保留小鼠嗅觉神经系统模型中 in vivo 组织复杂性以全组织分析研究神经再生

摘要

本方案概述了完整的小鼠嗅觉神经系统的解剖学复杂性保存流程。本文详细描述了包括解剖、组织制备和成像在内的完整操作流程。该方案可用于在正常或异常条件下研究嗅觉系统，包括其自然修复状态。

摘要

在三维（3D）成像时代，传统的免疫组织化学技术在病理学和复杂人体解剖学研究中已显示出显著局限性。由于仅能分析薄层切片，较大结构和组织架构的关键特征可能丢失重要的上下文信息，从而导致不完整或误导性的解释。尽管二维（2D）切片有助于对组织结构形成基本认识，但不足以呈现生物组织真实的三维结构。

目前，越来越多的研究在多个解剖区域采用分离完整解剖单位的技术——如铺片、整体装片或表面装片制备方法——并结合高分辨率荧光显微镜进行观察。这些方法能够更全面地可视化和解析组织结构的排列方式。这一点在嗅觉神经系统中尤为重要，因为要阐明其强大再生能力背后的复杂细胞机制，必须依赖完整的全层组织背景。而薄切片则可能遗漏一些尚未明确的关键病理生理特征。

鉴于这些局限性以及对驱动嗅觉再生的细胞相互作用认知尚存空白，开发一种能够完整保留全层组织复杂性的精细整体封片技术至关重要。将整个嗅黏膜以全层样本形式分离，并结合优化的抗体渗透方案。通过高分辨率成像（EVIDENT SpinSR）和三维重建，实现了对细胞间相互作用的精确可视化 体内.

引言

嗅觉神经系统（ONS）是研究神经再生机制的一个独特且成熟的模型，因为它在整个生命过程中都保持着神经元更新的独特能力¹。然而，由于我们对嗅觉系统中细胞行为的理解仍存在显著空白，这种神经修复能力在临床上的转化潜力仍然有限^2,3,4。包括初级嗅觉神经元、嗅鞘细胞（OECs）和神经周成纤维细胞在内的ONS细胞反应及其解剖结构已在多项动物研究中被描述，这些研究依赖于超薄（<2 µm）组织切片技术，并结合对啮齿类动物ONS施加严重物理损伤的模型^1,2。这些研究通常在损伤后10天处死动物，因而仅能提供一个狭窄的时间窗口，反映神经损伤过程中该组织广泛而复杂重塑的某一特定时刻²。这些研究报道了轴突死亡后，OECs和成纤维细胞会持续存在，并形成沿损伤路径延伸的连续通道。

尽管具有一定的信息量，但由于上述诸多局限性，所采用的方法仅在浅表层面提供了嗅神经系统的低分辨率概念性概述，最终无法对完整嗅神经系统内的真实细胞结构进行综合评估³。因此，一些关键的空间关系可能被忽略。

三维组织结构的保存对于精确的解剖学和细胞分析至关重要，并已成功应用于多种器官和病理研究^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}。整体染色方法已被用于绘制嗅黏膜内的神经组织结构^13,14，然而，包含完整固有层在内的全层嗅神经上皮结构中细胞相互作用的可视化尚未实现。

本研究建立了一种利用小鼠模型的工作流程，结合整装组织处理、免疫染色、高分辨率成像和三维重建技术，实现对嗅神经上皮结构的详细分析。该方案旨在弥补现有已发表方法中的不足，能够完整保存包括固有层在内的全层嗅黏膜，从而支持细胞间相互作用的研究。值得注意的是，这种优化的组织采集与处理方法可适用于多种嗅觉系统模型，并可与其他模型联用。

方案

所有涉及动物和转基因修饰细胞的实验均经格里菲斯大学生物安全委员会（NLRD/003/2020_var3）和格里菲斯大学动物伦理委员会（MHIQ/04/23/AEC）批准，并遵循澳大利亚联邦基因技术监管机构（OGTR）的指南进行。

注意：本研究共使用了15只成年实验小鼠（8–9周龄），雌雄均有。具体为S100β-DsRed转基因小鼠，其所有嗅鞘细胞（OECs）在S100β启动子的调控下表达明亮的红色蛋白DsRed。S100β属于一类广泛存在的钙结合蛋白家族，通常在中枢神经系统中的胶质细胞（如OECs）中表达。该模型适用于本实验目的，可利用内源性荧光信号轻松定位目标细胞群。S100β-DsRed转基因小鼠此前已被成功构建，已有研究表明，与固定组织分析中的免疫组织化学方法相比，使用此类转基因小鼠可显著提高OECs的检测灵敏度^15,16,17,18。

