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方法文章

多物种缓步动物RNA提取方案

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DOI：

10.3791/72120

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2026年9月1日

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

本文内容

摘要

本方案详细描述了使用基于离心柱的RNA提取试剂盒从多种缓步动物中分离RNA的操作步骤，该试剂盒适用于从少量组织中提取足够量的高质量RNA，可用于RNA测序和互补DNA合成等下游应用。

摘要

缓步动物是一类以其对环境胁迫具有极强耐受性而著称的微型动物。这些动物能够耐受干燥、极端压力、低温以及高水平的电离辐射。然而，其极端耐受能力背后的分子机制尚未被完全阐明。研究这些机制所采用的分子方法，包括RNA测序、RNA干扰（RNAi）以及在细菌等系统中异源表达缓步动物基因，均需要从有限的生物材料中分离高质量的信使RNA（mRNA）。在本研究中，我们描述了一种可重复的从缓步动物中分离总RNA的实验方案，该方案（1）适用于多个物种，包括一种异缓步动物物种；（2）仅需25–200只动物，具体数量取决于个体体型大小；（3）所获得的RNA在数量和质量上均足以满足后续应用需求。本实验方案能够从合理数量的缓步动物中高效回收RNA，支持对多种缓步动物物种的胁迫耐受性进行分子层面的研究。

引言

缓步动物以其能够耐受其他动物无法承受的极端胁迫而闻名，这些胁迫包括干燥、极端压力、极端温度，以及化疗药物和电离辐射等导致DNA损伤的试剂1,2,3,4,5,6,7,8。近年来，科学家利用RNA测序、RNA干扰（RNAi）以及在其他系统（包括人类细胞和细菌）中异源表达缓步动物基因等分子方法，研究了缓步动物具有极端抗逆性的分子机制8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。这些方法的应用已成为强有力的工具，使我们得以深入了解缓步动物实现如此极端抗逆能力的具体机制8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22。然而，所有这些用于研究缓步动物胁迫耐受性的分子方法，都依赖于能够从这些微小生物中提取足量且质量足够高的RNA，以用于后续实验操作。

先前一种从缓步动物中分离RNA的方法在使用Hypsibius exemplaris23的研究人员中已证明是成功的。然而，当我们在H. exemplaris中尝试重复该方案时，发现其获得的RNA浓度和质量不可靠（未发表数据）。另一种基于苯酚的RNA分离方法已被证明适用于H. exemplaris、Ramazzottius varieornatus以及一种异缓步动物物种13,21,22,24,25,26。该方案已被证实可从单个动物或动物群体（约50只）中获得足量且高质量的RNA，适用于后续实验。然而，该方案要求操作者接触含苯酚的试剂。苯酚是一种危险化学品，需谨慎操作，若操作不当可能导致苯酚残留，影响RNA纯度及后续应用。另一种先前发表的从缓步动物中分离RNA的方案侧重于从单个动物中提取RNA的能力27。尽管该方案在定量PCR（qPCR）等应用中具有重要价值27，但对于RNA测序等需要全面了解动物对特定应激因素或条件响应的下游应用而言，其适用性较低。

这些现有RNA提取方案的局限性促使人们探索从缓步动物中提取RNA的替代方法。本方案所使用的基于离心柱的RNA提取试剂盒，专为从小量组织中提取RNA而设计。该试剂盒此前已被成功用于昆虫组织RNA的提取，并用于后续的RNA测序分析，表明其也可能适用于其他体型微小、具有角质层的动物（如缓步动物）的RNA提取。28本研究详细阐述了使用基于层析柱的RNA提取试剂盒从缓步动物中分离RNA的逐步操作流程，包括针对缓步动物特性在执行该流程时需特别注意的事项。本文报道了该流程在六种缓步动物物种中的成功应用。H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti，以及异缓步类 Viridiscus celatus). 该研究已证实，仅需25只动物即可获得质量和数量均足够的RNA。文中还提供了相应的RNA浓度与质量数据示例，其质量适用于后续实验应用，如RNA测序（偏差极小、可实现指数级文库扩增）和互补DNA（cDNA）合成。该RNA提取方案已被证明在揭示辐射耐受机制方面具有实用价值 H. exemplaris8该方案在多种缓步动物物种中的成功应用表明，其可更广泛地适用于研究抗逆机制、发育机制及进化过程。

