本研究旨在探讨丁香酚（EUG）与瑞格列奈（RPG）在2型糖尿病（T2DM）患者中潜在的药物相互作用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本研究旨在探讨丁香酚（EUG）与瑞格列奈（RPG）在2型糖尿病（T2DM）患者中潜在的药物相互作用。
本研究探讨了丁香酚（EUG）与瑞格列奈（RPG）在2型糖尿病（T2DM）中的潜在药物相互作用（DDI）。 采用高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）建立2型糖尿病（T2DM）大鼠模型。单剂量组给予0.4 mg/kg的RPG；联合给药组在给予单剂量RPG（0.4 mg/kg）前，先以EUG（50、100、150 mg/kg）预处理7天。采集大鼠血浆样本，测定RPG的血糖水平及药代动力学参数。在大鼠肝微粒体（RLM）中评估EUG对RPG代谢稳定性及细胞色素P3A（CYP3A）活性的影响。 在2型糖尿病大鼠中，RPG治疗显示出降血糖作用，而EUG的联合给药以剂量依赖性方式进一步增强了该效应（p < 0.001）。EUG联合给药通过增加曲线下面积（AUC，较单用RPG分别增加88.64%、164.59%和244.72%）影响RPG的药代动力学， p < 0.001），血浆最大浓度（C最大值，相较于单独使用RPG，分别增加了18.61%、53.58%和77.63% p < 0.01)，最大浓度（T最大值，EUG联合给药时为1.0小时，单用RPG时为0.5小时），半衰期（t1/2，与单次RPG相比，分别延长了33.86%、49.61%和88.19% p < 0.01），平均滞留时间（MRT，延长17.62%、26.42%、44.04%，相较于单用RPG） p < 0.001），并降低了清除率（Clz/F，与单用RPG相比分别降低48.92%、63.31%和74.10%） p < 以剂量依赖的方式（P = 0.001）。 体外 RLM 研究表明，丁香酚（EUG）通过延长 RPG 的半衰期（44.09 ± 3.25 分钟）和降低其固有清除率（30.55 ± 3.69 µL/min/mg 蛋白质），提高了 RPG 的代谢稳定性。此外，EUG 还抑制 CYP3A 的活性，其 IC50 7.90 ± 1.79 µM。 EUG与RPG合用可通过提高T2DM大鼠体内RPG的系统暴露量，增强RPG的代谢稳定性并抑制CYP3A活性，从而增强RPG的降血糖作用。
2型糖尿病（T2DM）是一种慢性代谢性疾病，其特征为胰岛素抵抗或胰岛素作用效率降低，影响全球数以百万计的个体1。T2DM涉及遗传易感性与生活方式因素之间的复杂相互作用，导致葡萄糖摄取受损、肝脏糖异生过度以及慢性低度炎症2。若治疗不当，T2DM可引发严重并发症，包括心血管疾病、肾病、视网膜病变和神经病变，显著影响患者生活质量并增加死亡率2。目前T2DM的药物治疗包括二甲双胍、磺脲类药物、GLP-1受体激动剂和DPP-4抑制剂等3。瑞格列奈（RPG）是一种短效的格列奈类药物，通过刺激胰岛素分泌发挥作用，具有剂量灵活的特点4。与磺脲类药物相比，格列奈类药物对餐后高血糖的控制更优，降低某些不良反应（如低血糖）的风险，并具有更良好的安全性，尤其适用于肾功能不全患者5,6。RPG在口服后迅速吸收，通常在30–60分钟内达到血浆峰浓度，其半衰期短，导致胰岛素释放的刺激时间较短暂。临床上，RPG可作为单药治疗，也可与其他口服降糖药物联合使用，以优化血糖控制7。然而，其临床应用受限于较低的口服生物利用度（约56%）、肝脏快速代谢以及潜在的低血糖风险8,9,10,11,12,13,14。这些局限性凸显了制定综合治疗策略的必要性。
