超声控制血脑屏障（BBB）开放在用于药物递送研究的血脑屏障-胶质母细胞瘤微流控芯片中的应用

Yihong Li; Liyang Wu; Huadong Fan

doi:10.3791/72041

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方法文章

超声控制血脑屏障（BBB）开放在用于药物递送研究的血脑屏障-胶质母细胞瘤微流控芯片中的应用

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DOI：

10.3791/72041

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2026年8月18日

Yihong Li^*¹^,²^,³ , Liyang Wu^*¹^,²^,³ , Huadong Fan¹^,²^,⁴

¹Ningbo No.2 Hospital, ²Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, ³Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, ⁴Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种微流控血脑屏障-胶质母细胞瘤（BBB-GBM）芯片模型的构建方法。该模型经过血脑屏障完整性的验证，可用于研究低强度超声诱导的短暂且大部分可逆的血脑屏障开放，从而实现对超声介导的纳米胶束跨血脑屏障转运及肿瘤靶向效率的定量评估。

摘要

血脑屏障（BBB）限制了大多数治疗分子进入大脑，是治疗胶质母细胞瘤（GBM）的主要障碍。不同物种间血脑屏障在结构和功能上的差异使动物模型的临床转化变得复杂，凸显了建立与人类相关的体外血脑屏障平台以评估GBM治疗中药物通透性的必要性。本文描述了一种构建微流控血脑屏障-GBM芯片模型的实验方案。该模型在一个含Matrigel的微流控平台中建立了一个三细胞共培养系统，包括人脑微血管内皮细胞（HCMECs）、原代星形胶质细胞（ACs）和U87-MG细胞。通过连续的紧密连接蛋白-1（ZO-1）免疫荧光染色和FITC-葡聚糖通透性实验验证血脑屏障的完整性。随后采用低强度超声（US）（1 MHz，1 W/cm²，30 s）诱导血脑屏障短暂且基本可逆的开放，使靶向肿瘤的纳米胶束（SFN@RB@SPMs）能够高效穿过屏障并在GBM细胞中富集。本方案的一个关键特征是将实时血脑屏障通透性和药物递送检测整合于单一的超声响应芯片中，为深入解析超声增强GBM药物递送机制提供了强有力的平台。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）的治疗受到血脑屏障（BBB）的严重限制，该屏障几乎阻碍了所有治疗药物进入大脑¹^,²。BBB由无孔型内皮细胞构成，这些细胞通过紧密连接蛋白（如occludin、ZO-1）连接，并受到周细胞和星形胶质细胞终足的额外支持³。尽管动物模型在理解BBB功能方面提供了有价值的见解，但不同物种在生理和代谢上的特异性差异限制了其准确预测人类药物反应的能力⁴^,⁵。因此，具有生理相关性的人源BBB模型对于评估GBM治疗中药物的通透性至关重要。

传统体外血脑屏障模型（如Transwell培养系统）无法充分模拟血脑屏障的复杂性，包括细胞间相互作用、动态的流体变化以及流动诱导的剪切应力⁶相比之下，微流控血脑屏障模型已成为更优越的平台，能够更紧密地模拟这些体内类特性⁷此类器官芯片上的血脑屏障系统已被广泛用于研究脑肿瘤转移⁸，研究阿尔茨海默病等神经退行性疾病中血脑屏障功能障碍⁹

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方案

所有动物实验均遵循《实验动物福利伦理审查指南（GB/T35892-2018）》，并经中国科学院大学宁波生命与健康研究院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（批准号：GK-2023-XM-0073）。所用试剂与设备列于材料表中。