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方案

以下实验方案无需机构动物伦理审批，因为无脊椎动物免于该要求。所用试剂和设备列于材料表中。

1. RNA 提取所需仪器与区域的准备

  1. 开启加热金属块或水浴锅，预热至 42 °C，以准备进行 RNA 提取。
  2. 准备微量离心管架、移液器（2 µL、20 µL、200 µL 和 1000 µL）以及相应规格的带滤芯移液器吸头。
  3. 使用 RNase Away、稀释漂白剂溶液（10%）或 70% 乙醇清洁实验台面、管架、移液器及吸头盒，以灭活可能存在的残留 RNase。
    注意：若操作设备或实验区域中存在过量 RNase，可能导致 RNA 分离后因降解而质量不足。为降低此风险，应留出充足时间使灭活 RNase 的试剂充分发挥作用，并确保实验区域和设备在继续操作前完全干燥。
  4. 本实验所有步骤均需佩戴手套，并在操作过程中频繁使用灭活 RNase 的溶液处理手套，以防止 RNA 被 RNase 降解。

2. 收集用于RNA提取的动物样本

  1. 使用连接有吸管装置腔室并配有玻璃毛细管（图1A）、Irwin环或微量移液器的移液球，将25–200只缓步动物（根据物种大小而定）从其培养皿转移至含有洁净泉水的培养皿中，以减少非缓步动物物质（如藻类或其他食物来源，例如线虫或轮虫，视物种而定）的含量。
  2. 准备一个1.5 mL无RNase的离心管和研杵。
  3. 使用连接有吸管装置腔室并配有玻璃毛细管或Irwin环的移液球，将动物转移至1.5 mL无RNase离心管底部，特别注意尽量减少随动物带入的水分。
  4. 在4,500 g 条件下离心3分钟，使缓步动物沉淀至微量离心管底部。
  5. 在解剖显微镜下观察含有沉淀缓步动物的离心管，使用20 µL移液器或连接有吸管装置腔室并配有开口小于所提取RNA缓步动物尺寸的玻璃毛细管的移液球，小心吸除尽可能多的水分，同时不扰动缓步动物沉淀。可参见 图1B 中所示可接受的残留水量示意图。
    注意：此处应保留极薄一层水分，以防动物在去除水分后、加入裂解缓冲液（XB）前的短暂时间内发生干燥。若动物干燥，可能导致RNA提取后质量下降。
  6. 向含有缓步动物的离心管中加入100 µL裂解缓冲液（XB）。

3. 缓步动物的机械破碎及RNA提取

  1. 使用无RNase的研杵，将研杵轻轻但有力地压入管底，研磨约30秒，以破碎缓步动物。总共进行20–30次研磨操作即可充分破碎缓步动物。
  2. 将研杵从管中取出时需小心操作，确保尽可能多的液体保留在管底。
  3. 在解剖显微镜下检查微量离心管内容物，确认无可见的完整动物残留。
  4. 将混合物置于振荡加热金属块上，于42 °C轻柔振荡（300 rpm）孵育30分钟。
    注意：提取缓冲液（XB）可稳定RNA，防止其在此温度下降解。

4. RNA 提取柱的预处理

  1. 在提取孵育的最后10分钟内，组装用于RNA收集和纯化的柱子。将纯化柱放入收集管中，并正确标记柱子。
  2. 直接向柱子中加入250 µL条件缓冲液（CB）。
  3. 在室温下孵育5分钟。
  4. 在16,000 × g 下离心1分钟，弃去穿流液。此时柱子已准备好接收下一步的RNA上清液。
  5. 从冰箱中取出10x DNase I反应缓冲液和无核酸酶水，使其充分解冻，以备后续第6步使用。

5. 将RNA结合到柱上

  1. 提取孵育后，将含有机械破碎缓步动物和提取缓冲液（XB）的离心管在 3,000 × g 条件下离心 2 分钟。
  2. 取一个新的无 RNase 离心管，并做好相应标记。
  3. 使用带滤芯的 200 µL 移液枪，小心地从沉淀的缓步动物角质层中移除上清液。注意不要扰动角质层沉淀，仅移除上清液。
    注意：若将角质层带入后续步骤，会因柱子物理堵塞而导致 RNA 产率降低。为避免此潜在误差，可在显微镜下观察含有上清液的移液枪尖端，确认无角质层存在。如发现角质层，应将上清液重新放回离心管，并重复离心步骤。
  4. 将上清液转移至新标记的无 RNase 离心管中。
  5. 向含有 RNA 的离心管中加入 100 µL 70% 乙醇，通过反复吹打数次充分混匀。在此步骤中，加入乙醇后应可见清晰的黏性丝状物，这是上清液中含有 RNA 的良好迹象。
  6. 将全部混合液（200 µL）转移至第 4 步中准备好的柱子上。
    注意：在此步骤及后续步骤中，向柱子中加入任何溶液时，应小心将液体加至柱子中央，避免移液枪头直接接触柱子表面。柱子受到机械穿刺将导致 RNA 质量和产量出现下游问题。
  7. 为使 RNA 结合到柱子上，先在 100 × g 条件下离心 2 分钟，随后在 16,000 × g 条件下离心 30 秒以去除穿流液。

