用于大鼠颈椎病的针刀治疗：一种可视化建模与干预操作方案

摘要

本研究详细描述了一种大鼠颈椎病的建模方法及针刀干预策略，为相关研究提供了可视化的操作流程。

摘要

颈椎病（CS）是一种慢性退行性疾病。颈椎间盘的退行性改变及其继发的病理性变化会影响周围组织和结构，导致颈部疼痛、僵硬、活动受限，以及上肢偶尔出现麻木和放射性症状等临床表现。其中，神经根受压最为常见。因此，本研究建立了由颈神经根受压诱导的大鼠CS模型。针刀治疗在临床CS治疗中显示出一定潜力，可通过松解局部软组织粘连、减轻神经压迫发挥作用。然而，目前在动物实验中尚缺乏可视化的操作流程。本研究提供了一种可靠的大鼠CS模型建立方法及相应的针刀干预方案的详细描述。在该操作中，我们详述了模型诱导过程、针刀操作步骤、治疗定位、大鼠固定技术及关键注意事项。此外，本研究采用肌电图（EMG）确认CS模型建立成功，并通过机械缩足阈值、步态分析和神经根组织病理学评估干预效果。该研究不仅为CS大鼠模型的建立和针刀干预提供了参考，也为未来探索其作用机制的研究提供了系统且可行的实验框架。

引言

颈椎病（CS）是一种常见的退行性脊柱疾病。其核心病理过程起源于椎间盘的退变，进而引发一系列继发性病理改变，包括椎间隙狭窄、骨赘形成和韧带肥厚^1,2。这些病理改变导致多种临床症状，如颈肩部酸痛以及上肢放射性麻木。在严重情况下，可能出现神经功能障碍，包括运动功能障碍甚至四肢瘫痪^2,3。值得注意的是，近年来颈椎病的发病率逐渐升高，且发病年龄趋于年轻化，给社会和经济带来沉重负担⁴。颈椎间盘退变及骨赘增生可能累及邻近的骨性和软组织结构，导致颈椎管或椎间孔狭窄，进而压迫邻近结构，包括颈神经根、脊髓和椎动脉^1,2,3,4。其中，颈神经根受压最为常见，约占所有颈椎病病例的60%–70%^5,6,7。尽管临床上有多种治疗手段可供选择，包括物理治疗、药物干预和手术治疗，但由于手术治疗费用高、创伤大且术后效果不确定，非手术治疗已成为大多数患者的首选方案⁴。在现代临床实践中，非甾体抗炎药和神经营养药物常被使用。尽管这些药物可在一定程度上缓解疼痛并延缓疾病进展，但同时也伴随消化系统损伤和肾功能损害等不良反应^8,9。

针刀疗法是在传统中医针灸理论基础上，结合现代微创外科技术发展而成的一种特色治疗手段。其通过松解软组织粘连、调节局部炎性因子以及改善区域微循环来发挥治疗作用^10,11,12。近年来，针刀治疗颈椎病的临床疗效已得到广泛认可，在缓解神经压迫、减轻疼痛及改善颈椎运动功能方面展现出良好潜力^13,14。然而，在动物实验中应用针刀干预时，仍面临定位不精确、操作深度难以控制等挑战。同时，为了将这些临床观察转化为可靠的循证结论，建立稳定且可重复的动物模型是必不可少的前提条件。椎间尼龙线结扎法通过将尼龙线植入椎间孔，产生直接的机械压迫，从而精确模拟临床神经根受压的病理生理过程¹⁵。该建模方法还具有建模周期短、压迫节段可控等优势¹⁵。然而，该手术操作在很大程度上依赖于个人经验，目前尚缺乏详细、可视化的操作描述。

本研究提供了一套完整、详细且可视化的实验方案，涵盖颈椎病大鼠模型的建立以及针刀干预的全部操作过程。由于麻醉剂可能影响机械缩足阈值的测量，进而干扰实验结果^16,17,18,19，本研究采用了专用的大鼠固定装置。本文详细描述了大鼠模型的制备过程、分步针刀操作、治疗位点的精确定位、大鼠固定与约束的方法以及其他关键实验注意事项。研究采用了多种评估维度，包括机械缩足阈值测定、电生理记录、步态分析以及神经根组织病理学观察。本研究旨在为颈椎病大鼠模型的建模及针刀干预提供可视化操作流程，从而为针刀治疗颈椎病的作用机制研究及疗效评价提供方法学支持。