丁香酚（EUG），化学名称为4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，是一种化学式为C10H12O215的有机化合物。EUG为无色至淡黄色液体，是一种主要存在于丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）及其他芳香植物中的活性酚类化合物16。由于EUG具有多种药理特性，包括抗氧化、抗炎、抗菌、镇痛和抗肿瘤活性，已引起广泛关注17,18,19。近期研究表明，EUG在2型糖尿病（T2DM）的辅助治疗中展现出潜在价值，体外（in vitro）和体内（in vivo）实验证据均表明，EUG可改善胰岛素敏感性，促进外周组织对葡萄糖的摄取，抑制肝脏糖异生，并保护胰腺β细胞功能20,21。这些多方面的效应，结合其相对较低的毒性22，使EUG成为一种极具前景的天然候选药物，可通过协同机制弥补传统临床药物的不足，并缓解与T2DM相关的并发症。
细胞色素P450酶（P450s）在药物代谢过程中发挥关键作用，并通过诱导或抑制特定亚型介导药物-药物相互作用（DDIs），这对安全有效的药物治疗至关重要23值得注意的是，RPG 主要通过肝脏中的 CYP2C8 和 CYP3A4 代谢。24,25与槲皮素（QCT）联合使用时，QCT可增强 体内 通过抑制肝脏首过效应和系统代谢提高RPG的生物利用度 通过 CYP450s26已有报道称，丁香酚以浓度依赖性方式抑制CYP450酶系（包括1A2、2C9、2D6和3A4）的活性，提示当丁香酚与经由这些酶代谢的药物联合使用时可能存在潜在的相互作用。27尽管 Eugenol（EUG）作为 2 型糖尿病（T2DM）辅助治疗药物具有潜在应用前景，且已知瑞格列奈（RPG）易受细胞色素 P450（CYP）介导的药物相互作用（DDI）影响，但目前尚不清楚 EUG 是否会改变 RPG 的全身暴露水平、代谢稳定性或 CYP3A 介导的代谢过程。鉴于在临床实践或膳食补充剂使用中，EUG 与 RPG 很可能被联合使用，二者之间缺乏 DDI 数据可能带来 RPG 血浆浓度意外改变的潜在风险。此类浓度变化可能导致治疗效果降低或低血糖风险增加。因此，这一证据空白构成了天然产物与传统降糖药物合理、安全联用的重要障碍。因此，系统评估 EUG 对 RPG 药代动力学和药效学的影响，并阐明其潜在代谢机制（特别是对 CYP3A 活性的影响）至关重要。基于上述证据，可推测 EUG 可能通过调节 CYP450 活性影响 RPG 的代谢。本研究是首次在 T2DM 情境下探讨 EUG 与 RPG 相互作用的研究。研究结果有望填补关键知识空白，并为优化 EUG 与 RPG 在 T2DM 管理中的安全联用提供机制依据。若考虑联合使用，应考虑 RPG 暴露量增加的可能性，并监测低血糖征象，尤其是在高剂量使用 EUG 或将其作为浓缩补充剂摄入时。此外，尽管大鼠表达的功能性 CYP3A 亚型与人类 CYP3A4 具有相似功能，但由于物种间酶表达水平和催化活性存在差异，将定量研究结果直接外推至人类时需谨慎。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究经吉林省科学院批准 中国医学科学伦理委员会（日期：2024.11.21/编号：2024112），符合ARRIVE指南要求28. 所使用的试剂和设备列于下文 材料表.
