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方法文章

利用定量成像分析对肺组织中的弹性纤维进行表征

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DOI：

10.3791/72114

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2026年8月4日

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Medicine and Experimental Immunology Bonn, University of Bonn, University Hospital Bonn, 2Institute for General Pathology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz, 3TRON Translational Oncology Mainz

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于小鼠肺组织中弹性纤维可视化及定量分析的组织制备方案。该方法可对生理和病理条件下组织结构、纤维空间排列以及细胞外基质重塑进行可靠评估。

摘要

肺细胞外基质（ECM）的重塑是肺损伤和肺部疾病的关键特征。弹性纤维是肺ECM的核心组分，赋予肺组织弹性与回缩力，以维持正常的呼吸功能；其结构破坏会导致组织力学性能受损。本实验方案介绍了一种稳健且可重复的小鼠肺组织制备与分析工作流程，重点在于弹性纤维的可视化及定量分析。方案详细说明了优化的组织处理和组织学染色方法，以保存并检测弹性蛋白结构。此外，本方案还描述了一套图像分析流程，可对肺组织内弹性纤维的丰度、排列方式及空间分布进行定量评估。该工作流程进一步结合了QuPath中的染色向量估计、Fiji/ImageJ中的颜色解卷积以及基于TWOMBLI的图像分析，以实现对弹性纤维丰度、分支情况和网络复杂性的定量评价。方案中还包括图像采集、感兴趣区域选择、参数优化和质量控制策略，以确保结果的可重复性并减少操作者依赖性偏差。利用该工作流程，我们成功识别出肥胖小鼠肺组织中弹性纤维排列方式和网络结构的改变，验证了其在检测疾病相关ECM重塑中的适用性。综上所述，这些方法为研究生理和病理条件下弹性纤维的重塑及其对组织结构的影响提供了全面的技术框架。该方法有助于研究成纤维细胞驱动的结构变化，并为揭示肺部疾病中ECM改变的潜在机制提供支持。

引言

弹性纤维是肺部细胞外基质（ECM）的关键组分，主要由弹性蛋白及相关的微原纤维蛋白组成，这些成分组装成高度有序且具有弹性的网络结构1。在肺组织中，弹性纤维沿肺泡隔和支气管周围结构分布，提供正常呼吸力学所必需的弹性和回缩力1,2。作为肺、主动脉和子宫等组织中最丰富的结构ECM成分之一，其完整性对于维持组织顺应性至关重要1,2。弹性纤维结构的破坏已在多种肺部疾病中被观察到，包括纤维化、肺气肿和慢性炎症性疾病，其中纤维结构的改变会导致肺功能和机械性能受损2,3。

肺部的细胞外基质组（matrisome） recently 被系统表征，揭示了包括胶原蛋白和层粘连蛋白在内的核心细胞外基质（ECM）蛋白，以及与 matrisome 相关的组分，如细胞因子、ECM 调控因子和 ECM 相关蛋白（例如整合素配体、半乳糖凝集素）4,5。这些组分不仅提供结构支持，还主动调控组织功能，并形成特殊的微环境，以支持定居细胞和迁移细胞的存活与活动6,7。值得注意的是，近期研究强调，肥胖等代谢状态与弹性纤维结构的显著改变密切相关，提示全身性代谢失调可影响肺组织 ECM 结构及成纤维细胞功能3。这些发现凸显了将弹性纤维重塑理解为一个动态且与疾病密切相关的过程的重要性。

传统的弹性纤维评估通常依赖于定性的组织学评价、半定量评分系统或弹性蛋白丰度的测量，这些方法在纤维组织结构、连接性及网络复杂性方面提供的信息有限8,9。尽管这些方法可用于检测弹性蛋白含量的显著变化，但可能无法捕捉与组织重塑相关的细微结构改变。基于图像的定量分析有望克服这些局限性，通过实现对弹性纤维网络的客观且可重复的表征，并促进不同实验条件和研究之间的比较。为解决这一问题，本文所述方案可实现对肺部细胞外基质（ECM）组织结构的整合分析，特别聚焦于弹性纤维的架构。除了已建立的ECM表征方法4,5外，该工作流程还结合了弹性染色（Elastica staining）以及基于TWOMBLI10的图像分析流程，后者针对肺组织结构进行了优化。通过将弹性染色与定量网络分析相结合，该工作流程超越了传统的组织学评估，能够对纤维丰度、断裂程度、空间分布及结构复杂性进行详细表征。该方案特别适用于研究肺纤维化、肺气肿、肥胖相关肺组织重塑、炎症性肺部疾病、衰老以及其他以肺部细胞外基质重塑为特征的病理状态。

