保留小鼠嗅觉神经系统模型中 in vivo 组织复杂性以全组织分析研究神经再生

Francesca Oieni; Joshua Ingles; James A St John; Ronak Reshamwala

doi:10.3791/72036

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方法文章

保留小鼠嗅觉神经系统模型中 in vivo 组织复杂性以全组织分析研究神经再生

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DOI：

10.3791/72036

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2026年8月18日

Francesca Oieni¹^,² , Joshua Ingles¹^,² , James A St John¹^,² , Ronak Reshamwala¹^,²

¹Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, ²Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

本文内容

摘要

本方案概述了完整的小鼠嗅觉神经系统的解剖学复杂性保存流程。本文详细描述了包括解剖、组织制备和成像在内的完整操作流程。该方案可用于在正常或异常条件下研究嗅觉系统，包括其自然修复状态。

摘要

在三维（3D）成像时代，传统的免疫组织化学技术在病理学和复杂人体解剖学研究中已显示出显著局限性。由于仅能分析薄层切片，较大结构和组织架构的关键特征可能丢失重要的上下文信息，从而导致不完整或误导性的解释。尽管二维（2D）切片有助于对组织结构形成基本认识，但不足以呈现生物组织真实的三维结构。

目前，越来越多的研究在多个解剖区域采用分离完整解剖单位的技术——如铺片、整体装片或表面装片制备方法——并结合高分辨率荧光显微镜进行观察。这些方法能够更全面地可视化和解析组织结构的排列方式。这一点在嗅觉神经系统中尤为重要，因为要阐明其强大再生能力背后的复杂细胞机制，必须依赖完整的全层组织背景。而薄切片则可能遗漏一些尚未明确的关键病理生理特征。

鉴于这些局限性以及对驱动嗅觉再生的细胞相互作用认知尚存空白，开发一种能够完整保留全层组织复杂性的精细整体封片技术至关重要。将整个嗅黏膜以全层样本形式分离，并结合优化的抗体渗透方案。通过高分辨率成像（EVIDENT SpinSR）和三维重建，实现了对细胞间相互作用的精确可视化体内.

引言

嗅觉神经系统（ONS）是研究神经再生机制的一个独特且成熟的模型，因为它在整个生命过程中都保持着神经元更新的独特能力¹。然而，由于我们对嗅觉系统中细胞行为的理解仍存在显著空白，这种神经修复能力在临床上的转化潜力仍然有限²^,³^,⁴。包括初级嗅觉神经元、嗅鞘细胞（OECs）和神经周成纤维细胞在内的ONS细胞反应及其解剖结构已在多项动物研究中被描述，这些研究依赖于超薄（<2 µm）组织切片技术，并结合对啮齿类动物ONS施加严重物理损伤的模型¹^,²。这些研究通常在损伤后10天处死动物，因而仅能提供一个狭窄的时间窗口，反映神经损伤过程中该组织广泛而复杂重塑的某一特定时刻²。这些研究报道了轴突死亡后，OECs和成纤维细胞会持续存在，并形成沿损伤路径延伸的连续通道。

尽管具有一定的信息量，但由于上述诸多局限性，所采用的方法仅在浅表层面提供了嗅神经系统的低分辨率概念性概述，最终无法对完整嗅神经系统内的真实细胞结构进行综合评估³。因此，一些关键的空间关系可能被忽略。

三维组织结构的保存对于精确的解剖学和细胞分析至关重要，并已成功应用于多种器官和病理研究⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²。整体染色方法已被用于绘制嗅黏膜内的神经组织结构¹³^,¹⁴，然而，包含完整固有层在内的全层嗅神经上皮结构中细胞相互作用的可视化尚未实现。

本研究建立了一种利用小鼠模型的工作流程，结合整装组织处理、免疫染色、高分辨率成像和三维重建技术，实现对嗅神经上皮结构的详细分析。该方案旨在弥补现有已发表方法中的不足，能够完整保存包括固有层在内的全层嗅黏膜，从而支持细胞间相互作用的研究。值得注意的是，这种优化的组织采集与处理方法可适用于多种嗅觉系统模型，并可与其他模型联用。

