利用荧光显微镜在哺乳动物细胞中展示荧光肽基抑制剂对线粒体ClpXP的靶向作用

摘要

本方案建立了一种定量成像工作流程，该流程采用共聚焦显微镜技术，用于监测荧光肽类ClpP抑制剂FAM-FAPAL-CMK（羧基荧光素-FAPAL-氯甲基酮）在完整细胞中选择性地定位于线粒体以靶向ClpP，以及由此抑制ClpP后所引发的线粒体形态学变化。

摘要

线粒体ATP依赖性蛋白酶通过降解受损或错误折叠的蛋白质，在维持蛋白质稳态中发挥关键作用。其中，ClpXP蛋白酶复合物定位于线粒体基质，在生理条件和应激条件下参与线粒体质量控制。本研究展示了一种定量荧光显微镜工作流程，用于评估荧光肽类抑制剂FAM-FAPAL-CMK的线粒体靶向性，并分析哺乳动物细胞中ClpXP抑制所引起的线粒体形态变化。通过给予HeLa细胞FAM-FAPAL-CMK处理，并结合线粒体标志物的免疫荧光染色、共聚焦显微镜观察以及定量图像分析进行检测。采用Costes阈值法和Manders重叠系数进行共定位分析，结果显示抑制剂信号在线粒体中显著富集。结果表明，ClpP的抑制导致线粒体形态发生改变。免疫印迹分析显示，抑制剂处理后ClpP蛋白水平未发生显著变化。综上所述，本研究建立了一种可重复的基于成像的工作流程，可用于在完整细胞中研究线粒体ClpXP功能，特别是在氧化应激等稳态扰动条件下的响应机制。

引言

线粒体ATP依赖性蛋白酶在蛋白质稳态中起核心作用，可降解错误折叠或受损的蛋白质^1,2,3,4,5,6。其中，ClpXP是一种位于线粒体基质中的异源寡聚AAA+蛋白酶复合物。ClpX ATP酶识别并解折叠蛋白质，随后将其转运至ClpP蛋白水解腔^7,8,9。与其他线粒体蛋白酶共同作用，ClpXP在正常和应激条件下（包括氧化应激和代谢紊乱）维持蛋白质质量控制^1,2,4。线粒体蛋白质稳态的破坏已被证实与神经退行性疾病和癌症等疾病相关，凸显了在完整细胞系统中理解这些蛋白酶活性的重要性^3,6,10。

该领域面临的一个主要挑战是缺乏能够在完整细胞中以空间分辨率直接监测线粒体蛋白酶活性的方法。现有方法主要依赖于使用纯化蛋白或细胞裂解液的生化检测，这些方法可提供详细的动力学信息，但无法保留亚细胞结构的背景环境^11,12,13,14。化学生物学策略通过开发荧光肽类底物和活性位点定向抑制剂，在一定程度上弥补了这一局限。荧光肽类底物可实现对ATP依赖性肽酶活性的定量测定，而肽类抑制剂则通过与蛋白水解位点形成可逆共价相互作用，实现选择性抑制^{13,15,16,17,18,19}。此前，实验室合成的ClpXP抑制剂FAPAL-CMK已被证实可与ClpP形成共价键²⁰。在本研究中，开发了FAPAL-CMK的荧光素标记衍生物FAM-FAPAL-CMK，作为一种基于作用机制的ClpP抑制剂，可用于其细胞内定位的可视化。

与生化检测相比，共聚焦荧光显微镜能够在完整细胞中实现对探针分布和线粒体形态的空间分辨评估，提供仅通过裂解液无法获得的信息。然而，与酶学检测不同，荧光定位并不能直接测量催化活性或分子结合事件，且可能受到探针摄取效率、线粒体动态变化以及成像条件的影响。此外，该方法的成功实施依赖于足够的探针积累以及足够清晰的线粒体网络结构，因此该工作流程最适用于具有明显可区分线粒体形态的贴壁培养细胞。