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方案

本文所述所有小鼠实验均依照德国北莱茵-威斯特法伦州动物伦理委员会的批准进行（批准号：81-02.04.2021.A221）。

注意：整个操作过程中需佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目用具）。

1. 小鼠肺组织的取样与制备

注意：在组织采集前，根据机构和政府指导原则，通过过量异氟烷使小鼠安乐死。

  1. 沿中线切口小心打开胸腔，然后沿膈肌附着处剪开膈肌，轻柔暴露肺组织。
  2. 将左右肺叶整体切除，完整取出整个肺组织，注意保持所有肺叶结构完整。
  3. 将肺叶分别放入含有2 mL 10%中性缓冲甲醛溶液的5 mL离心管中，于4 °C孵育15–20小时。
    注意：固定可保存组织结构，用于后续组织学和弹性纤维分析。由于本实验流程的主要目的是可视化并定量评估弹性纤维的排列情况，而非肺泡形态计量分析，因此在组织处理前未进行充气固定。
    警告：中性缓冲甲醛含有甲醛，具有毒性、致癌性，可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。操作时应在经认证的化学通风橱内进行，并佩戴适当个人防护装备，包括手套、实验服和护目镜。
  4. 采用标准组织学包埋方案将固定后的肺组织包埋于石蜡中11。
    注意：确保组织完全脱水和充分浸蜡，以维持组织形态，便于后续染色。为减少样本间差异并保证不同实验条件下的可比性，每次分析应使用相同位置的肺叶。建议使用左肺叶进行组织学分析。
  5. 使用切片机将石蜡包埋（FFPE）的肺组织切成5–7 µm厚的切片，贴附于普通载玻片上。在进行后续操作前，于60 °C烘烤1小时。切片可在无尘环境中室温保存数周，或于4 °C长期保存。
    注意：储存期间应避免接触湿气，因为湿度可能导致石蜡氧化，影响染色质量。如需长期保存，建议将切片置于密封的塑料切片盒中，并加入干燥剂。
    暂停点：切片可于室温或4 °C保存，直至染色使用。

2. 弹性纤维染色

  1. 对5–7 µm厚的石蜡包埋肺组织切片进行Elastica（间苯二酚品红）染色，以显示肺泡和血管结构中的弹性纤维。
    注意：仅对可同时处理的切片进行染色，以确保各样本间染色强度一致且结果可重复。
    1. 将切片浸入二甲苯（混合异构体）中，每次5分钟，重复两次，以完成脱蜡。
      警告：二甲苯具有毒性且易燃。应在化学通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备。
    2. 将切片依次通过递减浓度的乙醇系列进行水化，直至80%乙醇。
      1. 在充满100%乙醇的染色缸中，室温孵育3分钟。
      2. 将切片转移至新鲜的100%乙醇中，室温孵育3分钟。
      3. 将切片转移至95%乙醇中，室温孵育3分钟。
      4. 将切片转移至80%乙醇中，室温孵育3分钟。
    3. 将切片转移至含有间苯二酚品红染液的新染色缸中，室温孵育20–30分钟。
      注意：间苯二酚品红染液可重复使用多次，在室温下稳定。
      警告：间苯二酚品红染液含有潜在有害化学物质，包括浓酸和染料，可能引起皮肤和眼睛刺激。应在通风良好区域或通风橱中操作，并根据机构安全指南佩戴适当的个人防护装备。
    4. 将切片置于流动的蒸馏水中冲洗1分钟。
    5. 在95–96%乙醇中分化15–60秒，并在显微镜下观察监控。
      注意：当弹性纤维保持深紫红色，背景充分清晰时停止分化。染色后的弹性纤维呈深紫色。胶原纤维不着色，通常呈浅色。过度染色会增加背景染色；应根据组织厚度和固定情况调整孵育时间。
    6. 立即将切片转移至双蒸水中，冲洗30秒以终止分化。可选：如需进一步评估肺组织，可进行复染，但可能降低纤维分割效率。我们建议对相邻切片进行H&E染色以评估肺组织形态。
    7. 依次在95%乙醇中脱水1–2分钟，随后在100%乙醇中脱水两次，每次1–2分钟，以去除残留水分。
    8. 将切片在二甲苯中透明两次，每次3分钟，直至组织呈现光学透明状态。
    9. 使用与二甲苯兼容的永久性合成树脂封片，并将切片在室温下水平干燥。
      注意：彻底脱水和透明是防止切片浑浊并确保染色切片长期保存的关键。
      暂停点：将染色并封片的切片在室温下保存，直至成像。

