利用定量成像分析在肺组织中进行弹性纤维剖面

摘要

本文介绍了一份详细介绍小鼠肺组织弹性纤维可视化和定量分析组织准备的方案。该方法能够在生理和病理条件下稳健评估组织结构、空间纤维组织及细胞外基质重塑。

摘要

肺细胞外基质（ECM）的重塑是肺损伤和疾病的关键特征。弹性纤维是肺ECM的核心组成部分，提供正常呼吸功能所需的弹性和回坐力，其破坏会导致组织力学受损。该方案描述了一个稳健且可重复的流程，用于小鼠肺组织的制备和分析，重点是弹性纤维的可视化和定量剖析。该书概述了优化的组织处理和组织染色方法，以保护和检测弹性蛋白结构。此外，该方案详细介绍了影像分析流程，能够定量评估肺部弹性纤维的丰度、组织结构和空间分布。该工作流程还结合了QuPath中的染色矢量估计、Fiji/ImageJ中的颜色反卷积以及基于TWOMBLI的图像分析，以实现弹性纤维丰度、分支和网络复杂度的定量评估。包含图像采集、兴趣区域选择、参数优化和质量控制策略，以确保可重复性并减少用户依赖性偏差。通过该流程，我们成功识别了肥胖小鼠肺部弹性纤维组织和网络结构的变化，证明其在检测疾病相关ECM重塑中的适用性。这些方法共同提供了一个全面的框架，用于研究弹性纤维重塑及其对生理和病理条件下组织结构的贡献。该方法有助于研究成纤维细胞驱动的结构变化，并支持对肺部疾病背后ECM变化机制的机制性见解。

引言

弹性纤维是肺细胞外基质（ECM）的重要组成部分，ECM主要由弹性蛋白及相关的微纤维蛋白组成，这些蛋白组装成高度有序、具有弹性的^网络1。在肺部，弹性纤维排列于肺泡隔膜和支气管周围结构上，提供正常呼吸力学所需的弹性和回坐力 ^1,2。作为肺、主动脉和子宫等组织中最丰富的结构性ECM成分之一，其完整性对于维持^组织顺应性至关重要^1,2。弹性纤维组织的破坏已在多种肺部疾病中被观察到，包括纤维化、肺气肿和慢性炎症性疾病，这些疾病中纤维结构的改变会导致肺功能和机械性能受损 ^2,3。

肺母体最近被鉴定，揭示了核心ECM蛋白如胶原蛋白和层联蛋白，以及母体相关成分，包括细胞因子、ECM调控因子和ECM相关蛋白（如整合素配体、半凝蛋白）^4,5。除了提供结构支持外，这些成分还积极调节组织功能，形成支持驻留和迁移细胞的特殊生态位 ^6,7。值得注意的是，近期研究表明，肥胖等代谢状况与弹性纤维组织的显著变化相关，将系统性代谢失调与肺部ECM结构和成纤维^{细胞功能的变化}联系起来。这些发现强调了将弹性纤维重塑视为一个动态且与疾病相关的过程的重要性。

弹性纤维的传统评估通常依赖于定性组织学评估、半定量评分系统或弹性蛋白丰度测量，这些方法提供关于纤维组织、连接性和网络复杂度的信息有限 ^8,9。虽然这些方法有助于检测弹性蛋白含量的显著变化，但可能无法捕捉与组织重塑相关的细微结构变化。基于图像的定量分析有潜力克服这些局限，能够客观且可重复地描述弹性纤维网络，并便于不同实验条件和研究之间的比较。为此，本文所述的协议支持对肺部ECM组织的综合分析，特别关注弹性纤维结构。除了已建立的ECM表征^4,5方法外，该工作流程还结合了Elastica染色和基于TWOMBLI的¹⁰张图像分析流程，优化了肺组织结构。通过结合Elastica染色与定量网络分析，该工作流程超越了传统的组织学评估，能够详细表征纤维丰度、断裂、空间组织和结构复杂性。该方案特别适合研究纤维化、肺气肿、肥胖相关肺重塑、炎症性肺病、衰老及其他以肺部细胞外基质重塑为特征的疾病。