本研究的目的是建立一种定量工作流程，将基于机制的荧光探针与共聚焦显微镜技术相结合，用于在完整细胞中监测线粒体蛋白酶的定位及其功能。通过将选择性化学探针与高分辨率共聚焦成像相结合，该工作流程能够评估线粒体的定位、探针分布以及完整细胞中线粒体稳态受到扰动后的形态学响应。该方法可作为现有生化检测手段的补充，后者虽能直接测量蛋白酶活性，但缺乏空间分辨率。

方案

实验使用 commercially available HeLa 细胞进行。未使用人类受试者、脊椎动物或来源于人类或脊椎动物的原代生物材料。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 细胞培养与处理

1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HeLa细胞，于37 ˚C、含5% CO₂的湿化培养箱中培养。
2. 将细胞接种于无菌玻璃盖玻片上，孵育24小时以促进细胞贴壁。
3. 将抑制剂FAM-FAPAL-CMK溶于DMSO中，配制50 µM的储存液，并于-20 °C保存。
4. 在处理组细胞样品的生长培养基中加入50 nM的FAM-FAPAL-CMK。
5. 在对照组样品中加入等体积的DMSO，使其终浓度与抑制剂处理组中的溶剂浓度一致，以确保任何观察到的效应并非由DMSO引起。
6. 在进行后续实验操作前，将细胞在相同的培养条件下继续孵育18小时。
   注意：FAM-FAPAL-CMK抑制剂为实验室设计并合成，其合成方法已有文献报道²⁰。

2. 固定与通透处理

1. 用预热的 D-PBS 清洗细胞 5 分钟，重复一次。
2. 在室温下使用含 2.4% (v/v) 甲醛、0.05% (v/v) 戊二醛和 0.5% (w/v) 皂苷的 PHEM 缓冲液（68 mM PIPES、25 mM HEPES、15 mM EGTA、3 mM MgCl₂，pH 6.9）固定细胞 15 分钟。
3. 配制新鲜的硼氢化钠溶液（5 mg/mL，溶于 D-PBS）。
4. 将细胞在硼氢化钠溶液中室温孵育 15 分钟，以中和残留的戊二醛。
5. 染色前用 D-PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
   注意：甲醛和戊二醛为有毒固定剂，固定步骤应在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（手套、实验服和护目镜）。硼氢化钠为反应性还原剂，应小心操作。选用含甲醛、戊二醛和皂苷的 PHEM 缓冲固定液，可在免疫染色过程中保持抗原可及性的同时，有效保存线粒体形态。甲醛和戊二醛通过蛋白质交联实现结构固定，PHEM 缓冲体系及其 pH 有助于稳定线粒体超微结构²¹。皂苷可促进细胞膜通透化，提高固定剂渗透速率。该固定策略可最大限度减少线粒体网络的形变，特别适用于线粒体形态的定量分析。

3. 免疫荧光染色

1. 在室温下用封闭缓冲液封闭细胞1小时，封闭缓冲液组成为：PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4）中含3%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）和0.1%（v/v）Triton X-100。
2. 将细胞与用封闭缓冲液稀释的一抗在室温下孵育1小时。使用小鼠抗TOMM20抗体（1:500）和兔抗ClpP抗体（1:500）。
3. 用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，以去除未结合的一抗。
4. 将细胞与用封闭缓冲液稀释的二抗在室温下孵育1小时。使用CF405S标记的小鼠二抗（1:500）和Alexa Fluor 647标记的兔二抗（1:500）。
5. 在二抗孵育期间及之后，避免样品暴露于光照。
6. 重复步骤3.3。
7. 使用封片剂将盖玻片封固于载玻片上。
   注：为避免与FAM信号发生光谱重叠，ClpP和TOMM20分别在405 nm和647 nm下进行成像。