方案

所有实验操作均经过北京迈迪康生物科技有限公司实验动物伦理委员会审查、批准并严格监督（批准编号：MDKN-2025-096）。所有实验方案均严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理与使用指南》。本研究中使用的主要试剂与仪器列于材料表中。

1. 实验动物与分组

1. 选择体重为230.0 g的成年雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠 ± 20 g，用于纳入实验。
2. 将动物饲养在专用的实验动物设施中。
3. 保持环境温度在 24 °C ± 2 °C 50%–60% 相对湿度，12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下饲养。提供 随意摄取 在整个研究期间可自由获取标准饲料和水。
4. 经过7天的适应性饲养后，将24只大鼠随机分为四组（每组n = 6）：正常对照组（Control）、假手术组（Sham）、慢性应激模型组（Model）和针刀组。实验设计的时间线如图所示 图1.

2. 慢性应激模型的建立

注意：建模前 12 小时对所有大鼠禁食禁水。称重并记录体重。所有手术器械均需经高压蒸汽灭菌（图 2A）。

1. 手术前一天准备尼龙线，将其切成直径为0.5 mm、长度约1 cm的段。将纤维段浸入75%乙醇中4 h，在无菌条件下干燥，然后置于0.1%多聚-L-赖氨酸溶液中浸泡8 h，以增强组织黏附性。
2. 将大鼠放入诱导室，使用4%异氟烷诱导麻醉，随后以1.5%–2.0%异氟烷维持麻醉 通过 口罩。将动物以俯卧位固定（遵循机构批准的方案）。
3. 剃除背部颈区毛发以充分暴露手术区域。使用聚维酮碘由内向外对手术区域消毒三次，再用75%乙醇重复消毒程序。
4. 触诊并标记大鼠背部最高的棘突（T2）。从T2棘突顶点开始，沿背侧中线做一条长约3 cm的皮肤切口，向前（头侧）延伸。钝性分离皮下组织和颈后部肌肉（图2B).
5. 完全暴露从C5到T1的左侧椎弓，并彻底刮除覆盖的肌肉和结缔组织（图2C).
6. 使用显微镊子轻轻分离C6–C7和C7–T1椎间隙处的黄韧带及结缔组织。用蚊式钳打开C7左侧椎弓，以暴露脊髓。
7. 使用眼科神经剥离器将脊髓轻柔地向右侧牵拉。用显微外科镊将已灭菌的尼龙线沿脊髓纵轴置于C6–C7和C7–T1神经根下方，避免过度压迫，以防损伤椎静脉。
   注意：在假手术组中，在相同的解剖位置暴露脊髓，但不插入尼龙线。
8. 手术完成后，逐层关闭并缝合切口。
9. 将大鼠转移至恒温加热垫上，温度维持在 37 °C并监测生命体征直至意识完全恢复。
10. 向后肢肌肉注射50,000单位青霉素钠溶液，用于术后抗感染预防。将动物放回原饲养笼中进行术后恢复。

3. 制动操作步骤

1. 将大鼠固定在黑色束缚网套中。
2. 将两条尼龙扎带固定在塑料框架上。将上方的扎带固定在腋部区域，下方的扎带固定在骨盆区域（图3B）。
   注意：使用一块尺寸为 200 mm × 300 mm × 5 mm 的塑料板，其长边每隔 10 mm 设有 20 mm × 4 mm 的孔槽，短边每隔 3 mm 设有相同尺寸的孔槽，并在中心和四个角配有五个支撑脚（图3A）。
3. 造模后，对各组大鼠连续三天重复上述束缚操作，以确保充分适应。每次束缚时间至少维持 5 分钟。