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方案

所有涉及动物和转基因修饰细胞的实验均经格里菲斯大学生物安全委员会（NLRD/003/2020_var3）和格里菲斯大学动物伦理委员会（MHIQ/04/23/AEC）批准，并遵循澳大利亚联邦基因技术监管机构（OGTR）的指南进行。

注意：本研究共使用了15只成年实验小鼠（8–9周龄），雌雄均有。具体为S100β-DsRed转基因小鼠，其所有嗅鞘细胞（OECs）在S100β启动子的调控下表达明亮的红色蛋白DsRed。S100β属于一类广泛存在的钙结合蛋白家族，通常在中枢神经系统中的胶质细胞（如OECs）中表达。该模型适用于本实验目的，可利用内源性荧光信号轻松定位目标细胞群。S100β-DsRed转基因小鼠此前已被成功构建，已有研究表明，与固定组织分析中的免疫组织化学方法相比，使用此类转基因小鼠可显著提高OECs的检测灵敏度¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸。

1. 头部采集与组织固定

在实验时间点，通过逐渐增加 CO₂ 吸入法对动物实施安乐死。
通过角膜和足底回缩反射消失确认死亡，随后进行颈椎脱位，或按照批准的标准操作程序（SOP）执行。
使用剪刀完整切除头部和下颌。
剥离颅骨上的皮肤，并切除鼻尖处的软骨以暴露鼻腔，确保固定剂能够有效渗透。
注意：观察发现，切除动物鼻部最前端的软骨是确保鼻腔内组织正确固定的關鍵步骤。
用 1× PBS 快速冲洗头部，以去除多余血液。
将头部在 4 °C 条件下，于 4% 多聚甲醛中浸没固定过夜（12–18 小时），或至少固定 6 小时（足以固定目标组织），并在摇床上持续振荡。
警告：多聚甲醛为危险化学品，会释放甲醛蒸气。经吸入、皮肤接触或摄入后具有毒性，可引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激，且为疑似致癌物。必须在通风橱内操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括手套、实验服和眼部防护装置。实验过程中产生的危险化学品和生物废弃物必须依照机构和当地法规进行安全处置。
注意：在优化过程中，我们发现 6 小时已足以固定目标组织；然而，超过 12 小时可能导致过度固定并引起黏膜结构降解。
将头部从固定剂中取出，在室温（20–25 °C）下用 1× PBS 在摇床上洗涤 3 小时。
将头部保存于新鲜的 PBS 中，置于 4 °C 冷藏，并在 48 小时内取材完整的黏膜组织整体标本

2. 整体组织采集

在显微镜下进行组织分离。
使用解剖刀沿正中矢状线将头部切为两半。
暴露鼻腔内部（图1）。识别解剖区域，并采集覆盖整个解剖区域的黏膜组织（图1B）。
使用骨剪轻轻折断并移除覆盖部分黏膜腔的鼻中隔骨。
注意：见 图2A；此步骤至关重要，可暴露骨下方凹陷的腔隙，嗅神经束由此穿过背侧壁（图1B）。
暴露该区域后，使用弯头镊子轻轻分离并挖取凹陷背侧壁上的组织。从下方骨组织上抬起组织，并轻柔剥离残留的嗅黏膜，以获取完整的整体装片标本。
注意：此步骤需格外小心，避免撕裂组织。
采集左右两侧鼻孔的目标组织：黏膜覆盖鼻中隔、左右背侧壁以及鼻腔的筛板（图1A，B）。采集包括鼻中隔、背侧壁和筛板在内的双侧鼻孔组织，以分离包含主要嗅觉结构的解剖区域（图2C）。
用1× PBS冲洗采集的组织，并去除包括骨碎片在内的无关组织。将组织置于1× PBS中，4 °C保存，用于后续免疫组织化学分析。
注意：若需长期保存组织，建议将其存放在含1× PBS和0.001%（W/V）叠氮化钠的溶液中，4 °C保存。

