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超声控制血脑屏障（BBB）开放在用于药物递送研究的血脑屏障-胶质母细胞瘤微流控芯片中的应用

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DOI：

10.3791/72041

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2026年8月18日

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种微流控血脑屏障-胶质母细胞瘤（BBB-GBM）芯片模型的构建方法。该模型经过血脑屏障完整性的验证，可用于研究低强度超声诱导的短暂且大部分可逆的血脑屏障开放，从而实现对超声介导的纳米胶束跨血脑屏障转运及肿瘤靶向效率的定量评估。

摘要

血脑屏障（BBB）限制了大多数治疗分子进入大脑，是治疗胶质母细胞瘤（GBM）的主要障碍。不同物种间血脑屏障在结构和功能上的差异使动物模型的临床转化变得复杂，凸显了建立与人类相关的体外血脑屏障平台以评估GBM治疗中药物通透性的必要性。本文描述了一种构建微流控血脑屏障-GBM芯片模型的实验方案。该模型在一个含Matrigel的微流控平台中建立了一个三细胞共培养系统，包括人脑微血管内皮细胞（HCMECs）、原代星形胶质细胞（ACs）和U87-MG细胞。通过连续的紧密连接蛋白-1（ZO-1）免疫荧光染色和FITC-葡聚糖通透性实验验证血脑屏障的完整性。随后采用低强度超声（US）（1 MHz，1 W/cm2，30 s）诱导血脑屏障短暂且基本可逆的开放，使靶向肿瘤的纳米胶束（SFN@RB@SPMs）能够高效穿过屏障并在GBM细胞中富集。本方案的一个关键特征是将实时血脑屏障通透性和药物递送检测整合于单一的超声响应芯片中，为深入解析超声增强GBM药物递送机制提供了强有力的平台。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）的治疗受到血脑屏障（BBB）的严重限制，该屏障几乎阻碍了所有治疗药物进入大脑1,2。BBB由无孔型内皮细胞构成，这些细胞通过紧密连接蛋白（如occludin、ZO-1）连接，并受到周细胞和星形胶质细胞终足的额外支持3。尽管动物模型在理解BBB功能方面提供了有价值的见解，但不同物种在生理和代谢上的特异性差异限制了其准确预测人类药物反应的能力4,5。因此，具有生理相关性的人源BBB模型对于评估GBM治疗中药物的通透性至关重要。

传统 体外 血脑屏障模型（如Transwell培养系统）无法充分模拟血脑屏障的复杂性，包括细胞间相互作用、动态的流体变化以及流动诱导的剪切应力6相比之下，微流控血脑屏障模型已成为更优越的平台，能够更紧密地模拟这些 体内类特性7此类器官芯片上的血脑屏障系统已被广泛用于研究脑肿瘤转移8，研究阿尔茨海默病等神经退行性疾病中血脑屏障功能障碍9，并评估药物通过血脑屏障的转运10,11然而，目前大多数现有的血脑屏障芯片模型主要用于药物通透性测试，缺乏整合可调节血脑屏障通透性的外部物理刺激的能力。近年来，聚焦超声（FUS）作为一种能够在实现显著恢复的同时短暂开放血脑屏障的策略，已展现出促进治疗药物向脑内递送的良好前景12,13既往的机制研究表明，超声诱导的机械刺激可通过重塑细胞间连接并增强内皮通透性，暂时性地调节屏障功能。例如，Silvani 等人证实，超声诱导的机械力可在内皮细胞间可逆性地形成细胞间隙 体外 器官芯片14与这些发现一致，Beekers 等人证明，超声介导的机械生物学效应可诱导内皮细胞间连接出现短暂开放，从而增加内皮通透性15最近，Qiao 等人报道，内皮屏障通透性受到超声辐照参数（特别是脉冲长度）的严格调控，强调了优化声学参数以实现安全、可控的血脑屏障调节的重要性。16尽管取得了这些进展， 体外 可同时实现超声介导的血脑屏障开放定量分析及其对纳米药物递送影响评估的平台仍然有限。

为弥补上述不足，本文提出了一种构建微流控血脑屏障-胶质母细胞瘤（BBB-GBM）芯片的实验方案。该微流控装置支持人脑微血管内皮细胞（HCMECs）、原代星形胶质细胞（ACs）和嵌于Matrigel中的U87-MG胶质母细胞瘤（GBM）细胞的三重共培养。重建的血脑屏障表现出完整屏障的结构与功能特征，表现为ZO-1在细胞间连接处连续分布，以及40 kDa FITC-葡聚糖在血管界面的扩散受限。尤为重要的是，该芯片可与可控超声刺激相结合，诱导血脑屏障短暂开放，从而提高纳米胶束的后续转运效率和肿瘤靶向能力。利用该系统，可对纳米胶束SFN@RB@SPM的转运效率和肿瘤靶向效率进行定量评估。总体而言，该平台为研究超声参数、具有可逆特性的血脑屏障调控以及胶质母细胞瘤治疗中纳米胶束递送效率的提升之间的关系提供了有力工具。