1. 血脑屏障-胶质母细胞瘤类器官芯片装置的制备与准备

芯片设计与光刻掩模布局
1. 使用 Auto CAD 软件设计芯片。
  注意：该芯片包含三个平行的微流控通道，分别为血液通道、脑通道和肿瘤通道。血液通道和肿瘤通道的宽度均为 1000 µm，脑通道的宽度为 1300 µm。三个通道的高度均为 150 µm，相邻通道之间由宽度为 200 µm 的梯形微柱阵列隔开，以允许不同腔室间的分子扩散和细胞通讯。详细的光刻掩模设计布局见补充图 1和补充图 2。本研究中使用的 SU-8 光刻胶型号为 3050。
使用 SU-8 光刻胶通过标准光刻工艺制备硅母模。
1. 将空白硅片放置在匀胶机的真空卡盘上，并启动真空以牢固固定硅片。
2. 缓慢将 10 mL SU-8 光刻胶滴加至硅片中心。
3. 采用两步旋涂法获得均匀的光刻胶层：首先以 500 rpm 旋转 10 秒，然后以....

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结果

为了重现体内血脑屏障结构的三培养微流控芯片通过整合HCMECs、原代星形胶质细胞（ACs）和U87-MG细胞而构建（称为“芯片模型”）。如图所示 图1A,B，设备内设有三条平行通道：血管通道（左侧，蓝色）、填充Matrigel的脑组织通道（中央，粉红色）和肿瘤通道（右侧，绿色），分别接种HCMECs、ACs和U87-MG细胞。通道之间由微柱阵列分隔，微柱阵列可将Matrigel限制在中央腔室，同时允许通道间进行分子和细胞交换。设备灭菌后，向ACs中（2.5 × 10⁶ 细胞/mL）以3:5（v/v）的比例悬浮于Matrigel中，并注入脑通道。Matrigel聚合后，人脑微血管内皮细胞（HCMECs）（2 × 10⁶ 个/mL）被接种至左侧血管通道。在ACs与HCMECs共培养2天后，将U87-MG细胞（2 × 10⁶ 细胞/mL）被引入右侧肿瘤通道以建立胶质母细胞瘤（GBM）区室。芯片模型在第5天完全建立，随后评估屏障完整性。通过 ZO.......

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讨论

本方案描述了一种用于评估超声介导的血脑屏障（BBB）调控及纳米胶束递送的微流控BBB-GBM芯片的建立方法。与传统的体外（in vitro）BBB模型（例如Transwell）相比，该微流控平台可实现内皮细胞、星形胶质细胞（ACs）和胶质瘤细胞在空间上明确定义的共培养，从而能够研究药物在生理相关血脑屏障中的转运过程。方案中多个关键步骤需要仔细优化，以确保屏障的稳定形成。其中一个关键参数是用于制备加载至中央脑通道的混合物时，Matrigel与AC细胞悬液培养基之间的体积比。该比例对于维持适当的凝胶黏度至关重要，以确保AC-Matrigel混合物在加载过程中保留在中间通道内。若混合物中AC细胞悬液培养基所占比例过高，则黏度降低可能导致Matrigel渗漏至相邻微通道，使AC细胞迁移至邻近通道。相反，Matrigel浓度过高可能损害细胞活力并阻碍营养物质扩散。经优化的AC细胞悬液与Matrigel体积比为3:5（v/v）（步骤2.2.7），可在支持AC细胞在Matrigel中生长的同时，提供足够的机械稳定性以将凝胶保留在中央通道内。其他微流控BBB模型研究中也强调了类似考虑，即适当的水凝胶黏度（如纤维蛋白或Matrigel）.......