1. 动物饲养条件
雄性Sprague-Dawley大鼠（200–250 g）饲养在实验动物房中，环境条件如下：温度：22 °C ± 2 °C，相对湿度：40–60%，12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄食和饮水，适应环境一周时间29,30。
2. 动物模型构建、处理与样本处理
样本量根据F检验的效能分析（G*Power 3.1.9.7）确定。预先进行的效能分析设定效应量为0.6，α水平为0.05，期望的统计效能为0.8，计算得出总样本量为55。该结果表明每组至少需要9只大鼠。因此，每组使用了10只大鼠，实际达到的统计效能为0.86。
在建立2型糖尿病（T2DM）模型之前，所有大鼠均禁食12小时。随后将它们随机分为两组：对照组（n = 10）和T2DM组（n = 50）。T2DM大鼠模型的建立参照先前报道的方法31进行。简言之，T2DM组大鼠连续4周饲以高脂饮食（脂肪含量为60%），随后单次腹腔注射30 mg/kg的链脲佐菌素（STZ），该溶液溶于无菌柠檬酸缓冲液（pH 4.4）中。STZ注射3天后，使用血糖仪测定大鼠尾静脉血糖水平，若血糖浓度超过16.7 mmol/L，则判定为T2DM模型建立成功。对照组大鼠则给予普通饮食，并在与T2DM组相同的时间点腹腔注射0.9%生理盐水。
T2DM大鼠进一步分为四组，每组10只：T2DM + RPG组（单用RPG）、T2DM + RPG + EUG（50 mg/kg）组（联合RPG+EUG 50 mg/kg）、T2DM + RPG + EUG（100 mg/kg）组（联合RPG+EUG 100 mg/kg）和T2DM + RPG + EUG（150 mg/kg）组（联合RPG+EUG 150 mg/kg）。禁食12小时后，单用RPG组大鼠经口给予0.4 mg/kg RPG（溶于生理盐水中） 通过 灌胃针26联合给药组大鼠分别于每日口服50、100和150 mg/kg丁香酚（EUG），连续给药7天；第8天在额外禁食12小时后，联合给药组 дополнительно给予0.4 mg/kg利匹吉兰（RPG） 通过 经口胃灌注。随后，通过尾静脉采集的血液样本检测血糖参数。
进行药代动力学分析时，在给药后的不同时间点（0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h 和 8 h），从小鼠眼后静脉丛采集血液样本（0.2 mL）至含肝素的微量离心管中。采集后，样本经离心（1500 × g，10 min，4 °C）分离血浆（淡黄色、澄清），并将血浆储存于 -80 °C，待后续分析。随后采用第4步所述的高效液相色谱法（HPLC）测定血浆样本中RPG的浓度。
3. 大鼠肝微粒体混合物中的代谢研究
探究潜在机制 体内 药代动力学变化，评估了丁香酚（EUG）对利培酮（RPG）代谢稳定性及CYP3A活性的影响。在37 °C条件下，将RPG（3 µM）在PBS缓冲液中与或不与EUG共同孵育，总体积为200 µL，包含大鼠肝微粒体（RLM）（0.5 mg/mL微粒体蛋白）和NADPH再生系统（1.3 mM NADP、3.54 mM葡萄糖-6-磷酸、0.4 U/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和3.3 mM MgCl₂）2）。在37 °C下预孵育5分钟（不加NADPH）后，通过加入NADPH再生系统启动反应。随后将混合物置于摇动水浴中，在37 °C下孵育。在不同的孵育时间点（0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟）取30 µL样品，转移至含有冰冻乙腈的微量离心管中以终止反应。样品经离心（12000 × g 在4 °C下离心10分钟，以获得上清液（澄清）。随后采用步骤4中详述的相同HPLC方法对所得上清液进行RPG浓度分析。
4. 高效液相色谱分析
采用 Kim 等人报道的高效液相色谱法（HPLC）分析血浆（步骤 2）和微粒体孵育液（步骤 3）中的 RPG 浓度26。具体操作步骤如下：取样品 120 µL，加入含酮康唑（内标物，100 ng/mL）的乙腈 300 µL，以实现蛋白沉淀。随后，将混合物涡旋混匀，并在 4 °C 条件下以 15000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至微柱离心管中，在氮气氛围下 25 °C 挥干。干燥后的残渣用 50 µL 流动相重新溶解，再经涡旋混匀和离心处理。随后，取 40 µL 上清液注入 HPLC 色谱柱（250 mm × 4.6 mm，粒径 5 µm）。色谱柱在 25 °C 下采用等度洗脱模式，流动相为 10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 6.0）与乙腈（体积比 46.4 : 53.6），流速为 1 mL/min。使用荧光检测器监测洗脱液，激发波长为 240 nm。
5. 统计分析