方案

所有动物实验均遵循《实验动物福利伦理审查指南（GB/T35892-2018）》，并经中国科学院大学宁波生命与健康研究院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（批准号：GK-2023-XM-0073）。所用试剂与设备列于材料表中。

1. 血脑屏障-胶质母细胞瘤类器官芯片装置的制备与准备

  1. 芯片设计与光刻掩模布局
    1. 使用 Auto CAD 软件设计芯片。
      ​注意：该芯片包含三个平行的微流控通道，分别为血液通道、脑通道和肿瘤通道。血液通道和肿瘤通道的宽度均为 1000 µm，脑通道的宽度为 1300 µm。三个通道的高度均为 150 µm，相邻通道之间由宽度为 200 µm 的梯形微柱阵列隔开，以允许不同腔室间的分子扩散和细胞通讯。详细的光刻掩模设计布局见补充图 1和补充图 2。本研究中使用的 SU-8 光刻胶型号为 3050。
  2. 使用 SU-8 光刻胶通过标准光刻工艺制备硅母模。
    1. 将空白硅片放置在匀胶机的真空卡盘上，并启动真空以牢固固定硅片。
    2. 缓慢将 10 mL SU-8 光刻胶滴加至硅片中心。
    3. 采用两步旋涂法获得均匀的光刻胶层：首先以 500 rpm 旋转 10 秒，然后以 2500 rpm 旋转 90 秒。
    4. 将涂覆好的硅片转移至加热板，在 95 °C 下进行前烘 30 分钟，以蒸发溶剂。
    5. 让硅片冷却至室温，并使用厚度测量仪测量 SU-8 层的厚度。
      注意：为获得最佳血脑屏障（BBB）形成效果，推荐通道高度为 110–150 µm。单次旋涂（步骤 1.2.3）通常产生 40–50 µm 的膜厚，因此需要进行两到三次旋涂过程以达到所需的总厚度。
  3. 光刻图形化
    1. 将掩模对准仪的紫外（UV）光强设定为 14–15 mW/cm2。
    2. 将铬版光刻掩模与涂有 SU-8 的硅片对准，并进行 10 秒的紫外曝光。
    3. 立即把硅片转移到加热板上，在以下条件下进行曝光后烘烤：65 °C 烘烤 10 秒，随后在 95 °C 烘烤 300 秒。
    4. 待硅片冷却至室温后，将其浸入显影液（丙二醇单甲醚醋酸酯，PGMEA）中，显影 4–6 分钟。
    5. 用异丙醇冲洗硅片以终止显影，随后用去离子水清洗。
    6. 使用氮气吹干硅片，并在光学显微镜下检查所形成的微通道结构。
      ​注意：若仍有未显影的光刻胶残留，需重复显影步骤，直至微结构清晰可见。
    7. 将制备完成的硅母模置于 200 °C 的烘箱中烘烤 1 小时，以增强 SU-8 光刻胶与硅片表面之间的附着力。
  4. PDMS 芯片制备
    1. 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基础预聚物与固化剂按 10:1 的质量比（w/w）充分混合 30 分钟，得到均匀的 PDMS 预聚物。
    2. 将 PDMS 混合物浇注到已制备的硅母模上，确保完全覆盖微结构。
    3. 将母模放入真空干燥器中进行脱气处理，以去除气泡。
    4. 将母模转移至烘箱中，在 65 °C 下固化 1.5–2 小时。
    5. 固化完成后，使用美工刀沿芯片边界小心切割 PDMS 层，并从硅母模上轻轻剥离。
    6. 将 PDMS 芯片浸入 70%–75% 乙醇中 30 分钟进行初步灭菌，然后用去离子水冲洗并自然晾干。
    7. 使用 2 mm 活检打孔器打出入液口和出液口。
  5. 等离子体键合与装置组装
    1. 将 PDMS 芯片和洁净的玻璃载片放入等离子清洗仪的腔室内，确保 PDMS 的微通道面朝上。
    2. 抽真空至腔室压力低于 30 Pa，然后通入氧气。
    3. 保持氧气流 90 秒，同时维持腔室压力低于 40 Pa。
    4. 将射频（RF）功率设为 55%，进行 90 秒的等离子体处理，以活化 PDMS 和玻璃表面。
    5. 立即让活化后的 PDMS 芯片与玻璃载片接触，并轻轻按压，实现不可逆键合。
    6. 将组装好的装置置于 65 °C 烘箱中 24 小时，以稳定键合效果并恢复其疏水性。
    7. 在接种细胞前，通过紫外照射对键合后的装置灭菌 30 分钟。
      注意：为保持无菌状态，应将灭菌后的芯片存放在生物安全柜内的密封培养皿中，直至使用。