3. 优化的染色方案

注意：常用的染色方案通常针对薄至中等厚度的切片（例如，不超过 50 µm）进行优化。因此，该方案需要针对更厚的组织进行调整。
关键步骤包括在整个染色过程中使组织悬浮于离心管内，并在试剂渗透时将离心管置于滚筒上缓慢旋转。因此，染色步骤并未将组织直接放置于成像载玻片上进行。组织首先在悬浮状态下完成染色，随后再转移至成像载玻片上进行封片。这些细节确保了组织不会发生折叠，同时试剂和抗体能够充分渗透整个组织区域。

从储存中取出组织，放入含有封闭液的离心管中（封闭液的具体成分取决于染色方案）。
注意：封闭液配方为含3% BSA和0.3% Triton X-100的PBS缓冲液。另一个关键调整是组织接触每种试剂和抗体混合物的时间。
将组织在室温下置于滚转仪上，用封闭液孵育3小时。
注意：观察发现，若延长组织与所选抗体及染色试剂（表1）的孵育时间，相较于标准的薄切片免疫组织化学染色方法，无需提高抗体和试剂的浓度。这也有助于减少昂贵抗体试剂的使用量。孵育在1.5 mL离心管中进行，管盖的固定夹已被剪除，以便在滚转仪上滚动。试剂用量为500 µL。
在4°C条件下，将组织与一抗在滚转仪上孵育72小时。
在室温下，用1× PBS缓冲液在滚转仪上洗涤组织两次，每次1.5小时。
将组织与二抗（用铝箔包裹避光）以及细胞核染色剂在室温下于滚转仪上孵育至少4小时，随后转移至4°C继续在滚转仪上孵育过夜（12–18小时）。
在室温下，用1× PBS缓冲液在滚转仪上洗涤组织两次，每次1.5小时。

4. 载玻片制备

轻轻从离心管中取出组织
在显微镜下将组织置于载玻片上，并确保组织无折叠。
注意：无需荧光即可在显微镜下识别组织的方向。黏膜组织的固有层一侧应朝向盖玻片，上皮层则应贴附于载玻片表面。固有层可通过其中可见的粗大神经束进行识别，这些结构无需染色即可观察。将固有层朝向盖玻片、上皮层贴附于载玻片的摆放方式，有助于后续染色及成像过程。
使用荧光封片剂封片，并密封载玻片。
载玻片可在室温避光条件下干燥过夜（12–18 小时）后，于 4 °C 保存

5. 图像采集与后期处理

低倍率免疫荧光图像的获取
1. 使用线性 alpha 混合在图像采集期间进行自动拼接。
  注意: 应根据样本厚度调整z轴堆叠图像的帧数，以确保完全覆盖组织体积。
2. 以15%的重叠度捕获相邻视野。采用蛇形采集模式获取拼接图像。
3. 根据组织的厚度调整光学切片的总数。
4. 将X轴和Y轴的图像标定设置为215.594 nm/像素。使用0.8 µm的Z步长，以Z轴层叠方式采集图像。
5. 将固定好的整体组织样本置于共聚焦显微镜载物台上，使用30倍物镜（NA 1.04）采集概览图像。
高倍免疫荧光图像的采集
1. 使用60×物镜（NA 1.5）获取详细图像。将图像校准设置为X轴和Y轴均为107.923 nm/像素。采用0.41 µm的Z轴步长采集Z轴层扫图像。
2. 根据组织厚度调整光学切片的总层数，并从单一视野采集图像。
  注意：60× 采集无需图像拼接，因为每个数据集均由单个视野组成。
获取组织学参考图像
1. 使用切片扫描显微镜在明场照明下对小鼠头部中矢状切面的HE染色切片进行成像。
2. 使用40×物镜（NA 0.95）和0.63倍相机放大倍率进行成像，获得25.2×的有效放大倍数。
3. 确认X轴和Y轴的像素标定为136.905 nm/像素，并以单焦平面采集图像。
4. 使用蛇形采集模式和线性 alpha 融合自动拼接平铺图像。
获取全视野免疫荧光参考图像
1. 使用10倍物镜获取互补的免疫荧光概览图像。
2. 使用0%拼接重叠进行图像采集，以单个z平面截面捕获样本。
3. 将图像校准设置为X轴和Y轴均为647.249 nm/像素，并生成涵盖整个目标解剖区域的概览图像。
图像处理与最终图件的生成
1. 将获取的图像数据集导出至图像分析软件。由z轴层扫数据集生成最大强度投影（MIP）。
2. 选择感兴趣区域（ROIs）用于后续分析和图像制备。
3. 将免疫荧光整体概览图像与相应的苏木精-伊红（HE）染色图像合并，生成解剖学参考图。随后，在制图前验证荧光图像与组织学数据集之间的对齐情况及解剖结构对应关系。
  注意: 所有图像拼接均应在图像采集过程中，使用预设的显微镜参数自动完成，无需额外的后期处理。在本研究中，三维重建通过 Imaris 软件生成：利用基于各采集通道阈值强度的表面渲染插件，完成三维重构。最终图像使用 Adobe Illustrator 软件进行整合。