4. 针刀治疗

1. 开始在第4个部位进行针刀干预^th 模型建立后的第1天
2. 准备一次性无菌针刀针（直径：0.40 mm；长度：40 mm）。
3. 去除颈部区域的毛发，以充分暴露手术视野。
4. 触诊颈椎棘突两侧的软组织，以识别硬结样结节或条索状结构。确定C6或C7的一个棘突中点，然后在其左右两侧各约0.5 cm处分别定位另外两个点。
5. 将这三个位点指定为针刀插入点并进行标记（图3C).
6. 用医用聚维酮碘对标记的穿刺部位进行消毒，随后使用75%医用乙醇。
7. 将针刀的刃口方向与后正中线平行，在进针过程中保持针体垂直于颈椎后部冠状面。
8. 用左手拇指在穿刺部位施加轻柔按压，同时用右手拇指和食指稳定持握针刀。垂直快速穿透皮下组织，然后缓慢推进针刀，直至到达骨面。
9. 在病灶区域内进行三次局部纵向切开和两次横向软组织松解，手术范围限制在1 mm以内。操作完成后退出针具。图3D).
10. 在穿刺部位施加牢固压力3分钟以达到止血。每隔5天进行一次针刀干预，共进行三次。
    注意：除针刀组外，其余三组不接受任何治疗干预。但这些组的动物以与针刀组相同的方式和相同的时间长度进行固定。

5. 机械缩足阈值（MWT）测试

注意：在模型建立手术前一天进行测量，第3天^rd 天，以及第14^th 术后第1天，使用大鼠和小鼠足底机械痛觉刺激仪进行检测。

1. 将每只大鼠放入一个透明的测试箱中，测试箱置于金属网地板上，环境安静，温度维持在 24 °C ± 2 °C。
2. 让大鼠在测试箱内适应至少 5 分钟，或直至探索行为和理毛行为基本消失。
3. 将 von Frey 纤维丝的尖端垂直置于左侧前爪掌面第三和第四掌骨之间，从金属网下方施加刺激，直至出现明显的抬爪、舔舐或抖动反应。
4. 记录出现抬爪反应时仪器显示的数值，作为机械痛阈值。
5. 每只大鼠测试结束后，用 75% 医用酒精彻底擦拭金属网地板及测试箱内壁，再用洁净纱布擦干，以消除可能影响后续行为测试的残留气味。待仪器完全干燥后，方可放入下一只大鼠。
   ​注意：所有大鼠应按轮换顺序依次测试三轮。同一只大鼠两次 MWT 测量之间应至少间隔 10 分钟。每只大鼠的最终 MWT 值取三次测量的平均值。

6. 肌电图（EMG）记录

注意：在建模后第3天，使用生物信号采集与分析系统进行静息态肌电图检测。

1. 通过吸入异氟烷麻醉大鼠（诱导浓度为3%–4%，维持浓度为1.5%–2.0%）。将动物俯卧位固定于实验平台上，并充分暴露左侧前肢。
2. 将记录电极的导线连接至指定的数据采集通道。启动采集软件，选择EMG信号模式，并将采样频率设置为20 kHz，带通滤波范围设为15 Hz–5 kHz。
3. 使用浸有75%医用乙醇的脱脂棉球对左侧前肢肌肉（桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、肱二头肌和肱三头肌）进行消毒。
4. 将针式记录电极垂直插入肌腹，方向与肌纤维走向正交。在距离该电极3–5 mm处插入另一根针电极作为参考电极，并将接地电极插入尾部基底。
5. 针电极插入后立即观察插入电位活动。待插入电位消失且肌肉完全放松后，每只大鼠记录1分钟静息状态下的肌电图信号。
   注意：整个记录过程中应保持环境安静，并尽量减少外界电磁干扰。常见干扰包括交流电引起的工频干扰和其他实验设备产生的高频噪声，这些干扰在肌电图上表现为叠加的规则正弦波。可通过接地、滤波设置和环境管理来降低此类干扰。
6. 小心拔出所有针电极，将大鼠放回饲养笼，使其从麻醉状态自然恢复。
7. 每只大鼠完成肌电图记录后，使用浸有75%医用乙醇的脱脂棉球清洁针电极，并用无菌纱布彻底擦干，以防止交叉污染。