1. 头部采集与组织固定

1. 在实验时间点，通过逐渐增加 CO₂ 吸入法对动物实施安乐死。
2. 通过角膜和足底回缩反射消失确认死亡，随后进行颈椎脱位，或按照批准的标准操作程序（SOP）执行。
3. 使用剪刀完整切除头部和下颌。
4. 剥离颅骨上的皮肤，并切除鼻尖处的软骨以暴露鼻腔，确保固定剂能够有效渗透。
   注意：观察发现，切除动物鼻部最前端的软骨是确保鼻腔内组织正确固定的關鍵步骤。
5. 用 1× PBS 快速冲洗头部，以去除多余血液。
6. 将头部在 4 °C 条件下，于 4% 多聚甲醛中浸没固定过夜（12–18 小时），或至少固定 6 小时（足以固定目标组织），并在摇床上持续振荡。
   警告：多聚甲醛为危险化学品，会释放甲醛蒸气。经吸入、皮肤接触或摄入后具有毒性，可引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激，且为疑似致癌物。必须在通风橱内操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括手套、实验服和眼部防护装置。实验过程中产生的危险化学品和生物废弃物必须依照机构和当地法规进行安全处置。
   ​注意：在优化过程中，我们发现 6 小时已足以固定目标组织；然而，超过 12 小时可能导致过度固定并引起黏膜结构降解。
7. 将头部从固定剂中取出，在室温（20–25 °C）下用 1× PBS 在摇床上洗涤 3 小时。
8. 将头部保存于新鲜的 PBS 中，置于 4 °C 冷藏，并在 48 小时内取材完整的黏膜组织整体标本

2. 整体组织采集

1. 在显微镜下进行组织分离。
2. 使用解剖刀沿正中矢状线将头部切为两半。
3. 暴露鼻腔内部（图1）。识别解剖区域，并采集覆盖整个解剖区域的黏膜组织（图1B）。
4. 使用骨剪轻轻折断并移除覆盖部分黏膜腔的鼻中隔骨。
   注意：见 图2A；此步骤至关重要，可暴露骨下方凹陷的腔隙，嗅神经束由此穿过背侧壁（图1B）。
5. 暴露该区域后，使用弯头镊子轻轻分离并挖取凹陷背侧壁上的组织。从下方骨组织上抬起组织，并轻柔剥离残留的嗅黏膜，以获取完整的整体装片标本。
   注意：此步骤需格外小心，避免撕裂组织。
6. 采集左右两侧鼻孔的目标组织：黏膜覆盖鼻中隔、左右背侧壁以及鼻腔的筛板（图1A，B）。采集包括鼻中隔、背侧壁和筛板在内的双侧鼻孔组织，以分离包含主要嗅觉结构的解剖区域（图2C）。
7. 用1× PBS冲洗采集的组织，并去除包括骨碎片在内的无关组织。将组织置于1× PBS中，4 °C保存，用于后续免疫组织化学分析。
   注意：若需长期保存组织，建议将其存放在含1× PBS和0.001%（W/V）叠氮化钠的溶液中，4 °C保存。

3. 优化的染色方案

注意：常用的染色方案通常针对薄至中等厚度的切片（例如，不超过 50 µm）进行优化。因此，该方案需要针对更厚的组织进行调整。
​关键步骤包括在整个染色过程中使组织悬浮于离心管内，并在试剂渗透时将离心管置于滚筒上缓慢旋转。因此，染色步骤并未将组织直接放置于成像载玻片上进行。组织首先在悬浮状态下完成染色，随后再转移至成像载玻片上进行封片。这些细节确保了组织不会发生折叠，同时试剂和抗体能够充分渗透整个组织区域。

