需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

新生儿脑内移植用于小胶质细胞替换及谱系分析 体内

146 次观看

⸱

DOI：

10.3791/72119

⸱

2026年7月28日

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

本方案可实现对特定小胶质细胞群体进行高效的新出生期脑内移植，支持在多种供体来源和受体模型中对小胶质细胞谱系及体内整合情况进行稳健的长期移植与分析。

摘要

通过髓系细胞移植实现小胶质细胞替换已成为研究神经过程与神经系统疾病的有前景的实验方法。然而，现有的移植策略常受限于嵌合效率低下、依赖基于照射的预处理，或在供体与受体系统之间灵活性不足。本文介绍了一种新生期颅内移植方案，用于引入纯化的小胶质细胞群体（Hoxb8 和非Hoxb8 小胶质细胞）移植到发育中的小鼠大脑中。该方法能够在生理上允许的条件下，实现供体细胞在脑实质中的高效植入与整合。重要的是，该方案适用于多种供体来源，包括胚胎期造血祖细胞和出生后脑源性小胶质细胞，并可应用于内源性小胶质细胞减少或缺失的不同受体模型，包括条件性 Csf1r缺陷型小鼠和 Csf1rΔFIRE 小鼠。供体细胞通过荧光激活细胞分选法进行纯化，并使用玻璃微量移液管双侧注射至新生小鼠脑内，以实现高效且微创的递送。受体小鼠饲养至适当年龄，使供体细胞得以扩增并定植于小胶质细胞生态位，随后通过组织学分析评估供体细胞的分布情况及标志物表达。该方法为研究小胶质细胞的发育起源提供了一个稳健且可扩展的平台 体内 在不同实验环境中的整合。

引言

通过移植髓系细胞实现小胶质细胞替代，已成为研究小胶质细胞生物学的一种有力策略，并有望成为神经系统疾病的潜在治疗范式。在过去几年中，该领域已发展出能够在中枢神经系统广泛替代小胶质细胞的策略1。最近的研究表明，来源于供体的巨噬细胞和前体细胞能够植入大脑，获得类似小胶质细胞的转录程序，并在某些情况下改善与疾病相关的表型2,3,4,5,6,7,8。这些发现支持了通过脑内巨噬细胞替代来研究并可能干预神经系统疾病进程的理念。

小胶质细胞移植的一个核心挑战是在实现高效植入的同时，尽量减少实验干扰因素。许多已建立的替代策略依赖于辐射、化疗或小胶质细胞清除范式，以创造可植入的生态位6,9,10,11,12,13。尽管这些方法有效，但可能诱发小胶质细胞衰老、破坏血脑屏障并改变炎症信号通路，从而干扰对供体细胞行为的准确解读9,14。近年来，研究开始探索无需预处理或毒性更低的小胶质细胞替代方法5,8,15。

发育时机是决定移植成功的重要因素。新生期大脑提供了一个允许性的环境，支持供体细胞的扩增和长期整合，这可能归因于结构屏障的减少以及内源性小胶质细胞生态位的持续建立。近期采用出生后早期（P0–P5）进行移植的研究表明，供体细胞能够有效植入脑实质并获得类似小胶质细胞的身份特征，进一步强调了发育背景在高效细胞替代中的重要性7,8,16,17。

Hoxb8 小胶质细胞为研究谱系特异性对小胶质细胞生物学的贡献提供了一个极具信息价值的系统。这些细胞起源于胚胎造血祖细胞，代表了一类特定的实质小胶质细胞亚群，其功能障碍可导致行为学后果17,18,19,20,21。近期利用原代 Hoxb8 祖细胞和小胶质细胞以及雌激素受体（ER）-Hoxb8 祖细胞系统的研究表明，这些细胞可在体外扩增、进行遗传操作，并成功移植到大脑中，在移植后表现出类似小胶质细胞的转录谱和功能特征7,8,17。这些进展进一步凸显了移植技术在解析小胶质细胞谱系与异质性方面的应用价值。

