基于IL-1β诱导软骨细胞模型中EREG介导机制的miR-215-5p作为骨关节炎诊断生物标志物的临床队列分析

摘要

本研究旨在评估血清miR-215-5p作为骨关节炎诊断生物标志物的价值，并探讨其在IL-1β诱导的软骨细胞中的调控机制。

摘要

骨关节炎（OA）是一种以关节软骨退化和滑膜炎性浸润为特征的退行性关节疾病。本研究旨在评估血清miR-215-5p作为OA诊断生物标志物的价值，并探讨其在IL-1β诱导的软骨细胞中的调控机制。共纳入110例OA患者和105名健康对照者。采用定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测血清中miR-215-5p和EREG的表达水平。通过受试者工作特征曲线（ROC曲线）评估miR-215-5p对OA的诊断价值。使用IL-1β刺激C28/I2软骨细胞构建OA细胞模型。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、Transwell实验和酶联免疫吸附测定（ELISA）分别评估细胞活力、迁移能力及炎症因子水平。通过双荧光素酶报告基因实验和RNA免疫沉淀（RIP）实验验证miR-215-5p与EREG之间的相互作用关系。结果显示，在OA患者中，血清miR-215-5p表达上调，而EREG表达下调。miR-215-5p对OA具有良好的诊断效能（曲线下面积，AUC = 0.883）。在白细胞介素-1β（IL-1β）处理的C28/I2细胞中，抑制miR-215-5p可增强细胞活力和迁移能力，并降低IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。EREG被证实是miR-215-5p的直接靶基因。EREG的敲低部分逆转了miR-215-5p下调对IL-1β处理的C28/I2细胞活力和迁移能力的促进作用，并减弱其对炎症因子的抑制效应。miR-215-5p通过调控EREG参与OA的发病过程，是一种有前景的OA诊断生物标志物和潜在治疗靶点。

引言

骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病，其病理特征表现为软骨退变伴随滑膜炎症^1,2。全球范围内，OA 的发病率居高不下，相关研究已报道其发病率呈逐年上升趋势^3,4。研究表明，肥胖、衰老、遗传易感性和骨密度等因素均与 OA 的发生发展相关⁵。在临床症状方面，OA 患者常表现为关节疼痛、肿胀、活动受限和僵硬，严重影响患者的生活质量^6,7。值得注意的是，OA 存在不同的表型，这些表型恰当地反映了该疾病发病机制的多样性⁸。目前，OA 的治疗仍以缓解症状为中心，常用的临床药物包括镇痛药和非甾体抗炎药，这些药物仅能缓解疼痛，无法有效逆转疾病的进展⁹。因此，探索新的 OA 生物标志物已成为当前研究的迫切需求。

microRNA（miRNA）是一类不参与蛋白质编码的短链RNA分子¹⁰。它们在多细胞生物中作为重要的基因调控分子，能够影响大量蛋白质编码基因的表达....

方案

本研究遵循赫尔辛基宣言的原则。研究开始前已获得仙游县总医院伦理委员会的批准（批准号：202514，2025年6月18日）。

方案的摘要见补充图1。

样本

共招募了在本院接受治疗的110名骨关节炎患者和105名健康对照者。骨关节炎组的纳入标准如下：根据美国风湿病学会制定的分类标准确诊为骨关节炎²⁰. 所有患者均接受X射线检查并进行Kellgren-Lawrence（K-L）影像学分级；入院前3个月内未接受抗生素治疗；临床资料完整；且所有患者均签署书面知情同意书。骨关节炎（OA）组的排除标准包括：已接受相关治疗或处于疾病终末期的患者；患有其他类型关节疾病（如痛风、类风湿性关节炎等）的患者；合并肿瘤、严重肝肾功能不全、自身免疫性疾病、感染性疾病、神经系统疾病或严重心肺疾病者；以及存在身体残疾、无法自理者。在入组时，记录所有受试者的基线资料，包括年龄、性别、体重指数（BMI）、吸烟史、饮酒史、家族史、病程、K-L分级、视觉模拟评分（VAS）、西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC）评分以及病变部位 位点。相关数据已进行分析和总结 表1所有受试者均在空腹状态下采集8 mL静脉血，于4 °....