1. 从储存中取出组织，放入含有封闭液的离心管中（封闭液的具体成分取决于染色方案）。
   ​注意：封闭液配方为含3% BSA和0.3% Triton X-100的PBS缓冲液。另一个关键调整是组织接触每种试剂和抗体混合物的时间。
2. 将组织在室温下置于滚转仪上，用封闭液孵育3小时。
   注意：观察发现，若延长组织与所选抗体及染色试剂（表1）的孵育时间，相较于标准的薄切片免疫组织化学染色方法，无需提高抗体和试剂的浓度。这也有助于减少昂贵抗体试剂的使用量。孵育在1.5 mL离心管中进行，管盖的固定夹已被剪除，以便在滚转仪上滚动。试剂用量为500 µL。
3. 在4°C条件下，将组织与一抗在滚转仪上孵育72小时。
4. 在室温下，用1× PBS缓冲液在滚转仪上洗涤组织两次，每次1.5小时。
5. 将组织与二抗（用铝箔包裹避光）以及细胞核染色剂在室温下于滚转仪上孵育至少4小时，随后转移至4°C继续在滚转仪上孵育过夜（12–18小时）。
6. 在室温下，用1× PBS缓冲液在滚转仪上洗涤组织两次，每次1.5小时。

4. 载玻片制备

1. 轻轻从离心管中取出组织
2. 在显微镜下将组织置于载玻片上，并确保组织无折叠。
   注意：无需荧光即可在显微镜下识别组织的方向。黏膜组织的固有层一侧应朝向盖玻片，上皮层则应贴附于载玻片表面。固有层可通过其中可见的粗大神经束进行识别，这些结构无需染色即可观察。将固有层朝向盖玻片、上皮层贴附于载玻片的摆放方式，有助于后续染色及成像过程。
3. 使用荧光封片剂封片，并密封载玻片。
4. 载玻片可在室温避光条件下干燥过夜（12–18 小时）后，于 4 °C 保存

5. 图像采集与后期处理

1. 低倍率免疫荧光图像的获取
   1. 使用线性 alpha 混合在图像采集期间进行自动拼接。
      ​注意: 应根据样本厚度调整z轴堆叠图像的帧数，以确保完全覆盖组织体积。
   2. 以15%的重叠度捕获相邻视野。采用蛇形采集模式获取拼接图像。
   3. 根据组织的厚度调整光学切片的总数。
   4. 将X轴和Y轴的图像标定设置为215.594 nm/像素。使用0.8 µm的Z步长，以Z轴层叠方式采集图像。
   5. 将固定好的整体组织样本置于共聚焦显微镜载物台上，使用30倍物镜（NA 1.04）采集概览图像。
2. 高倍免疫荧光图像的采集
   1. 使用60×物镜（NA 1.5）获取详细图像。将图像校准设置为X轴和Y轴均为107.923 nm/像素。采用0.41 µm的Z轴步长采集Z轴层扫图像。
   2. 根据组织厚度调整光学切片的总层数，并从单一视野采集图像。
      ​注意：60× 采集无需图像拼接，因为每个数据集均由单个视野组成。
3. 获取组织学参考图像
   1. 使用切片扫描显微镜在明场照明下对小鼠头部中矢状切面的HE染色切片进行成像。
   2. 使用40×物镜（NA 0.95）和0.63倍相机放大倍率进行成像，获得25.2×的有效放大倍数。
   3. 确认X轴和Y轴的像素标定为136.905 nm/像素，并以单焦平面采集图像。
   4. 使用蛇形采集模式和线性 alpha 融合自动拼接平铺图像。
4. 获取全视野免疫荧光参考图像
   1. 使用10倍物镜获取互补的免疫荧光概览图像。
   2. 使用0%拼接重叠进行图像采集，以单个z平面截面捕获样本。
   3. 将图像校准设置为X轴和Y轴均为647.249 nm/像素，并生成涵盖整个目标解剖区域的概览图像。
5. 图像处理与最终图件的生成
   1. 将获取的图像数据集导出至图像分析软件。由z轴层扫数据集生成最大强度投影（MIP）。
   2. 选择感兴趣区域（ROIs）用于后续分析和图像制备。
   3. 将免疫荧光整体概览图像与相应的苏木精-伊红（HE）染色图像合并，生成解剖学参考图。随后，在制图前验证荧光图像与组织学数据集之间的对齐情况及解剖结构对应关系。
      注意: 所有图像拼接均应在图像采集过程中，使用预设的显微镜参数自动完成，无需额外的后期处理。在本研究中，三维重建通过 Imaris 软件生成：利用基于各采集通道阈值强度的表面渲染插件，完成三维重构。最终图像使用 Adobe Illustrator 软件进行整合。