3. 弹性纤维成像与网络分析

  1. 图像采集
    1. 使用配备40×物镜的切片扫描仪获取肺组织切片的高分辨率明场图像。确保所有样本的曝光和白平衡设置一致。
      注：本研究中所有图像均采用相同的扫描仪设置获取，包括放大倍数、空间分辨率（0.25 µm/像素）、照明和曝光。
    2. 绘制一个包含整个肺组织切片的感兴趣区域（ROI），以确保扫描过程中完全覆盖。
    3. 定义一个无组织的背景参考区域，用于在图像分析过程中测量并扣除背景强度。
    4. 使用扫描仪的自动对焦检测功能，在组织上分配最佳数量的焦点，以确保图像清晰度和质量均匀。
    5. 使用均匀的照明和曝光设置采集图像。
      注：如果在致密或不平整区域自动对焦失败，应使用手动精细对焦调整，确保所有组织结构（包括肺泡和血管区域）均清晰成像。
  2. 图像去卷积：在QuPath中进行染料向量估计12。染料向量代表每种组织学染料特定的RGB吸光度值，可在颜色去卷积过程中分离重叠的染色。
    注：在本方案中，染料向量在QuPath中定义，因为Fiji中未提供resorcin-fuchsin的预设染料向量。
    1. 在QuPath中打开图像，并选择明场图像类型。
      注：为最小化偏差，应使用数据集中具有代表性的图像计算染料向量，并将相同数值应用于所有图像。
    2. 绘制一个主要包含弹性纤维的感兴趣区域（ROI），以定义第一个染料组分。
    3. 在“图像”选项卡中，进入染料向量部分。
    4. 点击“染料1”，然后根据ROI设置染料向量，以定义弹性纤维的颜色向量（通常为紫罗兰色）。
    5. 选择一个包含非弹性组织（如背景或胶原）的ROI，点击“染料2”，然后根据该ROI设置染料向量，以定义第二个颜色组分。
    6. QuPath将自动计算染料3，对应于背景。
    7. 在Fiji中计算并应用向量的一个示例：Resorcin-Fuchsin R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553；非特异性信号 R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295；背景 R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665。
      注：这些数值适用于仅用resorcin-fuchsin染色的图像。如果存在复染，则需重新计算新的染料向量。
    8. 将这些向量保存为自定义染料向量，并在所有样本中统一应用，以实现一致的颜色去卷积。
      注：从代表性区域定义自定义染料向量可提高颜色去卷积的准确性，尤其适用于resorcin-fuchsin染色，其中弹性蛋白和背景色调可能在不同批次间存在差异。
  3. 在Fiji中进行图像颜色去卷积13,14。
    1. 打开Fiji（ImageJ）并加载染色组织切片的明场图像。
    2. 可选：仅当图像尚未处于RGB格式时（例如8位图像），将其转换为RGB格式（图像 → 类型 → RGB颜色）。此步骤将打开一个新的图像窗口；请保存该图像以保留原始数据。
    3. 执行颜色去卷积：选择 图像 > 颜色 > 颜色去卷积 > 用户值。
    4. 输入先前从QuPath获得的自定义染料向量。
    5. 运行插件，生成三个独立的灰度图像，分别对应弹性纤维、不含弹性纤维的组织以及背景。
    6. 可直接将图像用于TWOMBLI分析，无需额外预处理。TWOMBLI需要具有足够分辨率的清晰图像；应避免平滑处理（如高斯模糊），以保留结构细节。
      注：确保在QuPath中用于向量估计的区域具有典型染色代表性，因为这些自定义向量将在所有图像中统一应用，以实现一致比较。
    7. 将弹性纤维通道保存为TIFF文件，用于后续定量和分析。
  4. 纤维分析的ROI选择
    1. 对每个肺切片，在肺泡区域选择五个无偏的方形ROI，在支气管周围区域选择五个ROI（每个100 µm × 100 µm）。
    2. 在原始图像上复制每个ROI（图像 > 复制），以保留原始数据。
    3. 在去卷积后的弹性纤维图像上复制相同的ROI用于分析。
    4. 将所有复制的ROI保存为单独的TIFF文件，用于后续分析。
      注：包含组织折叠、切片伪影、撕裂、大血管或肺泡结构保存不良的区域应从分析中排除。仅将去卷积后的弹性纤维ROI用作TWOMBLI分析的输入，而对应的原始图像副本则作为参考文件用于质量控制和视觉检查。感兴趣区域（ROI）应采用系统性随机抽样方法选择，以确保组织的无偏表征。为进一步减少操作者偏差，补充文件1和补充文件2中提供了与QuPath兼容的自动ROI选择脚本，其使用方法在第3.5节中描述。