6. 配制DNase I溶液

  1. 在配制溶液前，确保10x DNase I反应缓冲液和无核酸酶水完全解冻。
  2. 每次RNA提取需在单独的1.5 mL离心管中配制40 µL溶液，包含32 µL无核酸酶水、4 µL 10x DNase I反应缓冲液和4 µL DNase I酶。配制后将溶液置于冰上，待第7.3步使用时再加入柱中。

7. RNA 的洗涤与 DNase I 处理

  1. 用移液器将100 µL洗脱缓冲液1（W1）直接加入到含有已结合RNA的纯化柱中（来自步骤5.7）。
  2. 在8,000 × g条件下离心1分钟，并弃去穿流液。
  3. 将步骤6中的40 µL DNase I溶液直接加入到纯化柱中，在室温下孵育15分钟，以去除DNA污染。
  4. 向纯化柱中加入40 µL洗脱缓冲液1（W1），并在8,000 × g 条件下离心30秒。
  5. 向纯化柱中加入100 µL洗脱缓冲液2（W2），并在8,000 × g条件下离心1分钟。
  6. 再次向纯化柱中加入100 µL洗脱缓冲液2（W2），并在16,000 × g条件下离心2分钟。弃去穿流液。
  7. 将纯化柱在16,000 × g条件下离心1分钟，以干燥柱子。

8. 洗脱 RNA

  1. 为每次RNA提取准备一个0.5 mL离心管（试剂盒中提供），并做好相应标记。该离心管将用于盛放提取后的RNA。
  2. 将结合并洗涤了RNA的柱子转移至已标记的0.5 mL离心管中。柱子应牢固地卡入该管内。
  3. 从侧面观察离心管，将移液器吸头置于柱膜正上方，将11 µL洗脱缓冲液（EB）直接排加到柱子上，室温孵育1分钟。
    注意：若未将洗脱缓冲液（EB）直接分散加至柱子中心，会导致RNA得率降低。若观察到液体液滴出现在柱子边缘周围，表明洗脱缓冲液（EB）未正确分散。如出现此情况，建议使用步骤8.5的穿流液重复此步骤，并确保将洗脱缓冲液（EB）直接排加至柱子中心。
  4. 将装有柱子的0.5 mL离心管放入试剂盒提供的收集管中，以确保离心时位置合适（图2）。
  5. 先以1,000 × g离心1分钟，使洗脱缓冲液（EB）充分分布，随后以16,000 × g离心1分钟，以洗脱RNA。
  6. 立即把含有RNA的0.5 mL离心管置于冰上。

9. 使用微量分光光度计验证RNA的浓度和质量

注意：也可采用其他方法评估RNA的浓度和质量。此处使用微体积分光光度计进行检测。也可使用荧光计或微流控凝胶电泳设备29。

  1. 使用无尘布擦拭微量分光光度计的测量台，确保其表面无其他液体残留。
  2. 在分光光度计上选择 RNA 检测模式进行分析。
  3. 使用第8.3步中的洗脱缓冲液（EB）取1 µL作为空白样，对分光光度计进行校零。
  4. 校零后，用无尘布将测量台上的洗脱缓冲液（EB）擦拭干净。
  5. 保持含有RNA的0.5 mL离心管置于冰上，用移液器吸取1 µL RNA样品加至分光光度计的测量台上。放下分光光度计的检测臂，测量样品的吸光度，以定量并评估所提取RNA的质量。
    注意：有关下游应用可接受的RNA质量和数量的具体要求，请参见下文“结果”部分。

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结果

如上所述，本方案中的一个关键步骤是在向收集的缓步动物添加裂解缓冲液（XB）进行RNA提取之前，去除适量的水分。残留过多的水分会稀释裂解缓冲液（XB），导致RNA提取质量不佳（即RIN < 7，260/280比值 < 1.8，260/230比值 < 1.8，和/或浓度 < 5 ng/µL），从而在洗脱后降低RNA的浓度和质量。去除过多水分则会导致动物迅速脱水，可能引起死亡，并因死亡后RNase活性增加而降低RNA质量。本文提供了示意图，展示在添加裂解缓冲液（XB）之前，含有缓步动物的离心管中应保留的适当水量（图1B），以帮助本方案的成功实施。