结果

本文所展示的整体组织方法能够完整地分离并保存嗅黏膜。在我们的研究中，重点是理解宏观（完整的解剖结构视图）和微观（细胞水平）尺度上的细胞与解剖学变化。

整体组织染色方法使我们能够同时收集上皮和固有层区室，并保持轴突束、嗅鞘细胞（OECs）和成纤维细胞——即我们关注的细胞类型——之间的空间关系。该方法获得了大范围、连续的数据集，完整覆盖了黏膜组织的全层厚度和广阔表面积（图3），使我们能够观察到复杂的细胞结构及其相互作用的细节（图3），并比较在完整状态（n = 3）（图3A、B）与损伤状态（n = 12）（图3C、D）下这些结构的变化。

通过将这种优化的组织处理和染色方法与高分辨率共聚焦显微镜相结合，我们能够获得更广泛黏膜区域的图像，其在整个组织深度范围内均呈现出丰富且精确的细胞水平细节。通过对多个相邻区域进行Z轴层扫成像，可在不牺牲分辨率或信号完整性的前提下，重建出连续的解剖结构域（图4A–F）。由于图像具有高分辨率的细胞细节，我们还可利用贯穿整个组织厚度的Z轴层扫数据（图4G）生成三维渲染图像（图4H），以进一步理解组织的微细结构。

在无需荧光标记的情况下，始终能够可靠地确定组织在封片和成像前的取向。在明场显微镜下，黏膜下层一侧因存在较粗的神经束而易于识别，可明显区别于上皮层。通过将黏膜下层一侧紧贴盖玻片、上皮表面紧贴载玻片的方式对样本取向进行标准化，可提高不同样本间成像的一致性，并有助于后续的三维重建。抗体渗透情况可通过分析组织全厚度内观察到的相应信号来确定。通常表现为无信号，或信号随组织深度增加而逐渐减弱。

在 Imaris 中进行的三维重建实现了对完整黏膜内复杂的细胞网络和轴突组织的清晰可视化。通过通道特异性强度阈值应用的基于表面的重建，生成了准确的组织结构三维图像，同时保留了精细的结构细节。

在染色与显像过程中，预期结果应包括能够清晰观察到目标染色信号，且在整个组织厚度范围内无异常信号丢失或信号减弱现象。若在显微镜下无法观察到已知的染色目标，则应视为实验未成功。

图1．解剖区域示意图与黏膜全层铺片组织的叠加图。（A–C）。 小鼠左侧鼻腔内侧的矢状切面图（苏木精和伊红，HE染色）（A），叠加了来自相同区域的黏膜全层铺片染色图像（用于解剖定位）（B），显示绿色的轴突束和蓝色的细胞核。该技术实现了完整解剖结构的保存：可清晰区分初级嗅神经（ON）和副嗅神经（犁鼻神经，VNN）的轴突束，并追踪其从鼻中隔经筛板至嗅球（OB）的走行路径（B, C）。本图所示组织经Hoechst染色标记细胞核（蓝色）和β-III-Tubulin染色标记轴突束（绿色）。代表性图像来自 n = 15 次独立制备实验。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2．嗅觉系统的宏观与示意图。（A）使用骨剪沿红色虚线切除鼻中隔骨（黄色区域）。（B）暴露下方的凹形鼻腔（棕色）后，可采集从该区域延伸至呼吸区黏膜和嗅觉黏膜的全部黏膜组织。（C）图示说明这些结构从嗅上皮延续至嗅球的连续性。请点击此处查看该图的放大版本。

图3采用整体封片采集与染色方案获得的解剖区域扩展视图。 (A–D). 健康和受损黏膜的代表性图像如图所示。从上到下分别为来自健康组织的完整黏膜（n = 3）和受损黏膜（n = 12）。在健康组织中（A），具有细长双极形态的OECs（A，左侧）包裹轴突束（A，中层），成纤维细胞则构成这些隧道样结构的外层（A，右侧，白色箭头）。所选的三个ROI反映了这些细节（B）。在受损的黏膜中，OECs 呈现双极形和圆形两种形态（C，D，左侧，白色箭头）。轴突束显得不那么均匀和致密（C, D，中部，白色箭头）。成纤维细胞在整个区域内广泛分布（C, D，右侧，白色箭头）。比例尺 = 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 4．黏膜全层组织的三维荧光成像。（A–H）使用 SpinSR 显微镜对多个连续区域的图像堆栈进行采集，获得低倍（A–F）和高倍（G）图像。嗅鞘细胞（OECs）显示为红色，成纤维细胞为品红色，轴突为绿色，细胞核为蓝色。箭头指示不同的 OEC 形态（A），以及轴突束周围成纤维细胞的外层结构（B 和 C）。D–F 中的箭头突出显示成纤维细胞健康结构的相似性。这些图像清晰展示了细胞组分的空间分布，随后使用 Imaris 软件进行三维重建（H）。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