  5. 在QuPath中使用自动ROI选择脚本进行自动ROI选择。
    1. 在QuPath中打开图像，并将图像类型设置为明场。
    2. 从工具菜单中选择所需的注释工具以创建初始注释。推荐使用方形注释。
    3. 在肺组织内绘制方形注释。每个注释应仅包含一个用于分析的感兴趣区域（ROI），即肺泡区域或支气管周围区域。
    4. 创建注释后，进入注释菜单并选择锁定注释，以防止意外移动或修改。
    5. 通过点击注释面板中“类别列表”旁的“+”按钮，添加“肺泡”和“支气管周围区域”类别。
    6. 为每个注释分配相应的类别。选择一个注释，选择对应类别，然后点击设置所选。注释颜色将发生变化，并在注释属性面板中显示已分配的类别（"肺泡"或"支气管周围区域"）。
    7. 打开相应脚本并执行。完成后，将显示一条消息，表明ROI已成功生成。新创建的ROI将在注释层级中作为原始类别定义注释的子注释出现。
    8. 要导出ROI，请选中它们并进入 文件 → 导出图像 → 原始像素。将导出的ROI保存为TIFF文件。
      注：脚本设计为仅识别类别名称"肺泡"和"支气管周围区域"。这些名称必须严格按照指定输入。默认情况下，脚本在每个注释内随机生成五个不重叠的100 µm × 100 µm方形ROI。仅当ROI的四个角和中心完全位于注释边界内时，才接受该候选ROI，以确保其完全包含在所选区域内。ROI的数量和尺寸均可在脚本中修改，以适应特定实验需求。建议每次分析至少包含三个生物学重复，每个样本至少五个ROI。
  6. TWOMBLI分析
    1. 将所有弹性纤维的ROI图像保存至专用文件夹用于分析。
    2. 在工作目录中创建两个子文件夹：a. Mask文件夹——用于存储TWOMBLI生成的二值掩膜；b. HDM文件夹——用于存储TWOMBLI生成的高密度矩阵（HDM）图像。
    3. 运行TWOMBLI插件：打开Fiji并启动TWOMBLI（插件 -> 宏 -> 运行）。
    4. 选择适当的分析参数文件。用于弹性纤维分析的TWOMBLI参数如下所列，详见表1。
      注：这些参数可能因染色强度不同而有所变化。参数通过在标准染色条件下获取的多个代表性肺组织切片图像进行经验优化。优化过程通过比较生成的掩膜与原始染色模式，并选择分割掩膜与底层弹性纤维网络重叠最佳的设置来完成。一旦确定，相同参数即应用于数据集中的所有图像。
    5. 选择“深色纤维在浅色背景上”选项。
    6. 在Mask文件夹中生成并保存二值掩膜。
    7. 在HDM文件夹中生成并保存二值图像。
    8. 提取定量网络参数，如纤维长度、分支点、曲率、密度和取向。
      注：TWOMBLI分析需要清晰的高分辨率图像（>1像素/µm）。颜色去卷积效果差、失焦区域或图像压缩可能影响纤维网络定量的准确性。
  7. 定量与统计分析
    1. 将TWOMBLI网络参数导出为CSV文件。
    2. 将原始CSV数据导入GraphPad Prism进行统计分析和可视化。
      注：推荐以下参数：掩膜总长度，反映ROI内弹性纤维的总量，可用于量化纤维丰度和丢失情况；纤维端点数指示纤维断裂程度，端点数量增加表明纤维断裂或破坏；纤维分支点数衡量纤维的连接程度，反映细胞外基质（ECM）网络的结构复杂性和完整性，分支点越多表明网络越复杂交织；孔隙度（Lacunarity）量化ROI内纤维分布的均匀性，低孔隙度表示网络均匀且孔隙大小相似，高孔隙度则反映网络异质且孔隙大小不一，代表更复杂的结构；盒计数-分形维数（Box Counting-Fractal Dimension）捕捉纤维结构的复杂性，分形维数越高表明网络越精细复杂，数值越低则反映结构更简单或受损。
    3. 生成柱状图，显示每个量化网络参数（如纤维长度、分支、曲率和密度）的均值±标准误（SEM）。
    4. 使用Shapiro-Wilk检验测试数据正态性。对于符合正态分布的数据，采用双尾非配对Student t检验；对于非参数数据，采用Mann-Whitney U检验。当比较涉及两个以上实验组时，应采用单因素方差分析（ANOVA）后接适当的多重比较事后检验，或对非参数数据采用Kruskal-Wallis检验。
      注：保持所有原始CSV文件不变，以确保可重复性和数据可追溯性。在图注中报告每种条件下分析的ROI数量和生物学重复数。