方案

本文所述的所有小鼠实验均依据德国北莱茵-威斯特法伦州动物伦理委员会的批准进行（亚利桑那州：81-02.04.2021.A221）。

注意：在整个过程中请佩戴适当的个人防护装备（白大褂、手套、护目镜）。

1. 小鼠肺组织的采样与制备

注意：小鼠在组织采集前根据机构和政府指南通过异氟醚过量安乐死。

1. 小心地用中线切口打开胸腔，然后沿着连接处切开膈肌，轻柔地露出肺部。
2. 切除左右两叶，同时切除整个肺部，但要确保所有叶都完整。
3. 将肺叶单独放入5毫升管内，内含2毫升10%中性缓冲福马林，在4°C下孵育15–20小时。
   注：固定方法保留组织结构，以便后续组织学和弹性纤维分析。由于该工作流程的主要目标是对弹性纤维组织的可视化和定量评估，而非肺泡形态测量分析，因此肺部在组织处理前并未进行膨胀固定。
   注意：中性缓冲福尔马林含有甲醛，甲醛有毒、致癌，可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。在认证的化学排气柜内使用福尔马林，同时佩戴适当的个人防护装备，包括手套、实验服和安全眼镜。
4. 将固定肺组织嵌入石蜡中，采用标准组织学嵌入方案¹¹。
   注意：确保完全脱水并浸润石蜡，以维持组织形态以便后续染色。为了最小化样品间的变异性并确保不同实验条件下的兼容性，每次分析都使用相同的肺叶。建议使用左叶进行组织学检查。
5. 用切片机将FFPE肺组织切成5–7微米厚的切片，并安装在标准玻璃载玻片上。在60°C下烘烤滑梯1小时后，再进行下游应用。载玻片可在RT无尘环境中保存数周，或在4°C下长期保存。
   注意：储存期间避免接触湿气，因为湿度会导致石蜡氧化，影响染色质量。如果需要长期储存，将载玻片存放在密封的塑料滑套盒中，并加以干燥剂。
   暂停点：将玻片保存在RT或4°C，直到染色。

2. 弹性纤维染色

1. 对5–7微米石蜡嵌入肺组织切片进行Elastica（树脂-紫后沉）染色，以观察肺泡和血管结构内的弹性纤维。
   注意：仅染色可同时处理的切片数量，以确保染色强度一致且样品间的重复性。
   1. 脱堂黄载玻片通过将载玻片浸入二甲苯（混合异构体）中两次，每次5分钟。
      注意：二甲苯有毒且易燃。在化学熏蒸柜内操作，并佩戴适当的防护装备。
   2. 在乙醇序列中对玻片进行水化，直到乙醇含量达到80%。
      1. 将载玻片在充满100%乙醇的染色室中以RT培养3分钟。
      2. 将载玻片转移到新鲜的100%乙醇中，在RT下培养3分钟。
      3. 将载玻片转移到95%乙醇中，在RT下培养3分钟。
      4. 将载玻片转移到80%乙醇中，在RT下孵育3分钟。
   3. 将载玻片转移到含有Resorcin-Fuchsin溶液的新染色室，并在RT下培养20–30分钟。
      注意：Resorcin-Fuchsin染色溶液可多次使用，且在RT下稳定。
      注意：霉素-紫香染色液含有潜在有害化学物质，包括浓酸和染料，可能导致皮肤和眼睛刺激。在通风良好的地方或排气柜处理溶液，并根据机构安全指南佩戴适当的个人防护装备。
   4. 将滑套放入染色室，浸泡在流动的蒸馏水中，洗涤1分钟。
   5. 在95–96%乙醇中分离：15–60秒，显微镜下观察。
      注意：当弹性纤维保持深紫紫色且背景充分清除时停止。染色的弹性纤维呈现深紫色。胶原纤维保持不染色，通常呈淡色。过度染色会增加背景;根据组织厚度和固定情况调整潜伏时间。
   6. 立即将载玻片倒入蒸馏水中冲洗30秒，阻止分色。可选：如有需要，可进行反染色以进行额外肺部评估，但可能降低纤维分段效率。我们建议对邻近切口的肺部进行H&E染色。
   7. 依次用95%乙醇脱水1–2分钟，然后两次100%乙醇脱水，每次1–2分钟，以去除残留水分。
   8. 在二甲苯中清除切片2次，每次3分钟，直到组织看起来光学透明。
   9. 使用与二甲苯兼容的永久合成树脂安装盖片，并让玻片在RT下平整干燥。
      注意：彻底脱水和清除对于防止浑浊并确保染色部分长期保存至关重要。
      暂停点：将染色的已装载玻片存放在RT处，直到成像结果。