试剂	靶标	稀释比例	孵育条件	原理
一抗
β-III-Tubulin (Rabbit)	轴突	1:300	4 °C 下滚轴摇床孵育 72 小时	确保抗体充分穿透组织全层
PDGFR-β (Rat)	成纤维细胞	1:100
二抗
Alexa 488	兔源一抗	1:250	用铝箔包裹，在室温下于滚轴摇床上孵育至少 4 小时，随后在 4 °C 下继续于滚轴摇床上过夜孵育	铝箔可防止荧光淬灭；孵育时间、温度及滚轴引起的扰动有助于实现良好的抗体渗透
Alexa 647	大鼠源一抗	1:500
细胞核染色
Hoechst	细胞核	1:2500

表1：针对本实验方案优化稀释比例的抗体列表。 本表格列出了染色试剂及其靶标、稀释比例，以及孵育条件的选择依据。

讨论

近几十年来，三维技术时代逐渐拉开序幕，科学领域涌现出许多创新方法。例如，得益于复杂的整体成像技术与高分辨率荧光显微镜的结合发展，三维重建方法得以实现，从而促进了对多种全层组织组织架构的深入理解。这些三维可视化技术已被用于解析人体多个结构，如血管、腺体以及常见肿瘤^4,5,6,7,8,9。此外，研究人员已收集到关于病理结构与正常结构差异的信息，例如在完整小鼠大脑中的研究结果^10,11,12。该方法被认为是在深入理解各类生物系统方面至关重要的一步，有助于更全面地认识细胞回路、其结构与功能的空间组织方式，以及它们在人类疾病中可能发挥的作用。

三维组织重建与成像不同组合方式的一个缺点是，大多数方法都涉及组织透明化步骤。尽管该方法对许多组织有用，但并不适用于所有类型的组织^8,9,19。事实上，透明化过程包含多个洗涤步骤，可能会破坏靶向表位并影响内源性信号²⁰。

上述方法已被用于定义不同系统中的许多重要细胞结构。然而，嗅觉系统及其感兴趣结构的骨性成分极少，难以从中轻易分离；因此，近年来已尝试采用不包括透明步骤的整体组织染色方法^13,14。

这些研究认识到，更清晰地界定嗅觉系统中神经元结构的组织具有重要意义。因此，其主要目标是基于不同标志物的表达，提供嗅觉感觉神经元分布的清晰拓扑图谱¹⁴，并揭示其特殊纤毛的新见解¹³。

本文开发并展示的整体封片技术能够完整地收集和保存黏膜组织，从而为深入理解该环境的解剖学和生理学结构提供可能，尤其在本研究中重点关注嗅鞘细胞（OECs）、成纤维细胞与轴突束之间的关系。将这种优化的分离与染色技术与高分辨率共聚焦成像相结合，可获得反映整个目标区域及其定居细胞结构的大幅图像。具体而言，我们的优化技术具有两个显著优势：其一，能够完整收获并处理包括固有层结构¹³在内的全部黏膜组织；其二，更温和的组织制备方法有助于在宏观尺度上保持组织解剖结构以及细胞间的相互作用（例如嗅鞘细胞、轴突和成纤维细胞），相较于其他平铺封片方案具有明显优势¹⁴。正因如此，本实验方案未包含与薄切片染色的对比验证步骤。

如上所述，整体染色技术通常涉及较长的组织处理周期以及特定且昂贵的试剂。本方法的开发着重于尽量减少组织处理步骤，以缩短处理时间并降低重要细胞结构受损的风险。因此，优化后的方法代表了一种快速流程，可使用常用于薄切片免疫组织化学的常规试剂完成，为那些需要更长处理时间且不适用于无骨结构（如黏膜组织）的方法提供了一种有效的替代方案。

图像采集和后期处理可使用任何能够从厚组织样本中获取高分辨率z轴堆栈图像的共聚焦显微镜平台完成，且该平台需具备足够的激光穿透能力，以对目标黏膜进行成像（有关我们采集及图像处理参数的更多细节，请参见方法部分）。