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结果

本文所展示的整体组织方法能够完整地分离并保存嗅黏膜。在我们的研究中，重点是理解宏观（完整的解剖结构视图）和微观（细胞水平）尺度上的细胞与解剖学变化。

整体组织染色方法使我们能够同时收集上皮和固有层区室，并保持轴突束、嗅鞘细胞（OECs）和成纤维细胞——即我们关注的细胞类型——之间的空间关系。该方法获得了大范围、连续的数据集，完整覆盖了黏膜组织的全层厚度和广阔表面积（图3），使我们能够观察到复杂的细胞结构及其相互作用的细节（图3），并比较在完整状态（n = 3）（图3A、B）与损伤状态（n = 12）（图3C、D）下这些结构的变化情况。

通过将这种优化的组织处理和染色方法与高分辨率共聚焦显微镜相结合，我们获得了覆盖更广泛黏膜区...

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讨论

近几十年来，三维技术时代逐渐拉开序幕，科学领域涌现出许多创新方法。例如，得益于复杂的整体成像技术与高分辨率荧光显微镜的结合发展，三维重建方法得以实现，从而促进了对多种全层组织组织架构的深入理解。这些三维可视化技术已被用于解析人体多个结构，如血管、腺体以及常见肿瘤⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹。此外，研究人员已收集到关于病理结构与正常结构差异的信息，例如在完整小鼠大脑中的研究结果¹⁰^,¹¹^,¹²。该方法被认为是在深入理解各类生物系统方面至关重要的一步，有助于更全面地认识细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了Clem Jones基金会、Perry Cross脊髓研究基金会和昆士兰机动车事故保险委员会对JSTJ和RR的资助，RR还获得了国家伤害保险计划昆士兰研究员项目的支持，FO获得了Perry Cross脊髓研究基金会研究员项目的支持。本项目的部分研究得到了“格里菲斯大学研究生研究奖学金（GUPRS）”和“格里菲斯大学国际研究生研究奖学金（GUIPRS）”对FO的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A3294-50G	免疫组织化学
Adobe Illustrator		版本 28.5
抗-beta III 微管蛋白抗体 - 神经元标志物	Abcam	ab18207
抗-PDGFR β 抗体 [APB5]	Abcam	ab91066
双苯并咪唑 H 33342 三盐酸盐	Sigma Aldrich	14533
24×50 mm 盖玻片，1.5 号，100 片/盒	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	免疫组织化学
驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Dumont #15A 骨剪 - 环氧涂层	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	组织解剖
Dumont #7 镊子 - 生物学/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	组织解剖
羊抗大鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Imaris 软件	Imaris	版本 9.5.0	成像
Mayo 解剖剪	ProSciTech	420SS	组织解剖
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148-500G	组织处理
磷酸盐缓冲液，无菌 PBS 片剂（PBS）	Thermo Fisher Scientific	18912014	组织处理
ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36980	免疫组织化学
手术刀片 #23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	组织解剖
手术刀柄 #4	ProSciTech	T134	组织解剖
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002-25G	组织处理
蔗糖	Chem-Supply	57-50-1	组织处理
TOMO 黏附载玻片	ProSciTech	GEMS63705-09	免疫组织化学
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	免疫组织化学

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