2. 细胞接种与血脑屏障-胶质母细胞瘤模型的建立

  1. 准备以下试剂：
    1. 星形胶质细胞（ACs）培养基（用于脑通道）：含20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的DMEM/F12基础培养基。
    2. 人脑微血管内皮细胞（HCMECs）培养基（用于血管通道）：内皮细胞培养基（ECM）添加1% P/S。
    3. 胶质瘤（GBM）细胞培养基（用于胶质瘤通道）：含10% FBS和1% P/S的MEM基础培养基。
    4. 细胞解离试剂：使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液解离贴壁细胞。
      注意：长时间暴露于胰蛋白酶可能降低细胞活力。应在显微镜下监测细胞解离情况，并立即用完全培养基中和胰蛋白酶。
    5. 在接种至微流控装置前，将所有细胞（ACs、HCMECs和U87-MG）维持于100 mm培养皿中。
  2. 原代星形胶质细胞（ACs）的分离
    1. 从新生大鼠（出生后第1–3天）的大脑皮层中分离原代ACs。在冰上小心去除脑膜和血管后，用无菌手术剪将皮层组织剪碎，并进行酶消化处理。
    2. 用预冷的PBS洗涤解离后的细胞悬液，再用胰蛋白酶处理以获得单细胞悬液，然后通过离心（400 × g，5分钟，室温）收集细胞沉淀。
    3. 重悬细胞，并接种至含有ACs培养基的T25培养瓶中。
    4. 通过GFAP免疫荧光染色鉴定ACs。图像见补充 图3。
  3. 细胞接种
    ​注意：第1天——在脑通道中接种ACs。
    1. 向含有ACs的培养皿中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻晃动以确保均匀覆盖。
    2. 在37 °C孵育1–2分钟，直至细胞从培养皿上脱落。
    3. 加入3 mL ACs培养基（来自步骤2.1.1）以中和胰蛋白酶。轻柔吹打以获得单细胞悬液。
    4. 将细胞悬液收集至离心管中，在4 °C下以300 × g离心3分钟。
    5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL AC培养基中。
    6. 使用自动细胞计数仪测定细胞浓度，并调整密度至2.5 × 106 cells/mL。
    7. 按3:5（v/v）的比例（AC细胞: Matrigel）将ACs细胞悬液与Matrigel混合。
    8. 使用微量移液器将10 µL Matrigel-ACs混合物加入脑通道中。
      注意：操作过程中应将芯片置于冰上，以防止Matrigel过早聚合。
    9. 将芯片置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟，使Matrigel聚合并稳定细胞。
      注意：第1天——在血管通道中接种HCMECs。
    10. 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育约30秒，直至细胞脱落。
    11. 加入3 mL HCMECs培养基（步骤2.1.2）以终止酶消化反应。
    12. 轻柔吹打以形成均匀的单细胞悬液。
    13. 收集细胞悬液并在4 °C下以300 × g离心3分钟。
    14. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL HCMECs培养基中。
    15. 计数细胞并调整浓度至2 × 106 cells/mL。
    16. 小心地将10 µL HCMECs细胞悬液注入芯片的血管通道中。
    17. 将芯片侧放于细胞培养箱中孵育30分钟，以促进内皮细胞沿通道壁附着。
    18. 向血管通道中再接种10 µL HCMECs细胞悬液，以提高血管通道中的内皮细胞密度。
    19. 继续孵育30–60分钟，使HCMECs充分黏附。
    20. 向芯片入口加入100 µL混合培养基。
      注意：混合培养基由AC培养基和HCMECs培养基按1:1（v/v）比例混合而成。
      第3天——在胶质瘤通道中接种U87-MG细胞。
    21. 向培养皿中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育1–2分钟。
    22. 加入3 mL U87-MG培养基（来自步骤2.1.3）以终止消化。
    23. 轻柔吹打以获得均一的单细胞悬液。
    24. 将细胞悬液转移至离心管中，在300 × g条件下离心3分钟。
    25. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL U87-MG培养基中。
    26. 测定细胞浓度并调整密度至2 × 106 cells/mL。
    27. 将10 µL U87-MG细胞悬液注入芯片的胶质瘤通道中。
    28. 将芯片置于37 °C、5% CO2环境中孵育30–60分钟，以促进细胞附着。
    29. 向芯片入口加入100 µL U87-MG培养基。
    30. 将微流控装置继续置于37 °C、5% CO2 环境中孵育额外48小时，以促进内皮细胞紧密连接的形成。