4. 图像采集

1. 使用配备高数值孔径油浸物镜的共聚焦激光扫描显微镜采集图像。
2. 采用405 nm和633 nm激光激发荧光染料。使用适当的二向色镜将激发光反射，并将发射的荧光传递至探测器。
3. 将像素大小设置为35.3 nm（X, Y），Z轴步进设为0.1 µm，以确保对线粒体结构进行充分的轴向采样。
4. 以1900 × 1900像素（X, Y）的帧尺寸采集图像，每个Z栈从线粒体信号上方开始，到其下方结束，共采集5个光学切片，以确保收集到主要的线粒体信号。
   注意：代表性显微镜采集参数见补充图1。在HeLa细胞中，线粒体通常为细长的管状结构，直径约为0.5–1 µm²²。因此，0.5 µm的Z轴体积足以捕获单个线粒体基质的大部分，但未必覆盖整个细胞。选择5层Z栈是为了在充分采样线粒体结构与快速成像之间取得平衡，以尽量减少细胞成像过程中的运动相关伪影。

5. 活细胞处理与成像

1. 在37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中，将HeLa细胞接种于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，培养于35 mm玻璃底培养皿中。
2. 接种后24 h，向细胞中加入抑制剂（终浓度：50 nM）或等体积的DMSO。在标准培养条件下继续孵育细胞18 h。
3. 移除含有抑制剂或DMSO的培养基，用预热的D-PBS洗涤细胞一次，持续5 min。
4. 加入含有20 nM MitoTracker DeepRed的活细胞成像溶液。
5. 在室温下使用上述相同的显微镜设置进行活细胞成像。以逐帧扫描模式采集图像，每个光学切片约需4.72 s（每5层Z轴堆栈总共约需24 s）。
   注意：每个Z轴堆栈设置5个光学切片，旨在充分采样线粒体结构的同时控制合理的采集时间。此外，采用室温下的活细胞成像溶液可降低线粒体运动性，相较于37 °C成像更为稳定。尽管活细胞成像过程中线粒体的运动仍可能对共定位测量结果带来一定变异性，但所有样本间保持一致的采集参数有助于减少系统性偏差。代表性软件设置见补充图2。

6. 线粒体形态学分析

1. 在 Fiji²³ 中打开图像文件，通过选择 图像 → 堆栈 → Z 投影 并选择 最大强度投影，从 Z 堆栈生成最大强度投影图像。
2. 通过导航至 图像 → 调整 → 阈值，在阈值选项中选择 Otsu 方法，应用该阈值以实现线粒体的分割。
3. 运行 Mitochondria Analyzer 插件²⁴，并选择基于单个线粒体的 2D 分析模式。
4. 利用 Mitochondria Analyzer 的输出结果测量线粒体大小（面积）和周长。
5. 直接从 Mitochondria Analyzer 的输出结果中获取线粒体形态因子值，其中形态因子的计算公式为 P²/(4πA)，P 代表周长，A 代表面积。
6. 使用插件内的网络分析功能测量每个线粒体的总分支长度，以评估线粒体的连接性。
7. 以分布图形式展示单个线粒体的测量数据，并结合每种条件下来自三个独立生物学重复实验中各 30 个细胞的平均值进行呈现。
8. 使用统计分析软件中的 Welch t 检验 评估统计学显著性。

7. 共定位分析

1. 在 Fiji 中打开图像文件，并从 3D 图像堆栈生成最大强度的 2D 投影。为保持一致性，所有样品应采用相同的投影和采集策略进行分析。
2. 通过选择 图像 → 颜色 → 拆分通道 来分离荧光通道。
3. 通过选择 插件 → 共定位 → Coloc 2 启动 Coloc 2 插件。
4. 在插件设置中为分析分配适当的通道，并启用 Costes 阈值回归。以单个细胞为单位运行分析。
5. 记录 Manders 重叠系数（M1 和 M2），以评估每个通道中与另一通道在空间上重合的信号比例。
6. 在 Coloc 2 设置中启用 Costes 随机化，并将随机化次数设为 50，以评估统计显著性。