本文介绍了一种优化的新生小鼠脑内移植技术平台，该平台在供体与受体系统中均具有高度的通用性。与依赖照射或全身性预处理的方法不同，该技术通过直接向新生小鼠脑内进行双侧注射，将供体细胞植入发育上具有容受性的脑环境中，同时最大程度减少对全身系统的干扰。该方法适用于多种供体来源，包括胚胎期造血祖细胞和出生后脑源性小胶质细胞，并可应用于内源性小胶质细胞减少或缺失的不同受体模型。该技术的一个重要实用优势在于，新生小鼠颅骨较薄，可使用玻璃微量移液管进行快速的手动注射，无需钻孔或立体定位固定，仍可实现广泛的脑实质细胞植入。

综上所述，该方法为研究小胶质细胞的起源、异质性以及在不同实验条件下的体内整合提供了一个稳健、灵活且可扩展的系统。这使得新生期脑内移植成为系统性小胶质细胞替代策略的一种互补且可实验控制的替代方案。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究中的所有方法和实验均在小鼠上进行。实验方案已获得犹他大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，公共卫生服务保证编号为#D16-00018（A3031-01）。

1. 准备受精对以获得供体和受体仔鼠

  1. 傍晚将配种的雌雄小鼠放入同一笼中，以开始定时交配。
  2. 每天早晨检查雌鼠是否有阴道栓，以确认交配成功。
  3. 将发现阴道栓的雌鼠与雄鼠分离，并单独饲养至分娩，分娩期约为18–20天。
  4. 在分娩前7–10天，每天轻柔地抓握妊娠母鼠5分钟，以减少新生仔鼠操作带来的应激反应。
  5. 在每日抓握过程中，向母鼠暴露含有聚维酮碘气味的棉签，以降低手术后仔鼠归巢时的母体应激。
  6. 在预产期前为妊娠雌鼠准备好带有筑巢材料的清洁笼具。

2. 新生小鼠脑组织的收获与处理

  1. 使用带有假底的钟形罩或类似的密闭容器，通过过量异氟烷使新生供体小鼠（P0–P4）安乐死，以防止其直接接触麻醉剂。
  2. 待呼吸停止且确认反射消失后，立即进行断头。
  3. 取出完整脑组织，包括小脑和嗅球。将脑组织置于冰上塑料培养皿中的3 mL冷1×Hanks平衡盐溶液（HBSS）中。
  4. 使用无菌手术刀和镊子将脑组织切碎成约1–2 mm3大小的组织块。
  5. 将切碎的脑组织（每管一份脑组织）转移至含有神经组织解离系统配套酶解试剂的组织解离管中，按照制造商推荐的方案操作。
  6. 将解离管放入具备加热功能的机械解离装置中，按照制造商推荐的神经组织解离程序，在37 °C孵育30分钟。
  7. 用400 µL的1× HBSS预润湿70 µm细胞筛。
  8. 将解离后的组织通过预润湿的细胞筛过滤，细胞筛置于冰上放置的50 mL锥形管上方。
  9. 用10 mL的1× HBSS冲洗解离管，并将冲洗液通过滤膜，以确保最大程度回收细胞。
  10. 弃去滤膜，于室温下以300 ×g离心10分钟，吸除上清液。
  11. 每份样品用1 mL含无菌超纯水的红细胞裂解缓冲液重悬细胞，并在4 °C孵育10分钟。
  12. 加入10 mL含1% BSA和5% FBS的1× HBSS终止裂解反应。
  13. 弃去滤膜，于4 °C以300 ×g离心10分钟，吸除上清液。
  14. 使用血细胞计数板测定细胞数量。分选前典型的细胞产量范围为3.2–4.0 × 106。
  15. 将细胞重悬于含5% FBS的1× HBSS中，调整至下游抗体染色所需的浓度。