3. 血脑屏障完整性的评估

  1. 通透性检测
    1. 用混合培养基（ACs 培养基 : HCMEC 培养基 = 1:1, v/v）配制终浓度为 10 µg/mL 的异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（FITC-葡聚糖），其分子量为 40 kDa。
    2. 向血管通道中加入 10 µL FITC-葡聚糖溶液。
    3. 将微流控芯片置于倒置荧光显微镜载物台上，每隔 20 分钟采集血管通道和相邻脑通道的荧光图像，以监测葡聚糖穿过内皮屏障的扩散情况。
    4. 使用以下公式计算表观通透性系数（Papp，cm/s）：
      Papp (cm/s)= 过程效率方程，包含 Fs、Fc、Δt；科学研究中的数学公式。
      其中 Papp 为表观通透性系数（cm/s），FS 为血液通道初始时间的荧光强度，FC为扩散时间结束时脑通道的荧光强度，Δt 为扩散时间（s），VT 为脑通道中 FITC-葡聚糖的扩散体积（cm3），A 为内皮表面积（cm2）。
      注：通透性系数越低，表明血脑屏障完整性越高，内皮屏障结构越紧密。
    5. 进行数据分析与参数定义。
      注：血液通道和脑通道的荧光强度值均通过芯片无细胞区域的背景测量值进行背景扣除。根据荧光扩散长度，在血脑界面两侧定义感兴趣区域（ROI）。内皮表面积（A）由血管通道与脑通道之间的界面面积计算得出（以两个微柱之间的间隙为参考）：200 µm × 150 µm = 30,000 µm2 = 3 × 10-6 cm2。FITC-葡聚糖扩散体积（VT）由脑通道中荧光扩散穿透距离乘以 A 得出。在 60 分钟内每 20 分钟（1200 s）采集一次荧光图像；通透性系数使用 20 分钟时间间隔的数据计算。每组实验的通透性值均来自三个独立的芯片。所有单位换算均在最终以 cm/s 表示通透性之前完成。
  2. ZO-1 的免疫荧光分析
    1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗微流控通道三次，以去除残留的培养基。
    2. 向通道中加入 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞，并在室温下孵育 10 分钟。
    3. 在室温下用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 处理细胞 15 分钟，以实现细胞通透。
    4. 在室温下用含 2% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 孵育通道 45 分钟，以封闭非特异性抗体结合位点。
    5. 向通道中加入抗 ZO-1 一抗（1:200 稀释），4 °C 下孵育过夜。
    6. 用 PBS 充分清洗通道，去除未结合的一抗。
    7. 在避光条件下，室温下用 Alexa Fluor 555 标记的抗兔二抗（1:1000 稀释）孵育芯片 45 分钟。
    8. 在避光条件下，室温下用 1 µg/mL 的 4’6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染 1 分钟。
      注：DAPI 对光敏感，染色过程中应避免光照。
    9. 用 PBS 清洗通道三次。
    10. 使用倒置荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜对微流控装置成像，以观察 ZO-1 在内皮细胞连接处的定位情况。

4. 超声增强纳米胶束经血脑屏障递送至胶质母细胞瘤细胞

  1. 超声刺激
    1. 小心地将芯片从培养皿中取出，并置于生物安全柜内。
    2. 使用配备1 MHz换能器（有效辐射面积：5 cm2）的治疗性超声系统进行超声刺激。
    3. 在超声探头与微流控芯片表面之间放置厚度为3 mm的医用级声耦合垫，以确保高效的声能传递。
    4. 将超声探头正对微流控装置的血管通道区域放置。
      ​注意：换能器与芯片之间的气泡会显著降低声能传输效率，应避免出现。
    5. 设置超声参数如下：占空比：60%；频率：1 MHz；强度：1 W/cm2；暴露时间：30 s；脉冲重复频率（PRF）：100 Hz。详细的超声参数见补充表1。
    6. 对于未处理的对照组，将超声换能器置于相同位置，但保持其不激活，作为假处理对照，确保除无声能暴露外其他操作流程一致。
    7. 超声暴露后，移除耦合垫，并立即将芯片放回无菌培养皿中。
    8. 向芯片的进样口加入新鲜培养基。
    9. 将装置置于37 °C、5% CO2条件下孵育，直至进一步分析。
  2. 评估超声诱导的血脑屏障（BBB）调节作用
    1. 在超声处理后立即（0 h）以及处理后24 h进行ZO-1免疫荧光染色，以评估紧密连接完整性的变化。
    2. 按照步骤3.2中描述的免疫荧光染色程序进行操作。
    3. 比较ZO-1染色在z轴方向上的分布，以评估超声刺激对血脑屏障紧密连接完整性的影响。
  3. SFN@RB@SPM纳米胶束的制备与表征
    1. 根据先前建立的方案17制备SFN@RB@SPM纳米胶束。简言之，将两亲性肽（命名为SPM，6 mg/mL）、RB（0.6 mg/mL）和SFN（6 mM）的储备液按体积比1:1:1混合。
    2. 将混合液置于超声仪中，在28 kHz、25 °C条件下超声处理30 min。
    3. 对混合液进行透析（截留分子量：1000 Da），持续48 h，以去除游离的RB和SFN。
    4. 采用动态光散射（DLS）法测定纳米胶束的粒径和Zeta电位。表征数据见补充图4。
  4. 评估超声刺激下纳米胶束的递送及胶质瘤细胞中的富集
    1. 超声暴露后立即将含有纳米胶束的培养基引入微流控装置的血管通道中。
    2. 为评估纳米胶束穿越血脑屏障的转运情况，将微流控芯片置于倒置荧光显微镜载物台上，在60 min内每隔20 min采集血管通道和相邻脑通道的荧光图像。
    3. 定量分析脑通道中的荧光图像，以评估超声增强的纳米胶束通透性。
    4. 为评估纳米胶束在胶质瘤细胞中的富集情况，超声暴露后在标准培养条件（37 °C，5% CO2）下孵育3 h，随后使用荧光显微镜对胶质瘤通道成像，评估细胞内纳米胶束的摄取情况。
  5. 统计分析
    1. 所有定量数据均以均值±标准误（SEM）表示。
    2. 每项实验均进行三次独立的生物学重复（n = 3个芯片/实验条件）。对每次生物学重复，至少测量三个技术重复（每个通道的感兴趣区域），以确保数据可靠性。
    3. 从每个独立芯片计算出的表观通透系数（Papp，cm/s）作为所有统计比较的主要分析单位。
      注意：两组之间的比较采用非配对双尾Student t检验；三组及以上组间的比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验进行多重比较。对于包含两个独立变量的实验，采用双因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey多重比较检验。统计分析使用统计与绘图软件完成。p值<0.05被认为具有统计学显著性。