3. 弹性纤维成像与网络分析

1. 图像采集
   1. 使用带有40×物镜的切片扫描仪获取肺组织切片的高分辨率明场图像。确保所有采样的曝光和白平衡设置一致。
      注：整个研究期间，图像均使用相同的扫描仪设置拍摄，包括放大倍率、空间分辨率（0.25 μm/像素）、照明和曝光。
   2. 绘制涵盖整个肺组织切片的兴趣区域（ROI），以确保扫描时覆盖范围完全。
   3. 定义一个无组织的背景参考区域，用于测量并在图像分析中扣除背景强度。
   4. 利用扫描仪的自动对焦检测功能，在组织中分配最佳的焦点数量，确保清晰度和图像质量的均匀。
   5. 使用均匀的照明和曝光设置拍摄图像。
      注意：如果自动对焦在密集或不均匀区域失效，请手动调整精细对焦，确保所有组织结构，包括肺泡和血管区域，都被清晰捕捉。
2. 图像反卷积：QuPath¹²中的染色矢量估计。染色矢量代表每种组织学染料的特定RGB吸光值，允许在颜色解卷积过程中分离重叠染色。
   注意：在本协议中，染色载体在QuPath中定义，因为斐济没有预设的鏵鱼-紫红染色载体。
   1. 在QuPath中打开图像，选择明场图像类型。
      注意：为减少偏差，使用数据集中的代表性图像计算染色矢量，并将相同数值应用于所有图像。
   2. 绘制一个主要含有弹性纤维的兴趣区域（ROI），以确定第一个染色成分。
   3. 在图片标签页中，导航到染色矢量部分。
   4. 点击染色1，然后设置ROI中的染色矢量，定义弹性纤维（通常是紫紫色）的颜色矢量。
   5. 选择含有非弹性组织（如背景或胶原蛋白）的ROI，点击染色2，然后设置ROI中的染色矢量以定义次级颜色成分。
   6. QuPath 会自动计算对应背景的污渍 3。
   7. 斐济计算和应用的向量示例：Resorcin-Fuchsin R：0.6201225，G：0.6541292，B：0.43308553;不特定信号 R：0.31585205;G：0.815618;B：0.48477295;背景 R：-0.105005614，G：-0.4780256，B：0.87204665。
      注：这些数值仅针对仅用 resorcin-fuchsin 染色的图像进行染色。如果存在反染色，则需计算新的染色矢量。
   8. 将这些保存为自定义染色矢量，并应用以实现所有采样的颜色反卷积一致。
      注意：从代表性区域定义自定义染色矢量可提升颜色解卷积的准确性，特别是在 resorcin-fuchsin 染色时，弹性蛋白和背景色调可能因批次而异。
3. 图像：斐济颜色解卷积^13,14。
   1. 打开斐济（ImageJ），加载染色组织切片的明场图像。
   2. 可选：只有当图像尚未是RGB格式（例如8位图像）时，才将图像转换为RGB格式（图像→类型→RGB颜色）。此步骤会打开一个新的图像窗口;保存以保留原始原始数据。
   3. 通过选择“图像>颜色>颜色反卷积>用户值”来执行颜色反卷积。
   4. 进入之前从 QuPath 获得的自定义染色矢量。
   5. 运行插件生成三张独立的灰度图像，分别对应弹性纤维、组织（不含弹性纤维）和背景。
   6. 直接使用图片用于TWOMBLI，无需额外预处理。TWOMBLI需要清晰且分辨率足够高的图像;为了保留结构细节，应避免平滑（例如高斯模糊）。
      注意：确保QuPath中用于向量估计的区域代表典型染色，因为这些自定义向量会统一应用于所有图像，以确保比较一致。
   7. 将弹性纤维通道保存为TIFF文件，以便后续定量和分析。
4. 纤维分析的投资回报率选择
   1. 每个肺切片在肺泡区选择五个无偏方形ROI，在细气管周围区域选择五个ROI（每个100微米×100微米）。
   2. 在原始图像上复制每个投资回报率（图片>复制），以保留原始数据。
   3. 在去卷积弹性纤维分析中重复相同的投资回报率。
   4. 将所有重复的ROI保存为单独的TIFF文件以便后续分析。
      注意：含有组织褶皱、切片伪影、裂缝、大血管或保存不良的肺泡结构区域被排除在分析之外。仅使用去卷积后的弹性纤维ROI作为TWOMBLI分析的输入，而相应的原始图像复制品则保留作为质量控制和目视检查的参考文件。应通过系统随机抽样选择关注区域（ROI），以确保组织的无偏呈现。为进一步减少操作员偏差，补充 文件1 和 补充文件2中提供了与QuPath兼容的自动ROI选择脚本，其实现详见第3.5节。