3. 小胶质细胞群体的FACS分选细胞抗体染色

  1. 在含有 Fc 受体阻断抗体（纯化 CD16/32，1:2000）的 1 mL 染色缓冲液（含 5% FBS 的 1× HBSS）中重悬细胞，并在 4 °C 下孵育 10 分钟。
  2. 在 4 °C 下以 240 ×g 离心 3 分钟，吸弃上清液。
  3. 将细胞与荧光标记抗体（CD45 APC，1:160；CD11b Alex Fluor 700，1:160）在 1 mL 染色缓冲液中混合，置于冰上避光孵育 30 分钟。
  4. 在 4 °C 下以 240 ×g 离心 3 分钟，吸弃上清液。
  5. 加入活力染料（例如 1× HBSS 中含 3 µM DAPI），以排除死细胞。
  6. 使用配备适用于 DAPI、GFP、tdTomato、CD45-APC 和 CD11b-Alexa Fluor 700 检测的适当激光器的高速细胞分选仪进行 FACS 分选。
  7. 尽可能使用 100 µm 喷嘴和低鞘压，以最大化细胞活力。在整个操作过程中将样品收集管和分选后的细胞置于冰上。
  8. 根据需要使用未染色细胞、单色补偿对照和荧光减一对照来设定电压、补偿和门控。
  9. 首先通过前向散射面积对侧向散射面积设门，以排除碎片。
  10. 利用侧向散射高度对侧向散射宽度设门，筛选单细胞。
  11. 通过 DAPI⁻ 设门排除死细胞。
  12. 从活的单细胞中，设门筛选 CD45low CD11b⁺ 小胶质细胞。
  13. 在 CD45low CD11b⁺ 小胶质细胞门内，利用 GFP 和 tdTomato 荧光区分供体小胶质细胞群体（Hoxb8 小胶质细胞：DAPI⁻ CD45low CD11b⁺ tdTomato⁺ GFP⁺；非-Hoxb8 小胶质细胞：DAPI⁻ CD45low CD11b⁺ tdTomato⁻ GFP⁺）。
  14. 将各细胞群分选至含有冷 1× HBSS 的无菌收集管中。
  15. 分选后，重新分析少量分选细胞，以确认纯度和活力，再进行移植。
  16. 将分选后的细胞收集于无菌 1× HBSS 中，并在避光冰上保存直至移植。
    注：每只新生小鼠脑（P0–P4）中 Hoxb8 小胶质细胞的典型产量为 3.70–4.60 × 104 个细胞，非-Hoxb8 小胶质细胞为 1.10–1.14 × 105 个细胞，具体产量可能因年龄、基因型及组织处理效率而异。建议尽快移植纯化的活细胞，最好在细胞分选后 60 分钟内完成。

4. 胎肝造血祖细胞的收获与处理

  1. 使用精密汽化器将5%异氟烷溶于氧气中，对怀孕母鼠实施安乐死，直至呼吸停止并确认反射消失。
  2. 在异氟烷过量处理后，根据机构动物护理与使用指南，采用颈椎脱位的物理方法进行二次确认，以确保动物死亡。
  3. 取出怀孕小鼠的子宫角，并将其置于塑料培养皿（60 mm × 15 mm）中含3 mL冷的1× HBSS的溶液中。
  4. 从子宫中解剖出E12.5胚胎，并转移至另一含有3 mL新鲜冷1× HBSS的塑料培养皿中。
  5. 使用精细镊子解剖胎肝，并将其放入含有5% FBS的3 mL新鲜冷1× HBSS的培养皿中。
  6. 使用26 G针头和3 mL注射器对汇集的胎肝组织进行机械性解离。
  7. 在4 °C条件下，以240 ×g离心5分钟，沉淀细胞，随后吸除上清液。
  8. 用1× HBSS洗涤细胞。
  9. 将细胞悬液通过80 µm细胞筛网过滤。
  10. 将细胞在20 µL红细胞裂解缓冲液（0.15 M氯化铵，1 mM KHCO₃）中孵育5分钟，随后加入13 mL 1× HBSS终止反应。
  11. 继续孵育5分钟，以完成红细胞裂解。
  12. 在4 °C条件下，以200 ×g离心5分钟，沉淀细胞。