经过适当改进，我们认为该方案可推广并应用于其他常见的啮齿类动物模型。通过一些组织特异性的调整，该方法可适用于多种不同研究场景，包括呼吸系统和胃肠道（GIT）黏膜及黏膜下组织的研究；神经系统内组织结构与多系统相互作用的探讨；炎症过程及黏膜相关淋巴组织（MALTs）的分析；以及诸如肠-脑轴等不同多系统轴的探索。

本方案的主要优势在于方法学上的改进，这些改进不仅能够在保持组织完整性的前提下实现高质量的三维成像，而且与此前在该领域尝试过的其他整体封片方法相比，还具有相对较快的操作速度。

该方法的成功实施在很大程度上依赖于对目标组织的深入解剖学理解。事实上，在本研究中，了解轴突束的预期定位对于在暴露颅腔后最大限度地降低取材过程的侵入性至关重要。这种解剖学知识对于快速定位目标区域和组织、并保持黏膜整体结构的完整性具有关键作用，凸显了成功的组织处理不仅依赖于后期处理步骤，更根本上取决于科学合理的取材策略。

如方法部分的若干注释所述，多项技术调整对于本方法的建立和优化至关重要。在整个染色过程中，保持组织在离心管内自由漂浮，并在试剂和抗体孵育期间持续旋转，这是相较于更静态的整体染色和薄切片方案的关键改进步骤。该优化可防止组织折叠，同时确保试剂在整个样本中均匀渗透，从而在无需额外透明步骤的情况下提高染色的一致性。此外，对每种试剂和抗体混合物的孵育时间进行仔细优化也十分关键。最后这一步骤可能需要根据所选抗体的类型进一步调整。

上述特定因素共同作用，不仅提高了实验的可重复性，还缩短了整体处理时间，并减少了对样品的剧烈操作。

另一个重要的方法学步骤是在无需荧光标记的情况下，能够在包埋和成像前可靠地确定组织的方向。在明场显微镜下，通过观察到较粗的神经束即可轻松识别黏膜组织的固有层侧，这些神经束与周围的上皮组织有明显区别。通过将固有层朝向盖玻片一侧、上皮层置于载玻片上的方式标准化样本方向，可提高图像采集的质量。这一简单而有效的优化措施改善了不同样本间成像的一致性，并有助于获得高质量的三维重建图像。

然而，该方案也存在一些局限性。本方案尚未在多种常见小鼠品系或其他啮齿类动物物种上进行测试。同样，优化过程仅在上述特定实验条件下，并仅使用所列出的抗体组合进行。尽管该方案应适用于大多数小鼠和大鼠品系、多种不同抗体以及任何能够完整获取黏膜全层的实验模型，但仍可能需要进一步仔细优化。另一个显著的局限性是，单个整体组织样本只能使用一组抗体进行染色，而不同于切片组织——在切片组织中，每张切片可使用不同的抗体组合染色，因此可在切片组织上测试多组不同的抗体组合。

总体而言，这些方法学上的创新表明，对组织处理、染色条件和样本方向进行相对简单的调整，即可显著改善整体组织成像的效果。通过避免复杂的组织处理和透明化步骤，该方法为无骨精细组织的研究提供了一种实用且可灵活调整的替代方案，同时仍能获取详细的大尺度三维数据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A3294-50G	免疫组织化学
Adobe Illustrator		版本 28.5
抗-beta III 微管蛋白抗体 - 神经元标志物	Abcam	ab18207
抗-PDGFR β 抗体 [APB5]	Abcam	ab91066
双苯并咪唑 H 33342 三盐酸盐	Sigma Aldrich	14533
24×50 mm 盖玻片，1.5 号，100 片/盒	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	免疫组织化学
驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Dumont #15A 骨剪 - 环氧涂层	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	组织解剖
Dumont #7 镊子 - 生物学/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	组织解剖
羊抗大鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Imaris 软件	Imaris	版本 9.5.0	成像
Mayo 解剖剪	ProSciTech	420SS	组织解剖
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148-500G	组织处理
磷酸盐缓冲液，无菌 PBS 片剂（PBS）	Thermo Fisher Scientific	18912014	组织处理
ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36980	免疫组织化学
手术刀片 #23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	组织解剖
手术刀柄 #4	ProSciTech	T134	组织解剖
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002-25G	组织处理
蔗糖	Chem-Supply	57-50-1	组织处理
TOMO 黏附载玻片	ProSciTech	GEMS63705-09	免疫组织化学
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	免疫组织化学