采用药代动力学分析软件计算药代动力学参数，包括AUC、Cmax、Tmax、t1/2、MRT和清除率。使用统计分析与绘图软件进行图表绘制和数据分析。所有数据均以均值±标准差表示。组间差异根据情况采用单因素方差分析（用于血糖水平比较）或双因素方差分析（用于药代动力学参数比较），随后进行Tukey事后检验以进行多重比较。EUG对CYP3A活性的影响采用非线性回归分析进行评估。以p值<0.05为差异具有统计学意义。
在大鼠肝微粒体中，EUG 在 RPG 代谢稳定性中的半衰期通过以下公式计算：
t1/2 (min) = 0.693/ln(Ct/C0 × 100)。
内在清除率（µL/min/mg 蛋白质）= v × 0.693/t1/2；
v（µL/mg）= 孵育体积 / 蛋白质浓度。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
EUG 增强了 RPG 在 2 型糖尿病大鼠中的降血糖作用
与对照组相比，2 型糖尿病（T2DM）模型组大鼠的血糖水平显著升高（p < 0.001，95% CI：-13.90 ~ -11.32），表明 T2DM 模型构建成功（图 1A）。单独给予 RPG 可显著降低 T2DM 大鼠的血糖水平（p < 0.001，95% CI：5.26 ~ 7.84）。与单独给予 RPG 的 T2DM 大鼠相比，RPG 与 EUG 联合给药可进一步以 EUG 剂量依赖性方式降低血糖水平（p < 0.001，EUG 50 mg 组 95% CI：2.01 ~ 4.59；EUG 100 mg 组 95% CI：4.12 ~ 6.70；EUG 150 mg 组 95% CI：5.12 ~ 47.70）（图 1B）。
EUG 提高了 T2DM 大鼠中 RPG 的...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
2型糖尿病（T2DM）是一种需要长期治疗的慢性代谢性疾病，患者常因合并心血管疾病和肾脏疾病等基础疾病而需同时服用多种药物32。联合用药显著增加了药物相互作用（DDI）的风险，因其可能影响降糖药物的吸收、代谢或疗效，从而导致低血糖昏迷、血糖水平失控等急性风险33。此外，还可能加重器官损伤，加速并发症的进展34。因此，DDI评估不仅是避免不良反应、维持T2DM患者血糖稳定的前提，也是降低并发症发生率、改善患者长期预后的重要手段，凸显了DDI评估在保障联合用药安全性中的关键作用。
STZ 常用于诱导 2 型糖尿病动物模型，因其可靶向胰腺 β 细胞 通过 葡萄糖转运蛋白2将亚硝基脲基团释放，该基团产生自由基，损伤β细胞的DNA，耗竭能量，促进β细胞凋亡，导致胰岛素分泌不足，进而引发2型糖尿病35既往研究已探讨了STZ诱导的2型糖尿病（T2DM）中的药物相互作用（DDI）...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者对本文讨论的任何材料均无财务或所有权利益。
本研究由“通眩针刺联合前庭康复训练治疗前庭性偏头痛的临床研究（2018187）”和“基于生物信息学技术的黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选及网络药理学分析（YDZJ202301ZYTS121）”资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Merck, Germany | 34851 | ≥99.9% |
| 色谱柱 | Phenomenex, USA | 00G-4041-E0 | 250 mm × 4.6 mm，粒径 5 μm |
| DAS | 北京博智源，中国 | - | 3.0 |
| EUG | MUST 生物技术，中国 | A0074 | 纯度 ≥99% |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | - | 9.0.0 |
| 高效液相色谱 | 岛津公司，日本 | 228-45147-42 | RF-20A |
| 酮康唑 | Merck, Germany | K1003 | 纯度 99.0–101.0% |
| 雄性 Sprague-Dawley 大鼠 | 上海实验动物中心，中国 | - | 200–250 g |
| NADPH | Merck, Germany | 10107824001 | 97%（干重） |
| OneTouch Ultra2 血糖仪 | Life Scan Inc., USA | https://shop.onetouch.com/onetouch-sup-reg-sup-ultra-sup-reg-sup-2-meter/product/OTSUS05_0019 | - |
| PBS | Merck, Germany | P4474 | pH 7.4 |
| RLM | Merck, Germany | M9066 | - |
| RPG | Merck, Germany | R9028 | 纯度 ≥98% |
| STZ | Merck, Germany | S0130 | ≥98%（HPLC） |
| EUG，丁香酚；RPG，瑞格列奈；RLM，大鼠肝微粒体；NADPH，β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；STZ，链脲佐菌素；PBS，磷酸盐缓冲液。 |