5. 造血祖细胞的细胞抗体染色用于FACS分选

  1. 将胎肝细胞与荧光标记抗体（Ter119 PerCP-Cy5.5，1:50；Kit PE-Cy7，1:100）在含5% FBS和1% BSA的1× HBSS中混合，置于冰上避光孵育30分钟。
  2. 用1× HBSS洗涤细胞，并在4 °C下以240 ×g离心5分钟。
  3. 加入活细胞染料（例如，1× HBSS中含3 µM DAPI），以排除死细胞。
  4. 使用配备适用于DAPI、Ter119 PerCP-Cy5.5、Kit PE-Cy7、tdTomato和GFP检测的激光器及滤光片的高速细胞分选仪进行FACS分选。
  5. 尽可能使用100 µm喷嘴和较低鞘流压力，以最大化细胞活力。整个操作过程中，保持样品收集管和分选后的细胞置于冰上。
  6. 根据需要使用未染色细胞、单色补偿对照和荧光减一对照，以设定电压、补偿和设门参数。
  7. 首先通过前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）设门，排除碎片。
  8. 通过前向散射高度（FSC-H）对前向散射宽度（FSC-W）设门以筛选单细胞，随后通过侧向散射高度（SSC-H）对侧向散射宽度（SSC-W）进一步确认。
  9. 通过选择DAPI⁻细胞排除死细胞。
  10. 从活的单细胞群体中，通过选择Ter119⁻细胞排除红系谱系细胞。
  11. 在Ter119⁻群体中，选择Kithigh造血祖细胞。
  12. 在DAPI⁻ Ter119⁻ Kithigh群体中，通过选择tdTomato⁺细胞分离Hoxb8谱系阳性祖细胞。
  13. 若供体品系还携带Cx3cr1-GFP报告基因，则利用GFP荧光确认分选得到的胎肝祖细胞群体在此阶段为GFP⁻或GFPlow，从而将祖细胞与已分化的表达Cx3cr1的髓系细胞区分开。
  14. 将最终的DAPI⁻ Ter119⁻ Kithigh tdTomato⁺ GFP-细胞群分选至含有冷1× HBSS的无菌收集管中。
  15. 分选完成后，重新分析少量分选细胞，以确认纯度和活力，再进行移植。
  16. 将分选后的细胞收集于无菌1× HBSS中，并在避光冰上保存直至移植。
    注：典型产量约为每E12.5胎肝样本5.0–7.0 × 104个Hoxb8造血祖细胞，具体数量取决于胚胎大小和分选效率。建议尽快移植纯化的活细胞，最好在分选后60分钟内完成。

6. 准备注射针头

  1. 将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.58 mm，带纤维丝）装入微电极拉制仪中。
  2. 使用双阶段拉制程序拉制毛细管，优化参数以生成适合新生小鼠脑内移植的长锥形针头。
    1. 典型设置参数包括：加热温度 = 645，拉力 = 30，速度 = 120，延迟 = 关闭，气压 = 200。根据具体的玻璃类型、环境条件和拉制仪校准情况优化最终参数。随后修剪所制得的针头，并进行斜面打磨，使其最终外径尖端约为 30 µm。
  3. 将拉制好的针头放置于大型塑料培养皿内的两根橡皮泥条上，以在修剪和打磨前保护针尖免受损伤。
  4. 将拉制好的针头置于解剖体视显微镜下，放大倍数约为 10×–20×，并用柔软的支撑物固定。
    注意：在检查针尖时可使用更高放大倍数（20×–40×），以确认锥形结构是否良好形成，并在修剪和打磨前识别任何缺陷。
  5. 使用无菌剃刀片修剪针尖，使其外径约为 30 µm。
  6. 将修剪后的针头牢固固定在微磨器夹持装置中。
  7. 调节斜面角度至 30°–35°。
  8. 开启磨削装置及照明光源。
  9. 使蒸馏水以每 4–5 秒一滴的稳定速率滴落在磨石表面。
  10. 轻柔地将针尖接触旋转的磨石，直至形成斜面边缘。
  11. 若有条件，使用针尖测量装置测量斜面尖端的外径。
  12. 选择外径接近 30 µm 的针头用于移植操作。
  13. 用无菌缓冲液填充针头，并轻轻排出液体，以确认针尖通畅无阻。

7. 准备注射装置

  1. 组装一个手动控制的口吸移液装置，包括柔性管、口嘴、内置过滤器和毛细管固定器。
    注意：在口吸移液装置中加入内置过滤器，以防止污染。
  2. 在针尖上每2 mm做一次标记（每根针最多标记两次）。每2 mm对应约2 µL。
  3. 将制备好的玻璃注射针插入毛细管固定器约1.5 cm，并确认装配牢固且气密。
  4. 通过口嘴施加轻柔的吸力，以验证气流畅通且阻力适当。
  5. 在加载供体细胞前，确认系统能够平稳控制吸取和注射操作。
  6. 使用细小的移液枪头将制备好的供体细胞悬液（总共4.5 µL）从后端填充入玻璃注射针中。
    注意：开始移植前，确保针内无残留气泡。每只小鼠使用一根针。