7. 大鼠步态分析

注意：在完成针刀干预后的第一天（模型手术后第15天）进行步态分析。步态分析系统由配备透明跑带的跑步机、置于跑带下方的高速数字摄像机以及计算机工作站组成。

1. 将大鼠放置于跑台轨道上，自由适应3分钟。
2. 启动跑带，逐渐将速度从5.0 cm/s增加，直至大鼠表现出稳定的步态且无探索行为。​
3. 使用高速摄像机采集大鼠10秒的腹面（底部视角）行走视频。
4. 每只大鼠测试结束后，用75%乙醇彻底擦拭跑带和测试舱室，以消除可能影响后续行为评估的残留气味。在放入下一只大鼠前，确保跑带完全干燥。
5. 将录制的视频导入分析软件，利用软件识别各肢体的足部着地位置，并提取一系列步态参数。
6. 完成自动分析后，导出步态参数数据以供后续统计分析。
7. 本研究包含以下步态参数：左前爪平均印迹面积（整个支撑相中足印大小的平均值）、左前爪最大支撑面积（整个支撑相中足印的最大尺寸）以及左前爪支撑压强（反映步态分析系统记录的支撑阶段中足压的相对强度）。
   ​注意：每只大鼠采集三个有效的步态序列，分析时采用三次测量值的平均值。

8. 神经根组织的苏木精-伊红染色

注意：在模型手术后第15天进行行为学测试后，收集神经根组织样本进行苏木精-伊红染色（HE染色）。

1. 通过腹腔注射 2% 戊巴比妥钠（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，并进行经心脏灌注多聚甲醛。
2. 解剖 C6–T1 脊神经根，将组织浸入 4% 多聚甲醛中，在 4 °C 下后固定 48 小时。
   注意：操作多聚甲醛时应视其为刺激性物质，在通风良好的环境或化学通风橱中进行处理。
3. 用流动自来水冲洗固定后的神经根组织 1 小时，以去除残留的固定剂。
4. 将组织依次进行梯度乙醇脱水，再经二甲苯（I）和二甲苯（II）透明，石蜡包埋，并切成 3–5 µm 厚的切片。将切片在 65 °C 下烘烤。
5. 将切片依次在二甲苯（I）和二甲苯（II）中脱蜡，每次 8 分钟。通过梯度乙醇系列（100% 乙醇 15 分钟、95% 乙醇 5 分钟、80% 乙醇 5 分钟、70% 乙醇 3 分钟）进行水化，然后在蒸馏水中浸泡 2 分钟。
6. 用苏木精溶液染色 5 秒，然后用流水冲洗 2 分钟以去除多余染液。
7. 在蒸馏水中分化 30 秒。将切片依次浸入 70% 乙醇 10 秒，再浸入 80% 乙醇 10 秒。
8. 用伊红溶液染色 4 分钟，然后用流水冲洗以去除表面染料。通过梯度乙醇脱水（70% 乙醇 10 秒、80% 乙醇 10 秒、95% 乙醇 10 秒、100% 乙醇 160 秒），再在二甲苯中透明 4 分钟。
9. 用中性树胶封片。
10. 在光学显微镜下以 400× 放大倍数观察脊神经根组织的病理学和形态学改变，并从代表性目标区域采集显微图像。

9. 统计分析

1. 使用 SPSS 软件进行统计分析。符合正态分布的连续变量以均值 ± 标准差表示。
2. 在满足正态性和方差齐性的前提下，采用重复测量方差分析法分析机械缩足阈值，采用单因素方差分析法分析步态参数。组间事后两两比较采用最小显著性差异（LSD）检验。
3. 若数据不满足正态分布或方差齐性假设，则采用非参数检验。
4. 以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。

结果

机械缩足阈值（MWT）评估显示，造模前各组间的基线值具有可比性。造模和假手术后第3天，假手术组与对照组之间无显著差异（p > 0.05）。相比之下，模型组和针刀组的MWT均较假手术组显著降低（p < 0.01，图4）。治疗结束后，针刀组的MWT较模型组显著升高（p < 0.05，图4）。

肌电图（EMG）记录显示，在第3天^rd 造模与假手术后的次日，在模型组和针刀组的静息针电极肌电图中可检测到异常自发电位活动，如纤颤电位和正锐波。相比之下，对照组和假手术组的静息针电极肌电图中未观察到异常自发放电现象。图5). 如果患侧未出现异常的自发电位，提示模型可能未成功损伤目标神经根，需重新检查手术操作。

步态分析显示，治疗结束后，假手术组的平均足迹面积、最大支撑面积和支撑期压力与对照组...