结果

为了重现 体内 血脑屏障结构的三培养微流控芯片通过整合HCMECs、原代星形胶质细胞（ACs）和U87-MG细胞而构建（称为“芯片模型”）。如图所示 图1A,B，设备内设有三条平行通道：血管通道（左侧，蓝色）、填充Matrigel的脑组织通道（中央，粉红色）和肿瘤通道（右侧，绿色），分别接种HCMECs、ACs和U87-MG细胞。通道之间由微柱阵列分隔，微柱阵列可将Matrigel限制在中央腔室，同时允许通道间进行分子和细胞交换。设备灭菌后，向ACs中（2.5 × 106 细胞/mL）以3:5（v/v）的比例悬浮于Matrigel中，并注入脑通道。Matrigel聚合后，人脑微血管内皮细胞（HCMECs）（2 × 106 个/mL）被接种至左侧血管通道。在ACs与HCMECs共培养2天后，将U87-MG细胞（2 × 106 细胞/mL）被引入右侧肿瘤通道以建立胶质母细胞瘤（GBM）区室。芯片模型在第5天完全建立，随后评估屏障完整性。 通过 ZO-1 免疫染色及 40 kDa FITC-葡聚糖通透性测定。如图所示， 图1C，ZO-1 在 HCMEC-ACs 界面处呈现连续的线性分布，证实血脑屏障界面处形成了紧密连接。共聚焦三维重建进一步显示血管-脑通道界面处（z-y 平面）ZO-1 信号显著 图1D)，证实了芯片内完整内皮屏障的形成。为进一步确定屏障功能，检测了40 kDa FITC-葡聚糖的通透性。在1小时内每20分钟定量测定通透性。如图所示 图1E,F，渗透系数为 (3.46 ± 0.50) × 10-6 cm/s，与 体内 大鼠微循环18 以及基于诱导性多能干细胞（iPSC）的先进模型19，并且相较于传统的仅内皮细胞模型具有显著改进13上述结构与功能数据共同验证了具有生理相关性的BBB-GBM平台的成功构建。

已有研究报道，超声可诱导血脑屏障（BBB）发生短暂且基本可逆的开放，屏障功能通常在24小时内恢复20。接下来，我们利用芯片模型在超声暴露后0小时或24小时进一步研究了超声刺激对BBB功能的直接影响。芯片模型接受超声处理（1 W/cm2，1 MHz，30 s）。ZO-1的免疫荧光分析显示，超声处理后0小时和24小时的荧光强度相似（图2A），提示紧密连接结构完整性得以维持。定量ZO-1荧光分析进一步证实，对照组与超声处理组在血管-脑界面处的信号强度相当（图2B）。为深入评估超声暴露是否增强BBB通透性，本研究采用40 kDa FITC-葡聚糖作为通透性示踪剂。如图2C、D所示，超声暴露后示踪剂穿过BBB的扩散速度迅速加快，通透系数从未经处理组的4.20 × 10-6 cm/s升高至1.33 × 10-5 cm/s。在超声暴露后24小时，通透系数下降至8.04 × 10-6 cm/s，相较于超声后即刻组显示出显著恢复，尽管仍略高于未处理对照组水平。这些结果表明，低强度超声可在芯片模型中诱导血脑屏障发生短暂开放，随后屏障功能显著恢复，同时保持结构完整性。