8. 麻醉新生受体并准备手术区域

  1. 将新生小鼠仰卧位固定于手术台上，通过精密蒸发器以氧气为载体输送2.0%–5.0%异氟烷，诱导麻醉。
  2. 将小鼠鼻部置于鼻罩内，以在整个操作过程中持续输送异氟烷和氧气。
  3. 给予约1分钟时间诱导麻醉，并持续监测呼吸情况。
  4. 轻触四肢，确认无回缩反射，以验证麻醉深度足够。
  5. 达到适当麻醉水平后，将异氟烷浓度下调至0.5%–2.0%用于维持麻醉，并在移植手术期间持续麻醉不超过10分钟。
  6. 在手术台下方放置加热垫，维持新生小鼠体温在约38 °C。
  7. 使用无菌棉签交替涂抹聚维酮碘和70%乙醇，清洁头部注射部位。
  8. 最后涂抹一层聚维酮碘，待皮肤干燥后再进行注射。
    警告：异氟烷为有害麻醉剂，须使用适当的麻醉气体清除系统，并根据机构安全指南确保室内通风良好。

9. 进行新生小鼠脑内移植

  1. 使用戴手套的手指或柔软的支撑物轻轻固定头部，以尽量减少注射过程中的移动。
    注意：受体小鼠的移植时间在出生后第1至第4天之间。
  2. 在前背侧端脑（未来的额叶皮层区域）确定双侧注射位点，位置大约在矢状中线外侧1–2 mm，并紧邻嗅球后方。在两侧半球对称地定位注射点，同时避开可见的表面血管。
    注意：由于新生小鼠颅骨较薄且体型较小，注射操作依赖于可视解剖标志而非立体定位坐标。
  3. 目视检查颅骨，避免在可见血管附近插入针头。
  4. 轻柔地将带有斜面的玻璃微量移液管穿过皮肤和发育中的颅骨。
  5. 将针头引导至颅骨表面下方约1–2 mm处，进入额叶半球。
  6. 通过手动控制的口吸移液装置施加可控压力，递送供体细胞。
    注意：当移植纯化的造血祖细胞或新生小胶质细胞时，每侧半球注射2–3 µL，相当于每次注射约2.5 × 104个细胞。每只小鼠脑内总计约5 × 104个细胞。
  7. 缓慢将微量移液管从脑组织中撤出，以尽量减少细胞回流并降低组织损伤。
  8. 进行对侧注射。
    注意：每只小鼠使用一根针头，以避免小鼠之间的交叉污染。

10. 恢复移植后的新生幼崽

  1. 手术后立即将每只幼鼠放置在加热垫上。
  2. 持续监测幼鼠，直至其体色恢复正常，出现自主活动和整体活跃行为。
    注意：恢复时间范围为 5 分钟至 10 分钟。
  3. 将幼鼠放回母鼠身边。
  4. 用原笼内的垫料和筑巢材料彻底擦拭每只幼鼠。
  5. 将幼鼠重新放回含有母鼠的笼子中。
  6. 确认母鼠已将幼鼠全部收回并接受。

11. 术后健康的监测

  1. 移植后前3天内，每天观察幼鼠10分钟。
  2. 评估幼鼠的正常活动、吸吮行为以及与母鼠的互动情况。
    注意：在此期间不要打扰小鼠笼具，以免增加母鼠的应激反应。
  3. 初始3天期结束后，每隔一天继续监测幼鼠，直至断奶。
  4. 评估幼鼠的正常发育、摄食行为、活动水平及母体护理情况。
  5. 术后早期每日测量并记录体重。
  6. 观察幼鼠是否有痛苦迹象、异常姿势、嗜睡或摄食能力受损。
  7. 根据机构动物护理指南，在必要时实施人道安乐死。
    1. 对于新生小鼠，使用异氟烷过量麻醉，通过钟形罩或类似密闭容器（配备假底以避免与麻醉剂直接接触）进行。待呼吸停止且确认反射消失后，立即行断头术。
    2. 对于成年小鼠，通过精密蒸发器以5%异氟烷与氧气混合进行吸入麻醉，直至呼吸停止并确认反射消失，随后采用颈椎脱位作为二次物理方法以确保死亡。
      注意：在实验终点出现术后死亡或未检测到供体细胞植入的动物，将被排除在分析之外。由于新生小鼠脑内移植被视为微创操作，因此未给予术后镇痛。