8. 细胞裂解液的制备

1. 在含10%胎牛血清的DMEM培养基中接种HeLa细胞，并于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育。
2. 接种24小时后，向细胞中加入50 nM抑制剂或等体积的DMSO，并在标准培养条件下继续孵育18小时。
3. 移除培养基，用预热的D-PBS洗涤细胞5分钟，随后进行胰蛋白酶消化以使细胞脱落。
4. 用新鲜的细胞生长培养基终止胰蛋白酶消化反应，然后在室温下以300 × g离心3分钟，弃去上清液。
5. 将细胞沉淀重悬于D-PBS中，再以300 × g离心3分钟以洗涤细胞，弃去上清液。
6. 将细胞沉淀重悬于预冷的裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.6，150 mM氯化钠，0.1% SDS，0.5%脱氧胆酸钠，2% CHAPS，10 mM TCEP，1 mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂混合物）中。
7. 将裂解物置于冰上孵育20分钟，随后在冰水浴中超声处理2分钟，以确保完全裂解。
8. 在4 °C下以13,000 × g离心裂解物20分钟。
9. 将澄清的上清液转移至预冷的新离心管中，用于后续分析。
   注意：PMSF具有毒性，应在通风橱中佩戴适当的个人防护装备操作。SDS为刺激性物质，超声处理会产生热量和气溶胶。裂解和超声步骤应在冰上进行，并遵守所在机构的安全规范。

9. 考马斯亮蓝法蛋白定量

1. 使用牛血清白蛋白（BSA）在0.15 M氯化钠溶液中配制一系列标准溶液，浓度分别为：0、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL。
2. 将未知细胞裂解液用0.15 M氯化钠溶液稀释50倍和100倍。
3. 将每种标准曲线溶液及未知样品分别取等量重复加入96孔板中。
4. 向每个孔中加入Bradford试剂。每个孔加入160 µL蛋白质溶液和40 µL 5倍浓度的Bradford试剂（市售试剂）。通过移液轻轻混匀。
5. 将96孔板在室温下孵育10分钟，然后使用酶标仪在595 nm波长处测定吸光度。
6. 以BSA浓度为横坐标（x轴），以各重复测定的595 nm吸光度平均值为纵坐标（y轴），绘制标准曲线。
7. 根据标准曲线确定各样品的蛋白质浓度。将计算所得浓度乘以稀释倍数，得到原始浓度。

10. 免疫印迹

1. 将等量的细胞裂解液上样至12%聚丙烯酰胺凝胶中，通过SDS-PAGE分离蛋白质。
2. 将PVDF膜短暂浸入乙醇中以活化，随后将膜和转印滤纸在转移缓冲液中平衡。
3. 使用半干式转印系统将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上。
4. 用含5%（w/v）脱脂奶粉的TBS（20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.6）在室温下封闭膜1小时，并轻轻振荡。
5. 将膜与用封闭缓冲液稀释的一抗在室温下孵育1小时，并轻轻振荡。使用兔抗ClpP抗体（1:2000）和鼠抗β-肌动蛋白抗体（ACTB，1:10,000）。
6. 用TBST（20 mM Tris，150 mM NaCl，0.1%（v/v）Tween 20，pH 7.6）洗涤膜三次，每次5分钟，以去除未结合的抗体。
7. 将膜与用封闭缓冲液稀释的HRP标记的二抗（1:3000）在室温下孵育1小时，并轻轻振荡。
8. 重复洗涤步骤。
9. 使用化学发光检测试剂检测蛋白条带。

11. 密度测定分析

1. 在 Fiji 中打开 Western 印迹图像。
2. 将图像类型更改为8位 图像 → 类型 → 8位.
3. 减去图像背景 过程 → 减去背景检查 浅色背景 并将滚珠半径设置为 50.0 像素。
4. 使用矩形工具圈出第一泳道中的条带，然后选择 分析 → 凝胶 → 选择第一条泳道.
5. 将矩形工具移至第二条泳道，选择 分析 → 凝胶 → 选择下一条泳道。重复此步骤，直至所有泳道均被选中。
6. 绘制条带密度图 分析 → 凝胶 → 绘图泳道.
7. 使用直线工具在条带密度峰的底部画一条线，并使用魔棒工具读取条带密度。
8. 在内参印迹图像上重复步骤11.1–11.8的相同操作。
9. 通过将 ClpP 的密度除以 ACTB 的密度，报告相对条带密度。