迄今为止，本实验方案已在六种不同的缓步动物物种中进行尝试，包括一种异缓步类动物（五 celatus）。这些分离得到的RNA浓度范围为11 ng/µL 至 106.6 ng/µL （在微量分光光度计上确认） 表1）和 9 ng/µL 至 113 ng/µL （通过微流控凝胶电泳确认， 表 2

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讨论

本实验方案的目的是促进从缓步动物中分离出足量且高质量的RNA，以适用于后续研究缓步动物抗逆性的相关实验。本方案已指出用户在操作过程中可能遇到问题的环节，包括在加入裂解缓冲液（XB）前未充分去除水分（步骤2.5）、未能有效破坏缓步动物体壁（步骤3.1–3.3）、将上清液转移至纯化柱时操作不当（步骤5.3）以及RNA洗脱不充分（步骤8.3）。上述任一环节的操作失误均可能导致最终获得的RNA浓度或质量下降。若最终RNA浓度低于5 ng/μLµL （经微量分光光度计验证后），使用者可考虑使用（1）更多的起始动物样本重新进行RNA提取>100 用于小型物种或 >50，适用于较大物种），或（2）重复实验步骤，特别注意去除水分、缓步动物裂解及洗脱步骤。

本文提供了RNA质量评估（RIN、260/280比值、260/230比值）的示例，这些评估被认为适用于或不适用于RNA测序（表1、表2、图3）。偶尔，使用本方案进行RNA提取时会观察到较低（&#...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了北卡罗来纳大学阿什维尔分校的启动资金（资助CCH）以及美国国家科学基金会（NSF）授予Jason Pienaar（PK的博士后导师）的基金2225683的支持。我们感谢北卡罗来纳大学高通量测序中心提供的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管USA Scientific1615-5500Seal-Rite 1.5 mL 带刻度微量离心管，无色，聚丙烯材质，500 个/袋
70% 乙醇VWR71001-654用于清洁实验台面/设备
Arcturis PicoPure RNA 提取试剂盒FisherKIT0204本研究中所述 RNA 提取方案所需的全部组分试剂盒
离心机Eppendorf5405000441Eppendorf Centrifuge 5425，旋钮控制，非制冷型，配备 FA-24x2 转子，120 V/50-60 Hz（适用于美国）
Deer Park 纯净水任意杂货店N/A用于缓步动物培养的培养基，以及在 RNA 提取前冲洗缓步动物
解剖显微镜ZeissN/AZeiss Stemi 305，变倍比 5:1，总放大倍数 8x–40x，配备 M LED 透射照明装置
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I，无 RNase 活性（1 U/µL）
10 µL 滤芯吸头VWR76322-528任意品牌的滤芯吸头均可
1000 µL 滤芯吸头VWR76322-154任意品牌的滤芯吸头均可
20 µL 滤芯吸头VWR76322-134任意品牌的滤芯吸头均可
200 µL 滤芯吸头VWR76322-150任意品牌的滤芯吸头均可
玻璃毛细管Fisher50-821-811World Precision Instrument 标准玻璃毛细管 - 1B120-6（6 英寸，外径 1.2 mm，无内丝）。通过火焰拉制可形成两根末端变细的玻璃毛细管，再折断至合适直径，用于口吸移液操作以转移目标缓步动物物种。
加热金属块Eppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C，基础装置不含温控模块，100–130 V/50–60 Hz（适用于美国/日本/南美/中国台湾）
高灵敏度 RNA Screen Tape 梯度标准品Agilent5067-5581用于 TapeStation 系统对总 RNA 进行高灵敏度分析的梯度标准品
高灵敏度 RNA ScreenTapeAgilent5067-5579用于 TapeStation 系统对总 RNA 进行高灵敏度分析
高灵敏度 RNA ScreenTape 样品缓冲液Agilent5067-5580用于 TapeStation 系统对总 RNA 进行高灵敏度分析的缓冲液
微流控凝胶电泳系统AgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation 系统
微量分光光度计Fisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL，检测器类型：2048 元件 CMOS 线性图像传感器，显示屏：10 英寸高清彩色显示屏，语言：中文、英文、法文、日文、德文，光源：氙闪光灯，光谱带宽：≤1.8 nm（Hg 254 nm 处 FWHM），电压：12 VDC
口吸移液器Millipore SigmaA5177校准型微毛细管移液器用吸气管组件
无核酸酶水FisherFERR0581Thermo Scientific 无核酸酶水
移液器（2.5 µL、20 µL、200 µL 和 1000 µL）Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus，四件套
RNase AwayFisher21-402-178Thermo Scientific RNase AWAY 表面去污剂
无 RNase 管与研磨杵Fisher12-141-368用于 RNA 提取的无 RNase 管及研磨杵

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