12. 收集脑组织用于冷冻切片和免疫荧光染色

  1. 小心取出脑组织，并进行冷冻切片分析的准备工作。
  2. 按照先前描述的方法对出生后脑组织进行冷冻切片处理，并使用冷冻切片机切割冠状切片。
    注意：每只小鼠分析9–12张涵盖体感皮层的冠状切片。
  3. 将切片贴附到显微镜载玻片上，并在-20 °C保存直至染色。
  4. 将切片短暂孵育于含有0.2% Triton X-100和1%脱氧胆酸钠的通透缓冲液中。
  5. 在适当的抗体稀释缓冲液中稀释一抗（鸡抗GFP抗体，1:500；豚鼠抗tdTomato抗体，1:250；兔抗Iba1抗体，1:500）。
  6. 在4 °C下，将组织切片与一抗在避光条件下孵育过夜。
  7. 用磷酸盐缓冲液洗涤切片，以去除未结合的一抗。
  8. 在室温避光条件下，使用荧光标记的二抗（山羊抗兔Alexa Fluor 647，1:500；山羊抗豚鼠Alexa Fluor 555，1:500；山羊抗鸡Alexa Fluor 488，1:500）孵育切片2小时。
  9. 使用DAPI对切片进行复染，以显示细胞核。
  10. 使用抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片。

13. 获取共聚焦显微镜图像

  1. 使用配备 10× 或 20× 物镜的共聚焦显微镜采集荧光图像。
  2. 以 200–400 Hz 的扫描速度，采用 512 × 512 或 1024 × 1024 像素分辨率采集图像。
  3. 以 2–5 µm 的 z 轴步进间隔对组织进行光学切片采集。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

纯化的微胶质细胞群体在新生期脑内移植后，可在受体脑实质中长期存活并广泛植入。移植前，通过荧光激活细胞分选技术，利用荧光谱系报告基因对供体微胶质细胞群体进行纯化分离（Hoxb8 微胶质细胞：tdTomato⁺ GFP⁺；非Hoxb8 微胶质细胞：tdTomato⁻ GFP⁺）（图1A）。新生期脑内移植后，供体来源的细胞长期存活，并在受体脑实质中广泛植入。移植后5个月，来源于纯化新生期Hoxb8 微胶质细胞、非Hoxb8 微胶质细胞以及E12.5培养的Hoxb8 胎肝来源前体细胞的植入细胞可通过荧光谱系报告基因清晰识别，并呈现出成熟脑实质微胶质细胞典型的分支状形态（图1B）。图1和图2所示的代表性图像来自n = 3只受体小鼠。

受体背景显著影响移植效率。在永久缺乏内源性小胶质细胞的小鼠中（例如 Csf1rΔFIRE 受体），供体细胞的移植效...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

新生小鼠脑内移植纯化的微胶质前体细胞或特定微胶质亚群为重建微胶质细胞区室提供了一种可靠的方法 体内 并研究脑内巨噬细胞谱系特异性特性。该方法可利用基因型明确的供体细胞实现选择性重建，从而直接评估供体细胞在脑内环境中的植入与成熟情况。