接下来评估了在超声刺激下纳米胶束SFN@RB@SPM穿越血脑屏障（BBB）的通透性。在我们之前的研究中，这些自组装纳米胶束被证明可有效穿过血脑屏障，并在异种移植胶质瘤小鼠模型中于肿瘤部位富集17。为了检验超声调控是否可增强该芯片模型中SFN@RB@SPM的转运，我们采用了与图2C 相同的超声参数。超声处理显著加快了SFN@RB@SPM穿越血脑屏障的过程，使处理后60分钟时的通透系数从(2.42 ± 0.15) × 10-5 cm/s 提高至(4.58 ± 0.07) × 10-5 cm/s，较对照组提升了1.9倍（图3A、B）。为验证主动肿瘤靶向能力，在将纳米胶束注入血管通道后，检测了胶质瘤通道中RB的红色荧光信号。如图3C所示，超声处理3小时后，胶质瘤通道中的红色荧光明显增强，表明纳米胶束穿越血脑屏障的转运得到提升。在未施加超声的情况下，仅检测到可忽略的荧光信号，证实血脑屏障的开放对于SFN@RB@SPM到达并在肿瘤部位富集至关重要。

血脑屏障微流控芯片示意图及显示通透性数据分析的实验。
图1：芯片上BBB-GBM的构建与表征。（A）三通道微流控装置示意图：血管通道（蓝色）、脑通道（粉色）和肿瘤通道（绿色）。（B）组装完成的PDMS-玻璃芯片照片。（C）内皮细胞连接处ZO-1免疫染色（红色），DAPI复染细胞核（蓝色）。比例尺：50 µm。（D）正交共聚焦图像（x-z和y-z）显示血管-脑界面处ZO-1富集（红色）。（E）40 kDa FITC-葡聚糖在60分钟内从血管通道向脑通道扩散的代表性延时图像（每20分钟一帧）。比例尺：200 µm。（F）定量的通透系数，证实了具有尺寸选择性的屏障功能。数据为三个独立芯片（n = 3）的均值 ± 标准误（SEM）。采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey多重比较事后检验确定统计学显著性。图中显示了确切的p值。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜、通透性曲线、超声处理对比、延时成像、通透性分析。
图2：超声诱导的血脑屏障开放及其屏障功能的后续恢复。（A）在超声处理后即刻（0 h）和24 h时，血管-脑界面处ZO-1的免疫荧光染色。图中显示三维共聚焦重建图像。（B）对照组与超声处理组在血管-脑界面沿z轴（深度）方向归一化的ZO-1荧光强度。（C）40 kDa FITC-葡聚糖从血管腔向脑组织扩散的动力学，在有或无超声暴露条件下于0 h和24 h时的变化（图像采集间隔为20分钟，持续60分钟）。比例尺：200 µm。（D）在超声处理后0 h或24 h时，有或无超声辐照条件下40 kDa示踪剂的定量通透系数。数据来自三个独立芯片（n = 3），以均值 ± 标准误表示。采用双因素方差分析（ANOVA）进行统计学显著性检验，并通过Tukey事后检验进行多重比较。统计学显著性： p < 0.0001。请点击此处查看此图的放大版本。

应用超声的细胞通透性研究；包含时间推移图像、通透性柱状图以及DAPI染色的荧光显微镜比较。
图3：超声增强SFN@RB@SPM对U87-MG细胞的通透性与靶向性。（A）SFN@RB@SPM在有无超声暴露条件下穿越脑血管界面的通透性测量结果。比例尺：200 µm。（B）对照组与超声处理组条件下SFN@RB@SPM的定量通透系数。（C）超声介导血脑屏障开放后，SFN@RB@SPM在肿瘤通道中的蓄积情况，注射后3小时记录红色荧光信号。比例尺：50 µm。数据来自三个独立芯片（n = 3），以均值 ± 标准误表示。统计学显著性采用非配对双尾Student’s t检验进行评估。统计学显著性：p < 0.0001。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：BBB-GBM微流控芯片的CAD设计布局。请点击此处下载该文件。

补充图2： 血脑屏障-胶质母细胞瘤芯片的详细设计。该设计包含三个平行的微流控通道；两侧通道的宽度均为1000 µm，中央通道的宽度为1300 µm。请点击此处下载该文件。

补充图3： 通过GFAP（绿色）对原代星形胶质细胞进行表征，以及DAPI对细胞核的染色（蓝色）。比例尺：50 µm。请点击此处下载该文件。

补充图 4： 自组装纳米胶束 SFN@RB@SPM 的表征。（A）动态光散射（DLS）分析显示 SFN@RB@SPM 的粒径分布，平均粒径约为 64 nm。（B）Zeta 电位测定显示表面电荷约为 150.67 ± 2.85 mV。所有测量均使用 DLS 仪器完成。请点击此处下载该文件