5. 在QuPath中使用自动ROI选择脚本应用投资回报率选择。
   1. 在QuPath中打开图像，将图像类型设置为Brightfield。
   2. 在 工具 菜单中，选择所需的注释工具以创建初始注释。建议使用方形注释。
   3. 在肺组织内画方形注释。每个注释应仅涵盖一个用于分析的兴趣区域（ROI），即肺泡区或支气管周围区域。
   4. 注释创建完成后，进入 注释 区并选择 锁定注释 ，以防止意外移动或修改。
   5. 通过在注释面板中点击类别列表旁的“+”按钮，将“肺泡”和“支气管周围区域”这两个类别添加到分类列表中。
   6. 将每个注释分配给相应的类。选择一个注释，选择对应的类，然后点击 “Set selected”。注释颜色会变化，且指定的类别（“肺泡”或“支气管周围区域”）会显示在注释属性面板中。
   7. 打开相应的脚本并执行它。完成后，将会有消息提示投资回报率已成功生成。新创建的ROI将作为原始类定义注释的子注释出现在注释层级中。
   8. 要导出ROI，选择它们并导航到文件→导出图片→原始像素。把导出的ROI保存成TIFF文件。
      注意：这些脚本设计仅识别类别名称“肺泡”和“支气管周围区域”。这些名称必须严格按照规定输入。默认情况下，脚本会随机生成五个不重叠的正方形ROI，每个注释中大小为100微米×100微米。候选投资回报率只有在其角落和中心完全包含在注释边界内，确保完全包含在所选区域内时才被接受。ROI的数量和维度可以在脚本中调整，以适应具体的实验需求。建议至少进行三次生物复制，且每样本至少需五次ROI。
6. TWOMBLI 分析
   1. 将所有弹性纤维的ROI图像保存到专用文件夹中以便分析。
   2. 在工作目录内创建两个子文件夹：a.掩码文件夹——用于TWOMBLI生成的二进制掩码。b. HDM 文件夹——用于 TWOMBLI 生成的高密度矩阵（HDM）图像。
   3. 运行TWOMBLI插件：打开Fiji并启动TWOMBLI（插件 -> 宏 ->运行）。
   4. 选择相应的分析参数文件。以下TWOMBLI参数用于弹性纤维分析，列于 表1。
      注意：这些参数可能因染色强度而异。参数通过多张代表性肺组织切片图像进行实证优化，且该图像在标准化条件下染色。优化通过将生成的掩膜与原始染色图案进行比较，并选择能使分段遮罩与底层弹性纤维网络之间有最佳重叠的设置来实现。一旦确定，数据集中的所有图像都应用相同的参数。
   5. 选择“深色纤维覆盖浅色背景”选项。
   6. 在Mask文件夹中生成并保存二进制遮罩。
   7. 生成并保存二进制图片到HDM文件夹。
   8. 提取网络的定量参数，如光纤长度、分支点、曲率、密度和比对。
      注意：TWOMBLI分析需要清晰、高分辨率的图像（>1像素/微米）。颜色去卷积不良、失焦区域或图像压缩可能影响光纤网络量化的准确性。
7. 定量与统计分析
   1. 导出TWOMBLI网络参数为CSV文件。
   2. 将原始CSV数据导入GraphPad Prism，用于统计分析和可视化。
      注意：推荐使用以下参数：掩膜总长度，反映投资回报率内弹性纤维的总量，便于量化纤维丰度和损失。光纤端点表示纤维碎片化的程度;终点数量增加表明纤维断裂或断裂。光纤分支点测量光纤的互联程度，反映ECM网络的结构复杂性和完整性。分支点越多，说明网络越复杂且交织。缺乏性量化了纤维分布在ROI中的均匀性。低空缺表示网络均匀且间隙大小相近，而高空缺性则反映一个异质网络，间隙大小可变，描述结构更复杂。盒计数-分形维度捕捉了纤维结构的复杂性。分形维度越高，网络越复杂、更细致，越低，结构越简单或被破坏。
   3. 生成列图，显示每个定量网络参数（如纤维长度、分支、曲率和密度）的平均 ± SEM。
   4. 使用Shapiro-Wilk检验进行数据正态测试。对于参数数据，应用双尾无配对学生t检验。对于非参数数据，应用曼-惠特尼U检验。对于涉及多个实验组的比较，应采用单向方差分析（ANOVA），随后进行适当的事后多重比较检验，或非参数数据的Kruskal–Wallis检验。
      注意：保持所有原始CSV文件不变，以确保可重复性和数据可追溯性。报告图中图例中每种条件分析的ROI和生物复制数量。