该策略的一个关键优势在于其与多种供体来源和受体系统的兼容性。在本研究及我们先前的工作8,17中，胎肝来源的Hoxb8前体细胞和新生脑组织来源的小胶质细胞均成功植入并生成了成熟的实质小胶质细胞。这种移植策略表明，供体来源的细胞在长期植入后表达典型的小胶质细胞标志物，包括Tmem119和P2ry12，并获得与成熟实质小胶质细胞一致的转录特征8,17。先前的研究已表明，胎肝来源的Hoxb8前体细胞在小胶质细胞缺乏的环境中能够高效植入17<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（R01 MH093595）（M.R.C.）、Dauten 家族基金会以及犹他大学流式细胞术实验室资助。Csf1rΔFIRE 小鼠由犹他大学的 Ben Xu 博士制备。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
钟形罩多种不适用用于安乐死
带
细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管		Sutter InstrumentBF100-78-15用作注射针头
牛血清白蛋白（BSA）Sigma AldrichA8806用于配制磷酸盐缓冲液。有多种品牌可选，此处所列仅为示例。
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222髓系细胞
CD45 APCBioLegend103112造血细胞
细胞筛（70 µm）Falcon352350用于制备单
细胞悬液。有多种品牌可选，此处所列仅为示例。
鸡抗GFP抗体Aves LabsGFP-1020免疫荧光
染色
c-Kit PE-Cy7抗体BioLegend105814造血祖细胞
共聚焦显微镜LeicaTCS SP5用于荧光
成像
锥形管（15 mL / 50 mL）Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301用于组织/细胞处理。有多种品牌可选，此处所列仅为示例。
冷冻切片机Leicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/制备冷冻组织
切片。有多种品牌可选，此处所列仅为示例。
DAPI细胞核染色剂Thermo Fisher ScientificD1306用于细胞活力和
细胞核染色
体视显微镜Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/用于修整和制备注射
针头。有多种品牌可选，此处所列仅为示例。
FACSAria 流式细胞分选仪BD BioscienceFACSAria 细胞纯化
Fc阻断剂（纯化的CD16/32）Biolegend101302阻断抗体与表达Fc受体的小鼠细胞发生非特异性结合
胎牛血清（FBS）ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.html用于细胞制备
缓冲液。有多种品牌可选，此处所列仅为示例。
口吸移液管用软管多种不适用手动
注射装置的组件
流式细胞术分析软件FlowJov10.8.1用于FACS数据
分析
流式细胞分选仪BD BiosciencesFACSAria用于细胞纯化
gentleMACS Octo 解离器带
加热模块		Miltenyi Biotec130-096-427用于脑组织
解离
山羊抗鸡Alexa Fluor 488
二抗		Thermo Fisher ScientificA-11039二抗
山羊抗豚鼠Alexa Fluor
555二抗		Thermo Fisher ScientificA-21428二抗
山羊抗兔Alexa Fluor 647
二抗		Thermo Fisher ScientificA-21245二抗
山羊抗大鼠Alexa Fluor 647
二抗		Thermo Fisher ScientificA-48265二抗
豚鼠抗tdTomato抗体Frontier InstituteAB_2631185免疫荧光
染色
Hanks’平衡盐溶液
（HBSS）		Gibco14175-079用于细胞
制备过程
血细胞计数板多种不适用细胞计数
口吸移液管用在线滤器多种不适用防止污染
微针磨削仪NarishigeEG-400用于修磨玻璃
注射针头
微电极拉制仪Sutter InstrumentP-1000用于制备精细
注射针头
口吸移液管吹嘴多种不适用用于手动控制
注射
神经组织解离试剂盒（P）Miltenyi Biotec130-092-628用于脑组织的酶解解离
培养皿Thermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022用于存放拉制好的针头或组织收获。有多种品牌可选，此处所列仅为示例。
兔抗Iba1抗体Wako019-19741小胶质细胞标志物
兔抗TMEM119抗体Abcam209064小胶质细胞特异性标志物
大鼠抗CD206抗体BioLegend141712用于鉴定巨噬细胞群体
大鼠抗P2RY12抗体BioLegend848002小胶质细胞标志物
刀片/手术刀多种不适用用于修整针尖或
组织收获
红细胞裂解缓冲液ChemCruzsc-296258用于去除红
细胞
立体定位仪Kopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com/用于手术
植入。有多种品牌可选，此处所列仅为示例。
Ter119 PerCP-Cy5.5抗体BioLegend116228红系细胞谱系