补充表 1：超声参数汇总表。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案描述了一种用于评估超声介导的血脑屏障（BBB）调控及纳米胶束递送的微流控BBB-GBM芯片的建立方法。与传统的体外（in vitro）BBB模型（例如Transwell）相比，该微流控平台可实现内皮细胞、星形胶质细胞（ACs）和胶质瘤细胞在空间上明确定义的共培养，从而能够研究药物在生理相关血脑屏障中的转运过程。方案中多个关键步骤需要仔细优化，以确保屏障的稳定形成。其中一个关键参数是用于制备加载至中央脑通道的混合物时，Matrigel与AC细胞悬液培养基之间的体积比。该比例对于维持适当的凝胶黏度至关重要，以确保AC-Matrigel混合物在加载过程中保留在中间通道内。若混合物中AC细胞悬液培养基所占比例过高，则黏度降低可能导致Matrigel渗漏至相邻微通道，使AC细胞迁移至邻近通道。相反，Matrigel浓度过高可能损害细胞活力并阻碍营养物质扩散。经优化的AC细胞悬液与Matrigel体积比为3:5（v/v）（步骤2.2.7），可在支持AC细胞在Matrigel中生长的同时，提供足够的机械稳定性以将凝胶保留在中央通道内。其他微流控BBB模型研究中也强调了类似考虑，即适当的水凝胶黏度（如纤维蛋白或Matrigel）对于防止通道间渗漏、维持细胞区室的空间分离以及模拟细胞外基质特性至关重要7,21,22。

第二，在将 HCMEC 接种到血管通道后，必须立即将微流控装置侧置约 30 分钟。此步骤可促进 HCMEC 沿血管通道与脑通道之间的侧壁附着，这对于在细胞-细胞界面形成连续的内皮屏障至关重要。若省略此步骤，HCMEC 主要会沉降在通道的底面，导致侧壁内皮覆盖不完全，从而降低屏障完整性。随后进行的额外 HCMEC 接种步骤可进一步确保血管通道内具有足够的细胞密度。维持适当的细胞密度非常重要，因为 HCMEC 密度过低会导致单层结构形成不完整，并增加细胞凋亡。此前的类血脑屏障芯片研究同样强调，在微流控系统中实现融合的内皮单层对于屏障完整性和紧密连接蛋白的表达至关重要23,24。

常见问题的排查可显著提高实验的可重复性。若在脑通道加样过程中（步骤2.2.8）发生Matrigel渗漏至相邻通道的情况：（1）确保Matrigel-细胞混合物始终置于冰上，以防止Matrigel发生聚合；（2）缓慢而稳定地注入细胞-Matrigel混合物，避免溢出至邻近通道；（3）将Matrigel与细胞的体积比调整为5:4（v/v），有助于维持中央通道内适当的黏稠度和空间限制。此外，内皮屏障的成功形成在很大程度上依赖于内皮细胞的充分贴附和密度。若内皮细胞未能在血管通道界面形成连续的单层结构，可考虑提高内皮细胞接种密度或延长贴壁时间，以改善内皮覆盖程度及紧密连接的形成。若在添加培养基后通道中出现气泡，可轻轻敲击芯片，或使用黄色移液枪头通过轻柔抽吸去除气泡，因为滞留在内皮屏障附近的气泡可能局部破坏紧密连接的完整性。

尽管此处描述的BBB-GBM芯片模型提供了更具生理相关性的体系，未来研究仍可在多个方面进一步优化，以提升其生理相关性和对机制的理解。其一是当前模型采用大鼠来源的原代星形胶质细胞（ACs）与人脑微血管内皮细胞（HCMECs）共培养，导致存在物种不匹配的问题。尽管该方法已被广泛用于构建BBB芯片平台13,23物种差异可能影响屏障特性和药物通透性反应。未来的研究将引入人源诱导多能干细胞（iPSC）分化而来的星形胶质细胞或原代人星形胶质细胞，以建立完全人源化的模型，从而消除这一局限性，并进一步提高该平台的转化相关性。其次，当前模型缺乏神经血管单元组分，特别是周细胞和免疫细胞，而这些组分是血脑屏障功能和肿瘤进展的重要调控因子。25,26. 整合这些组分将更真实地模拟肿瘤微环境的复杂性。第三，该装置在静态条件下运行，缺乏持续的培养基灌注。血流产生的生理剪切应力已被证明可通过上调紧密连接蛋白（如claudin-5和occludin）来增强血脑屏障（BBB）的特性 表达。因此，与动态系统相比，静态芯片中由于缺乏流动，可能导致测得的通透性系数更高27第四，血脑屏障（BBB）完整性主要通过ZO-1免疫荧光染色与FITC-葡聚糖通透性分析相结合的方法进行评估。然而，这些互补的结构与功能检测方法在传统的Transwell血脑屏障模型和微流控芯片上的血脑屏障模型中均被广泛用于血脑屏障的有效性验证。6,28,29对调控旁细胞和跨细胞转运的关键调节因子（包括 claudin-530、MFSD2A 和 caveolin-1）进行进一步表征，将有助于更全面地评估血脑屏障功能30,31,32这些标志物将在未来的研究中被纳入，以进一步加强该平台的生理学表征。最后，本方案采用低强度治疗性超声，无需外源性微泡或声压的直接测量。与传统的聚焦超声系统不同，后者通常依赖微泡辅助的血脑屏障开放 体内本研究旨在建立一种简化的、可重复的方法 体外 评估超声诱导的血脑屏障通透性改变及纳米药物转运的平台。该方法可最大限度减少微气泡浓度、分布及空化行为在微尺度微流控环境中带来的额外变量。然而，未来结合微气泡辅助超声、温度监测以及对声场的详细表征的研究将进一步提升超声介导血脑屏障调控的生理相关性与定量理解。