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结果

本方案可提供不同肺区及实验条件下弹性纤维网络的定量参数。如前所述，TWOMBLI 分析可获得纤维长度、分支密度、孔隙度和分形维度等参数，用于细胞外基质评估10。在此框架基础上，我们的方法能够全面表征弹性纤维的组织结构，从而对生理和病理肺组织中纤维丰度、连通性、均匀性及结构复杂性的变化进行评估。

在健康的肺组织中，弹性纤维沿肺泡隔和支气管周围结构形成长而连续且排列整齐的网络。相比之下，病理状态或代谢改变的肺组织（如来自肥胖小鼠的肺组织）常表现出分支增多和网络复杂性增加，反映出弹性纤维结构的异常重组。3代表性输出结果，包括二值掩膜和定量参数，如图所示。 图1A，B这些输出结果可与组织学和分子分析相结合 评估细胞外基质完整性及重塑程度3. 通过健康肺组织示例展示空隙度（lacunarity）与间隙填充（gap filling），以可视化细胞...

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讨论

本方案提供了一种可靠且可重复的工作流程，用于研究小鼠肺部细胞外基质（ECM）的结构，特别关注成纤维细胞介导的弹性纤维重塑。弹性纤维对于维持肺的顺应性和回缩能力至关重要，其结构破坏是多种肺部疾病的显著特征，包括肺纤维化、肺损伤、衰老及代谢性疾病2。尽管弹性纤维具有关键功能作用，但对其组织结构与组装的定量评估仍较为有限。本工作流程通过实现对弹性纤维网络结构的系统性与定量表征，弥补了这一技术空白。

该方法的一个主要优势在于将定量成像工作流程与组织结构学分析相结合。传统方法通常分别评估细胞外基质（ECM）成分或组织学特征，而本方案能够对弹性纤维的排列进行客观量化，包括纤维长度、分支情况以及网络复杂性。这使得生理状态与病理状态之间可直接比较，并有助于深入理解成纤维细胞介导的细胞外基质重塑过程3。

然而，若干技术因素对于确保实验一致性和数据质量至关重要。间苯二酚品红染色对固定时间、切片厚度和试剂稳定性等变量较为敏感，因此标准化对于实验可重复性至...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们感谢波恩大学医学院组织学核心设施提供的支持。此外，我们感谢达妮埃拉·克劳斯（Daniela Kraus）以及iFET动物实验中心全体团队成员的协助工作。V.L.K. 的研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）根据德国卓越战略（Germany’s Excellence Strategy）资助——卓越集群2151（EXC 2151）– 项目编号390873048。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Axio CS2 载玻片扫描仪 卡尔·蔡司
考普林玻璃染色缸Sigma-AldrichS6016
DPX封片剂Sigma-Aldrich6522
组织学用乙醇（100%）卡尔·罗斯9065.4
Fijihttps://imagej.net/software/fiji/版本 1.54t
中性缓冲甲醛溶液，10%SigmaHT501128
HISTOSETTE I 组织处理/包埋盒Sigma-AldrichH0542
切片机赛默飞世尔科技HM355S
显微镜载玻片VWR631-0108
小鼠：C57BL/6J杰克逊实验室RRID: IMSR_JAX:000664品系编号：000664 
石蜡包埋系统Epredia HistoStar 包埋模块
Prismhttps://www.graphpad.com 版本 11
Qupathhttps://qupath.github.io版本 0.7.0
间苯二酚-品红沃尔德克2.00E-30
TWOMBLI 插件https://github.com/wershofe/TWOMBLI
二甲苯Applichem GmBH14020172

参考文献

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