参考文献

  1. Rao Y, Bai Y, Li X, Du B, Peng B. The evolution of microglia replacement: A new paradigm for CNS disease therapy. Cell Stem Cell. 2025;32(12):1807-1832.
  2. Wu J, et al. Microglia replacement halts the progression of microgliopathy in mice and humans. Science. 2025;389(6756):eadr1015.
  3. Capotondo A, et al. Intracerebroventricular delivery of hematopoietic progenitors results in rapid and robust engraftment of microglia-like cells. Sci Adv. 2017;3(12):e1701211.
  4. Shibuya Y, et al. Treatment of a genetic brain disease by CNS-wide microglia replacement. Sci Transl Med. 2022;14(636):eabl9945.
  5. Mishra P, et al. Rescue of Alzheimer’s disease phenotype in a mouse model by transplantation of wild-type hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Rep. 2023;42(8):112956.
  6. Colella P, et al. CNS-wide repopulation by hematopoietic-derived microglia-like cells corrects progranulin deficiency in mice. Nat Commun. 2024;15(1):5654.
  7. Nemec KM, et al. Microglia replacement by ER-Hoxb8 conditionally immortalized macrophages provides insight into Aicardi-Goutières syndrome neuropathology. eLife. 2026;14:RP102900.
  8. Van Deren DA, et al. Defective Hoxb8 microglia are causative for both chronic anxiety and pathological overgrooming in mice. Mol Psychiatry. 2026;31(2):915-928.
  9. Sailor KA, et al. Hematopoietic stem cell transplantation chemotherapy causes microglia senescence and peripheral macrophage engraftment in the brain. Nat Med. 2022;28(3):517-527.
  10. Priller J, et al. Targeting gene-modified hematopoietic cells to the central nervous system: Use of green fluorescent protein uncovers microglial engraftment. Nat Med. 2001;7(12):1356-1361.
  11. Elmore MRP, et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 2014;82(2):380-397.
  12. Wilkinson FL, et al. Busulfan conditioning enhances engraftment of hematopoietic donor-derived cells in the brain compared with irradiation. Mol Ther. 2013;21(4):868-876.
  13. Mildner A, et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat Neurosci. 2007;10(12):1544-1553.
  14. Monje ML, Mizumatsu S, Fike JR, Palmer TD. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat Med. 2002;8(9):955-962.
  15. Lombroso SI, et al. Microglia replacement by peripheral delivery of CSF1R inhibitor-resistant hematopoietic cells. Mol Ther. 2026;34(2):850-866.
  16. Bennett FC, et al. A combination of ontogeny and CNS environment establishes microglial identity. Neuron. 2018;98(6):1170-1183.e8.
  17. De S, et al. Two distinct ontogenies confer heterogeneity to mouse brain microglia. Development. 2018;145(13):dev152306.
  18. Van Deren DA, et al. Defining the Hoxb8 cell lineage during murine definitive hematopoiesis. Development. 2022;149(8):dev200200.
  19. Nagarajan N, Capecchi MR. Optogenetic stimulation of mouse Hoxb8 microglia in specific regions of the brain induces anxiety, grooming, or both. Mol Psychiatry. 2024;29(6):1726-1740.
  20. Tränkner D, et al. A microglia sublineage protects from sex-linked anxiety symptoms and obsessive compulsion. Cell Rep. 2019;29(4):791-799.e3.
  21. Chen SK, et al. Hematopoietic origin of pathological grooming in Hoxb8 mutant mice. Cell. 2010;141(5):775-785.
  22. Foran DR, Peterson AC. Myelin acquisition in the central nervous system of the mouse revealed by an MBP-Lac Z transgene. J Neurosci. 1992;12(12):4890-4897.
  23. Dangata YY, Kaufman MH. Myelinogenesis in the optic nerve of (C57BL CBA) F1 hybrid mice: A morphometric analysis. Eur J Morphol. 1997;35(1):3-18.
  24. Rojo R, et al. Deletion of a Csf1r enhancer selectively impacts CSF1R expression and development of tissue macrophage populations. Nat Commun. 2019;10(1):3215.
  25. Askew K, et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 2017;18(2):391-405.
  26. Lund H, et al. Competitive repopulation of an empty microglial niche yields functionally distinct subsets of microglia-like cells. Nat Commun. 2018;9(1):4845.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

233 233 Hoxb8 Hoxb8
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。