总体而言，本文介绍的方案提供了一种可控的血脑屏障-胶质母细胞瘤微流控平台，能够整合超声刺激并实现对纳米胶束递送的定量分析。该系统可直接研究超声介导的血脑屏障开放以及纳米药物穿越内皮屏障的后续转运过程。除了评估纳米胶束递送效果外，该平台还可用于筛选具有血脑屏障穿透能力的药物，研究血脑屏障破坏的机制，并为中枢神经系统（CNS）靶向治疗药物的临床前评价提供一个强有力的平台。

披露

在撰写本文稿过程中，作者仅使用了 ChatGPT（OpenAI）进行语言编辑和润色。作者已审阅并修改了所有由人工智能辅助生成的内容，并对文稿的准确性和完整性负全部责任。未使用任何人工智能工具进行数据生成、分析或图表制作。

致谢

我们衷心感谢浙江省自然科学基金（LQ24H160003）、浙江省医药卫生科学研究基金（2024KY351）、宁波市自然科学基金（2023J365）、宁波市甬江人才引进计划（青年创新人才项目，2021A-012-G）以及宁波江北区贝安人才计划（2023RC004）提供的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 555 标记的山羊抗兔二抗Cell Signaling Technology, Inc.4413
抗ZO-1抗体赛默飞世尔科技公司40-2200
活检穿孔器浙江青芯科技有限公司10305130004
牛血清白蛋白Absin Bioscience Inc.9048-46-8
细胞计数仪赛默飞世尔科技公司Countess TM3
细胞培养皿（100 mm）康宁公司430167
离心贝克曼库尔特公司Avanti J-15R
铬掩模苏州芯测科学仪器有限公司ZX-GBYM
共聚焦激光扫描显微镜卡尔·蔡司股份公司Zeiss LSM900
DAPI碧云天生物技术股份有限公司C1002
开发者苏州芯测科学仪器有限公司RCD-400
DMEM/F12ScienCell 研究实验室C3130-0500
细胞外基质ScienCell 研究实验室1001
乙醇宁波镇海永丰化工厂6923193900015
胎牛血清ScienCell 研究实验室C04001-500
Fiji（Fiji 即是 ImageJ）开源项目N/A
FITC-葡聚糖（40 kDa）赛默飞世尔科技公司GC19938
载玻片Citotest Scientific Co., Ltd.188105W
Graphpad Prism 9.5GraphPad Software, Inc.N/A
人脑微血管内皮细胞（HCMECs）BeNa 培养物保藏中心BNCC337717
培养箱Esco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
倒置荧光显微镜尼康仪器公司TS2-FL
异丙醇国药集团化学试剂有限公司80109218
Matrigel康宁公司354234
MEM普瑞赛拉生命科学 &科技有限公司PM150410
氮宁波百方气体有限公司N/A
氧气宁波百方气体有限公司N/A
多聚甲醛（PFA，4%）武汉赛维尔生物科技有限公司G1101-500mL
PBSScienCell 研究实验室C3580-0500
PDMS康宁公司220777
青霉素/链霉素普瑞赛拉生命科学 &科技有限公司PB180120
光刻技术中国科学院光电技术研究所URE-2000\AL
光刻热板苏州文浩微流控科技有限公司WH-HP-02
等离子体灰化仪天科创达有限公司PT-05-LF
原代星形胶质细胞N/AN/A从新生大鼠（出生第1-3天）脑组织中分离
硅片浙江青芯科技有限公司10204040001
旋涂仪苏州文浩微流控科技有限公司WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100北京索莱宝科技有限公司 &有限公司9002-93-1
胰蛋白酶ScienCell 研究实验室C3530-0100
U87-MG 细胞普瑞赛拉生命科学 &科技有限公司CL-0238
超声设备 深圳东迪欣科技有限公司Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4（蓝色版）卡尔·蔡司股份公司N/A

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