结果

该方案提供了弹性纤维网络在不同肺部区域和实验条件下的定量参数。如前所述，TWOMBLI分析可获得纤维长度、分支密度、空隙度和分形尺寸等参数，用于细胞外基质评估¹⁰。基于该框架，我们的方法能够全面表征弹性纤维组织，从而评估生理和病理肺组织中纤维丰度、连接性、均匀性和结构复杂性的变化。

在健康的肺组织中，弹性纤维沿肺泡隔膜和支气管周围结构形成长而连续且排列良好的网络。相比之下，病理性或代谢改变的肺，如肥胖小鼠的肺，通常表现出分支增加和网络复杂度增加，反映弹性^{纤维组织的变化}3。代表性输出，包括二进制掩码和定量参数，如 图1A、B所示。这些输出可与组织学和分子分析 整合，以评估ECM完整性及重塑^程度。在健康肺组织中，通过裂隙和间隙填充来观察ECM组织的差异（见图1C）。结合其他定量指标，这些参数捕捉网络复杂性，揭示由ECM重组驱动的组织结构变化，洞察弹性纤维网络中结构重塑的不同模式。

准确解读这些定量输出的关键在于高质量的图像采集和处理。不理想的成像或处理条件，包括对焦差、照明不一致或染色矢量估计不准确，可能导致遮罩碎片化或噪点大，进而导致定量输出不可靠（见图1D）。因此，在解读前，对原始图像和分割结果进行仔细的目视检查至关重要，以确保数据质量。次优掩膜通常表现为连续纤维过度碎片化、断裂或不完全的分割、背景噪声作为纤维结构的掺入，或原始染色图案与生成掩膜之间重叠不良，这表明图像采集、染色矢量估计或分割参数需要重新评估。为说明这些特征，故意分析了带有反染色的切片，这会干扰弹性纤维的识别，导致分段效果不佳。图 1E展示了这样一种低质量掩罩的例子。为进一步评估工作流程的鲁棒性和可重复性，两位研究者使用相同的优化分析参数独立分析了图像数据集（见图2A）。此外，还纳入了来自独立动物的样本，以评估生物变异性（见图2B）。在操作员和生物复制品之间获得了可比的定量输出，支持了拟议图像分析流程的可重复性和用户独立性。这些分析共同表明，该工作流程能够稳健评估弹性纤维组织，并便于生理与病理条件的比较。

图1. Elastica染色分析工作流程。 （A） 代表性原始图像，通过图像解卷积获得的孤立弹性纤维信号，使用TWOMBLI生成的二进制掩码，以及原始弹性纤维与相应遮罩叠加，展示了准确的分割。（B） 由TWOMBLI分析生成的代表性定量参数。（C）健康小鼠肺组织中空缺性和间隙填充分析示例，以说明细胞外基质组织的差异。（D） 因图像采集或图像处理不优而导致的碎片化和噪点掩码的示意图。（E）组织切片用血液素和伊苏素进行对色，显示弹性纤维识别受损且掩膜生成不优。标示原始染色图案与生成遮罩之间不匹配的区域。比例尺 A，D = 100微米， E = 50微米。 请点击此处查看该图的更大版本。

图2。弹性纤维分析工作流程的可重复性和稳健性。 （A） 两位研究人员使用TWOMBLI分析参数独立分析图像数据集，以评估操作员间的可重复性。展示了定量的TWOMBLI衍生指标。A和B表示两个独立的算符。（B）分析了来自独立动物的样本以评估生物变异性。展示了定量的TWOMBLI衍生指标，展示了生物复制体间的可比输出，支持分析流程的稳健性。M1、M2和M3表示个体健康的个体。n = 3，统计分析采用单向方差分析，随后进行Dunnett多重比较检验。 请点击此处查看该图的放大版本。

参数	价值观
对比饱和度	0.75
最小线宽	5
最大线宽	10
最小曲率窗口	20
最大曲率窗口	80
最小分支长度	10
Maximun HDM 显示屏	175
最小隙直径	0