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披露

在撰写本文稿过程中，作者仅使用了 ChatGPT（OpenAI）进行语言编辑和润色。作者已审阅并修改了所有由人工智能辅助生成的内容，并对文稿的准确性和完整性负全部责任。未使用任何人工智能工具进行数据生成、分析或图表制作。

致谢

我们衷心感谢浙江省自然科学基金（LQ24H160003）、浙江省医药卫生科学研究基金（2024KY351）、宁波市自然科学基金（2023J365）、宁波市甬江人才引进计划（青年创新人才项目，2021A-012-G）以及宁波江北区贝安人才计划（2023RC004）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 555 标记的山羊抗兔二抗	Cell Signaling Technology, Inc.	4413
抗ZO-1抗体	赛默飞世尔科技公司	40-2200
活检穿孔器	浙江青芯科技有限公司	10305130004
牛血清白蛋白	Absin Bioscience Inc.	9048-46-8
细胞计数仪	赛默飞世尔科技公司	Countess TM3
细胞培养皿（100 mm）	康宁公司	430167
离心	贝克曼库尔特公司	Avanti J-15R
铬掩模	苏州芯测科学仪器有限公司	ZX-GBYM
共聚焦激光扫描显微镜	卡尔·蔡司股份公司	Zeiss LSM900
DAPI	碧云天生物技术股份有限公司	C1002
开发者	苏州芯测科学仪器有限公司	RCD-400
DMEM/F12	ScienCell 研究实验室	C3130-0500
细胞外基质	ScienCell 研究实验室	1001
乙醇	宁波镇海永丰化工厂	6923193900015
胎牛血清	ScienCell 研究实验室	C04001-500
Fiji（Fiji 即是 ImageJ）	开源项目	N/A
FITC-葡聚糖（40 kDa）	赛默飞世尔科技公司	GC19938
载玻片	Citotest Scientific Co., Ltd.	188105W
Graphpad Prism 9.5	GraphPad Software, Inc.	N/A
人脑微血管内皮细胞（HCMECs）	BeNa 培养物保藏中心	BNCC337717
培养箱	Esco Lifesciences Co., Ltd	CLM-170B-8-CN
倒置荧光显微镜	尼康仪器公司	TS2-FL
异丙醇	国药集团化学试剂有限公司	80109218
Matrigel	康宁公司	354234
MEM	普瑞赛拉生命科学 &科技有限公司	PM150410
氮	宁波百方气体有限公司	N/A
氧气	宁波百方气体有限公司	N/A
多聚甲醛（PFA，4%）	武汉赛维尔生物科技有限公司	G1101-500mL
PBS	ScienCell 研究实验室	C3580-0500
PDMS	康宁公司	220777
青霉素/链霉素	普瑞赛拉生命科学 &科技有限公司	PB180120
光刻技术	中国科学院光电技术研究所	URE-2000\AL
光刻热板	苏州文浩微流控科技有限公司	WH-HP-02
等离子体灰化仪	天科创达有限公司	PT-05-LF
原代星形胶质细胞	N/A	N/A	从新生大鼠（出生第1-3天）脑组织中分离
硅片	浙江青芯科技有限公司	10204040001
旋涂仪	苏州文浩微流控科技有限公司	WH-SC-01
SU-8	Kayaku Advanced Materials Inc.	1030403002
Triton X-100	北京索莱宝科技有限公司 &有限公司	9002-93-1
胰蛋白酶	ScienCell 研究实验室	C3530-0100
U87-MG 细胞	普瑞赛拉生命科学 &科技有限公司	CL-0238
超声设备	深圳东迪欣科技有限公司	Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4（蓝色版）	卡尔·蔡司股份公司	N/A

参考文献

Narsinh KH, Perez E, Haddad AF, Young JS, Savastano L, Villanueva-Meyer JE, et al. Strategies to improve drug delivery across the blood-brain barrier for glioblastoma. Curr Neurol Neurosci Rep. 2024;24(5):123-139.
Xie Y, Yang F, He L, Huang H, Chao M, Cao H, et al. Single-cell dissection of the human blood-brain barrier and glioma blood-tumor barrier. Neuron. 2024;112(18):3089-105 e7.
Scalise AA, Kakogiannos N, Zanardi F, Iannelli F, Giannotta M. The blood-brain and gut-vascular barriers: from the perspective of claudins. Tissue Barriers. 2021;9(3):1926190.
Sivandzade F, Cucullo L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and ....

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