讨论

选择合适的动物模型是阐明颈椎病（CS）发病机制并严格评估治疗干预措施的前提。目前，椎体内尼龙缝线法因其相对简便、造模周期短以及高重复性和可靠性而被广泛采用^15,20。该方法通过将致压材料植入大鼠脊髓腔内，对颈段脊神经根施加持续性压迫，从而模拟临床上因椎间盘突出或骨赘增生所导致的神经根受压病理状态。在颈椎病相关的继发性损伤中，神经根受压最为常见，并是引起显著临床表现的主要原因，通常表现为颈部疼痛、僵硬以及上肢放射性症状^5,7,21。因此，本研究采用椎体内尼龙缝线法建立大鼠颈椎病模型，并提供了该模型建立及针刀干预的可视化操作流程。

神经根受压后，局部缺血、炎症反应和机械性刺激可能引发外周和中枢敏化，最终导致痛觉过敏²²

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL 注射器	河北云盛生物科技有限公司	SN-04442
1 mL 注射器	上海知誉医疗器械有限公司	ZSQ-1
4-0 带针缝合线，单臂（4×12）	GLASS	JZZSX193
75% 酒精	山东安捷高科消毒科技有限公司	75-500ml
针刀针	北京华夏蓝筹生物科技有限公司	HY0440
防脱载玻片	CITOTEST	188105
生物信号采集与分析系统	Techman	BL-420N
生物信号采集与分析系统（软件）	Techman	BL-420N 版本 3.0.0.237
盖玻片	赛拓斯实验器材制造有限公司	10212432C
脱水机	DIAPATH	Donatello
电子天平	梅特勒-托利多	ME203E/02
电热鼓风干燥箱	Labotery	GEL-70
包埋机	武汉俊杰电子有限公司	JB-P5
环保型脱蜡透明液	Servicebio	G1128-1L
防静电黑色不锈钢镊子（弯头）	solomen	ESD-15
乙醇	SCRC	100092683
无脂棉球	曹县华鲁卫生材料有限公司	TZMQ-500
苏木精-伊红（HE）HD恒染试剂盒	Servicebio	G1076
止血钳	solomen	B0557
IBM SPSS Statistics	IBM Corporation	版本 22.0
成像系统	Nikon	NIKON DS-U3
碘伏	山东安捷高科消毒科技有限公司	DF-500
异氟烷	RWD生命科学	R510-22-10
乳胶手套	北京瑞京乳胶制品有限公司	RJJC-S
机械足部刺激测试装置	Kew basis	KW-CT-1
医用镊子	AIZANCHENG	AZN00008
蚊式止血钳	Servicebio	QX1310D
中性树胶	SCRC	10004160
生理盐水溶液	SHIMEN	SLYS-500ml
眼科剪	solomen	B0754
石蜡液	Macklin	8012-95-1
多聚甲醛固定液（中性）	Servicebio	G1101
病理切片机	上海徕卡仪器有限公司	RM2016
注射用青霉素G钠	吉林华牧动物保健品有限公司	兽药批准文号070011248
多聚赖氨酸溶液	上海源叶生物科技有限公司	R23126-50ml
啮齿类动物电推剪	solomen	B1564
啮齿类动物步态成像与分析系统	Clever	TreadScan; BCamCapture
啮齿类动物步态成像与分析系统（软件）	Clever	TreadScan 版本 4.00; BCamCapture 版本 3.00
SD 大鼠	北京斯贝福生物科技有限公司	A102
小动物麻醉机	YuYAN	ABM
蒸汽灭菌器（高压灭菌锅）	Yamato	SQ810C
手术刀片	solomen	B1177
外科口罩	winner	WJKZ-1
手术缝合针持	solomen	B0772
手术剪	GLASS	JZZSX-ZC544R
组织牵开器	浙江科华仪器有限公司	KD-P
超纯水抛光系统	Aiken water El	AK-RO-C2
通用组织固定液（中性）	Servicebio	G1101-15ML
正置光学显微镜	Nikon	NIKON ECLIPSE E100
二甲苯	SCRC	10023418