结果

基线特征

对照组纳入105例患者，包括58例（55.24%）男性和47例（44.76%）女性，平均年龄为52.81 ± 12.57岁，BMI为24.25 ± 2.71 kg/m²。骨关节炎（OA）组包含110例患者，其中男性69例（62.73%），女性41例（37.27%），平均年龄为54.42 ± 12.33岁，BMI为24.88 ± 3.51 kg/m²。OA组的其他基线信息见表1。

OA 患者血清中 miR-215-5p 的表达特征及其诊断价值

OA 患者血清中 miR-215-5p 的表达水平上调（P < 0.001，图 1A）。通过 ROC 曲线分析进一步评估其诊断效能，结果显示曲线下面积（AUC）为 0.883（95% 可信区间（CI）= 0.840–.......

讨论

骨关节炎（OA）是临床常见的关节疾病，已成为继糖尿病和痴呆之后导致器质性残疾的第三大重要原因^22,23。然而，OA的发病机制复杂，其诊断常需结合临床症状、影像学检查等多种手段，漫长的诊断周期严重影响了患者的及时治疗²⁴。因此，临床上探索可用于OA诊断的生物标志物具有重要意义。

在本研究中，miR-215-5p 表现出高表达。该结果与熊等人的研究发现一致，他们在心肌细胞损伤模型中观察到 miR-215-5p 的表达升高，进一步佐证了本研究结果的可靠性²⁵。目前，关于 miR-215-5p 在骨关节炎（OA）中的临床研究相对较少。此外，本研究的分析显示，miR-215-5p 在该队列中具有良好的诊断效能。进一步地，miR-215-5p 与疾病持续时间及 K-L 分级密切相关，且是 OA 的独立危险因素。类似地，蔡等人的研究为此结论提供了有力支持。他们的研究表明，miR-141.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Corning/USA	3903
抗Ago2抗体	Abcam/USA	AB_867543 RRID: ab186733
抗IgG抗体	Abcam/USA	AB_10673832 RRID: ab133470
C28/I2软骨细胞	Merck Millipore/USA	SCC043
CCK-8试剂盒	碧云天/中国	C0038	细胞活力检测试剂盒
结晶紫	Sigma-Aldrich/USA	V5265
DMEM/F12培养基	Gibco/USA	11320033
双荧光素酶报告基因检测试剂盒	Promega/USA	E1910
EZ-Magna RIP试剂盒	Merck Millipore/USA	17701
FBS	Thermo Fisher Scientific/USA	26010074
甲醛	Sigma-Aldrich/USA	F8775
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software Inc. /USA	https://www.graphpad.com/features
IL-1β	Sigma-Aldrich/USA	SRP3083
IL-1β  ELISA试剂盒	南京建成/中国	H002-1-2
IL-6  ELISA试剂盒	南京建成/中国	H007-1-2
培养箱	Thermo Fisher Scientific/USA	BB150-2TCS-L
抑制剂-阴性对照	吉玛基因（定制合成）/中国	https://www.genepharma.com/
Light Cycler 480	Roche/瑞士	https://lifescience.roche.com/global/en/article-listing/article/lightcycler-480-system-technology.html	实时荧光定量PCR仪
Lipofectamine 3000	Invitrogen/USA	L3000015	用于细胞转染的转染试剂
酶标仪	Thermo Fisher Scientific/USA	VA000010C
显微镜	Nikon/日本	https://www.nikon.com.cn/sc_CN/
模拟物-阴性对照	吉玛基因（定制合成）/中国	https://www.genepharma.com/
miR-215-5p抑制剂	吉玛基因（定制合成）/中国	https://www.genepharma.com/
miR-215-5p模拟物	吉玛基因（定制合成）/中国	https://www.genepharma.com/
Opti-MEM	Gibco/USA	31985070
pGL3载体	Promega/USA	E1751
PrimeScript逆转录酶	Takara/日本	2680	逆转录试剂盒
Si-EREG	吉玛基因（定制合成）/中国	https://www.genepharma.com/
Si-NC	吉玛基因（定制合成）/中国	https://www.genepharma.com/
SPSS 24.0	IBM Corp/USA	https://spssau.com/index.html
SYBR Green Supermix	Bio-Rad/USA	1725121
TNF-α  ELISA试剂盒	南京建成/中国	H052-1-2
Transwell小室	Corning/USA	3422
TRIzol试剂	Thermo Fisher Scientific/USA	15596026	RNA提取试剂