维生素C，L-抗坏血酸	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	饲养
Welch's葡萄汁100	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	感染检测
酵母	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	饲养