表1： TWOMBLI衍生定量参数摘要。 TWOMBLI生成的参数及其解释，用于评估肺组织弹性纤维结构。指标包括光纤数量、分支、对齐、连接性和网络组织等指标。

补充文件1：无偏投资回报率的肺泡 请点击此处下载此文件。

补充文件2：无偏ROI支气管周围区域，请点击此处下载此文件。

讨论

该方案提供了一个稳健且可重复的工作流程，用于研究小鼠肺部细胞外基质（ECM）结构，特别关注成纤维细胞驱动的弹性纤维重塑。弹性纤维对于维持肺部顺应性和后坐力至关重要，其破坏是多种肺部疾病的标志，包括纤维化、肺损伤、衰老和代谢^疾病2。尽管弹性纤维具有核心功能作用，但对弹性纤维组织和组装的定量评估仍然有限。该工作流程通过系统化和定量地表征弹性光纤网络架构，弥补了这一空白。

该方法的一个主要优势在于将定量成像工作流程与结构组织学分析相结合。虽然传统方法通常分别评估ECM成分或组织学特征，但该方案能够客观量化弹性纤维组织，包括纤维长度、分支和网络复杂度。这有助于直接比较生理和病理状况，并为成纤维细胞介导的ECM重塑提供^见解。

然而，确保实验一致性和数据质量的关键是若干技术层面。Resorcin–Fuchsin染色对固定时间、切面厚度和试剂一致性等变量敏感，因此标准化对于可重复性至关重要。TWOMBLI的定量输出依赖于图像质量、分辨率和兴趣区域选择的一致性，因此必须与组织学评估一同解释，并在多个样本中进行验证。此外，肺泡和支气管周围区域的纤维密度和形态存在差异，需要针对特定区域进行优化。该方法捕捉了弹性纤维网络在二维中的整体组织，且不解析超微结构特征，而超微结构则需要电子显微镜等更高分辨率技术。三维成像技术，包括共聚焦显微镜或多光子显微镜，可能进一步提升纤维几何和连通性分析。

工作流程中的几个步骤对于确保结果的可靠性和可复现性尤为关键。组织固定、切片质量以及均匀的复染-紫杉染色对弹性纤维的可视化有显著影响，因此应严格标准化。 染色强度低、染色不均匀或背景较高可能源于试剂质量不一、染色条件不一致或组织保存不足。此外，建议纳入健康和病变肺组织、技术染色控制以及跨实验批次处理的参考样本，以监测染色的一致性和分析稳健性。富含弹性纤维的组织还可作为正对照，验证图像采集和分割程序。在图像反卷积过程中准确估计染色矢量是另一个重要步骤，因为不合适的矢量选择可能导致纤维提取不完整和遮罩碎片化。根据实验问题的不同，工作流程可以通过调整投资回报率的大小和数量、调整图像处理参数，或整合三维成像方法来进一步研究弹性纤维组织。

总体而言，该方法为研究ECM重塑在生理和病理背景下提供了多样化的平台。由于弹性纤维完整性直接关联肺部顺应性和机械功能，这种方法对于理解ECM结构变化如何转化为肺功能变化尤为重要。它非常适合研究成纤维细胞驱动的结构变化，并为更好地理解ECM重塑及其对疾病进展和组织功能的贡献提供了新机遇。该方法还可以扩展到其他组织，包括心血管组织、皮肤、子宫、结缔组织疾病、纤维化器官和人体标本，或结合先进的空间和高分辨率成像技术，进一步扩大其应用范围。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Axio CS2 幻灯片扫描仪	Carl Zeiss
Coplin 玻璃染色罐	Sigma-Aldrich	S6016
DPX 载玻片封片剂	Sigma-Aldrich	6522
组织切片用乙醇（100%）	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	版本 1.54t
中性缓冲福尔马林溶液 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I 组织处理/包埋盒	Sigma-Aldrich	H0542
显微切片机	Thermo Fischer Scietific	HM355S
显微镜载玻片	VWR	631-0108
小鼠：C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	菌株号：000664
石蜡包埋系统	Epredia HistoStar 包埋模块
Prism		https://www.graphpad.com	版本 11
Qupath		https://qupath.github.io	版本 0.7.0
间苯三酚-品红	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI 插件		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
二甲苯	Applichem GmBH	14020172