结果

ClpP 抑制改变线粒体形态及网络结构
为确定 ClpP 抑制是否改变 HeLa 细胞中的线粒体结构，我们评估了线粒体形态。代表性荧光图像显示，对照组细胞与 FAM-FAPAL-CMK 处理组细胞的线粒体结构存在明显差异（图 1A）。定量分析表明，抑制剂处理后，线粒体面积从对照组的 1.15 ± 4.8 µm²（n = 8013）减少至 0.47 ± 1.1 µm²（n = 8516）。该面积减小伴随着线粒体周长从对照组的 8.1 ± 20 µm 减少至抑制处理后的 4.6 ± 6.4 µm（图 1B，C）。此外，线粒体形态因子（form factor）从对照组的 5.9 ± 7.8 下降至处理组的 4.3 ± 3.6（图 1D），表明抑制导致线粒体碎片化，并降低整体结构复杂性。在网络水平上的分析还显示，每个线粒体的总分支长度从对照组的 8....

讨论

肽基氯甲基酮 FAPAL-CMK¹⁵ 此前已被证明是线粒体 ATP 依赖性蛋白酶 ClpXP 的蛋白酶亚基（ClpP）的一种潜在不可逆抑制剂。尽管动力学实验已证实该抑制剂的效力及其作用机制，但体外（in vitro）方法无法评估 FAPAL-CMK 在完整细胞中作为选择性线粒体 ClpP 抑制剂的有效性。荧光共聚焦显微镜证实，FAM-FAPAL-CMK 可选择性地定位于 ClpP 所在的线粒体。由于仅凭线粒体定位尚不足以确立与靶标的直接结合，因此本文将共定位测量结果解释为与 ClpP 定位一致的线粒体富集证据，而非共价结合的直接证明。由于 FAM-FAPAL-CMK 并未与其他线粒体 ATP 依赖性蛋白酶 Lon 发生反应，因此 FAM-FAPAL-CMK 在线粒体中的定位只能归因于该荧光抑制剂与 ClpP 蛋白水解位点的共价结合。研究发现 FAM-FAPAL-CMK 能在完整细胞中选择性靶向线粒体 ClpP 并诱导线粒体形态变化，这将极大促进对 ClpP 在线粒体中功能的评估。鉴于已有针对另一种线粒体 ATP 依赖性蛋白酶 Lon 的肽基硼酸抑制剂被开发出来

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 647 标记的兔二抗	杰克逊免疫研究公司	711-607-003
β-肌动蛋白小鼠抗体	Proteintech	66009
牛血清白蛋白	Fisher 生物试剂	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP 兔多克隆抗体	Proteintech	15698
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基	康宁	10-013-CV
Dylight405 标记的山羊抗小鼠二抗	杰克逊免疫研究	715-475-150
ECL Select 蛋白质印迹检测试剂	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
胎牛血清	R&D Systems	S11550
戊二醛，70% 溶液	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific公司	DSH75030
HRP标记的小鼠抗体	细胞信号技术公司	7076S
HRP标记的兔抗体	细胞信号技术公司	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
活细胞成像溶液	Gibco	A59688DJ
六水合氯化镁	Fisher	BP214
Fiji 的线粒体分析插件	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
小鼠抗 TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
多聚甲醛，16% 溶液	电子显微镜科学公司	15710
PIPES	Dot Scientific公司	DSP40140
PMSF	RPI 研究产品	P20270
氯化钾	Alfa Aesar	11595
磷酸二氢钾	VWR	BDH9268
ProLong 封片剂	Invitrogen	P36930
蛋白质测定染料	Bio-Rad	5000006
皂苷	赛默飞世尔科技	A18820.14
硼氢化钠	赛默飞世尔科技	200050250
氯化钠	VWR	BDH9286
脱氧胆酸钠	Sigma	D6750
十二烷基硫酸钠	VWR	0227
磷酸氢二钠	AMERSCO	0348
软件名称	版本信息
Tris	Dot Scientific公司	DST60040
盐酸三(2-羧乙基)膦 (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3