本研究详细描述了一种大鼠颈椎病的建模方法及针刀干预策略,为相关研究提供了可视化的操作流程。
方法文章
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本研究详细描述了一种大鼠颈椎病的建模方法及针刀干预策略,为相关研究提供了可视化的操作流程。
颈椎病(CS)是一种慢性退行性疾病。颈椎间盘的退行性改变及其继发的病理性变化会影响周围组织和结构,导致颈部疼痛、僵硬、活动受限,以及上肢偶尔出现麻木和放射性症状等临床表现。其中,神经根受压最为常见。因此,本研究建立了由颈神经根受压诱导的大鼠CS模型。针刀治疗在临床CS治疗中显示出一定潜力,可通过松解局部软组织粘连、减轻神经压迫发挥作用。然而,目前在动物实验中尚缺乏可视化的操作流程。本研究提供了一种可靠的大鼠CS模型建立方法及相应的针刀干预方案的详细描述。在该操作中,我们详述了模型诱导过程、针刀操作步骤、治疗定位、大鼠固定技术及关键注意事项。此外,本研究采用肌电图(EMG)确认CS模型建立成功,并通过机械缩足阈值、步态分析和神经根组织病理学评估干预效果。该研究不仅为CS大鼠模型的建立和针刀干预提供了参考,也为未来探索其作用机制的研究提供了系统且可行的实验框架。
颈椎病(CS)是一种常见的退行性脊柱疾病。其核心病理过程起源于椎间盘的退变,进而引发一系列继发性病理改变,包括椎间隙狭窄、骨赘形成和韧带肥厚1,2。这些病理改变导致多种临床症状,如颈肩部酸痛以及上肢放射性麻木。在严重情况下,可能出现神经功能障碍,包括运动功能障碍甚至四肢瘫痪2,3。值得注意的是,近年来颈椎病的发病率逐渐升高,且发病年龄趋于年轻化,给社会和经济带来沉重负担4。颈椎间盘退变及骨赘增生可能累及邻近的骨性和软组织结构,导致颈椎管或椎间孔狭窄,进而压迫邻近结构,包括颈神经根、脊髓和椎动脉1,2,3,4。其中,颈神经根受压最为常见,约占所有颈椎病病例的60%–70%5,6,7。尽管临床上有多种治疗手段可供选择,包括物理治疗、药物干预和手术治疗,但由于手术治疗费用高、创伤大且术后效果不确定,非手术治疗已成为大多数患者的首选方案4。在现代临床实践中,非甾体抗炎药和神经营养药物常被使用。尽管这些药物可在一定程度上缓解疼痛并延缓疾病进展,但同时也伴随消化系统损伤和肾功能损害等不良反应8,9。
针刀疗法是在传统中医针灸理论基础上,结合现代微创外科技术发展而成的一种特色治疗手段。其通过松解软组织粘连、调节局部炎性因子以及改善区域微循环来发挥治疗作用10,11,12。近年来,针刀治疗颈椎病的临床疗效已得到广泛认可,在缓解神经压迫、减轻疼痛及改善颈椎运动功能方面展现出良好潜力13,14。然而,在动物实验中应用针刀干预时,仍面临定位不精确、操作深度难以控制等挑战。同时,为了将这些临床观察转化为可靠的循证结论,建立稳定且可重复的动物模型是必不可少的前提条件。椎间尼龙线结扎法通过将尼龙线植入椎间孔,产生直接的机械压迫,从而精确模拟临床神经根受压的病理生理过程15。该建模方法还具有建模周期短、压迫节段可控等优势15。然而,该手术操作在很大程度上依赖于个人经验,目前尚缺乏详细、可视化的操作描述。
本研究提供了一套完整、详细且可视化的实验方案,涵盖颈椎病大鼠模型的建立以及针刀干预的全部操作过程。由于麻醉剂可能影响机械缩足阈值的测量,进而干扰实验结果16,17,18,19,本研究采用了专用的大鼠固定装置。本文详细描述了大鼠模型的制备过程、分步针刀操作、治疗位点的精确定位、大鼠固定与约束的方法以及其他关键实验注意事项。研究采用了多种评估维度,包括机械缩足阈值测定、电生理记录、步态分析以及神经根组织病理学观察。本研究旨在为颈椎病大鼠模型的建模及针刀干预提供可视化操作流程,从而为针刀治疗颈椎病的作用机制研究及疗效评价提供方法学支持。
所有实验操作均经过北京迈迪康生物科技有限公司实验动物伦理委员会审查、批准并严格监督(批准编号:MDKN-2025-096)。所有实验方案均严格遵循美国国立卫生研究院(NIH)发布的《实验动物护理与使用指南》。本研究中使用的主要试剂与仪器列于材料表中。
1. 实验动物与分组
2. 慢性应激模型的建立
注意:建模前 12 小时对所有大鼠禁食禁水。称重并记录体重。所有手术器械均需经高压蒸汽灭菌(图 2A)。
3. 制动操作步骤
4. 针刀治疗
5. 机械缩足阈值(MWT)测试
注意:在模型建立手术前一天进行测量,第3天rd 天,以及第14th 术后第1天,使用大鼠和小鼠足底机械痛觉刺激仪进行检测。
6. 肌电图(EMG)记录
注意:在建模后第3天,使用生物信号采集与分析系统进行静息态肌电图检测。
7. 大鼠步态分析
注意:在完成针刀干预后的第一天(模型手术后第15天)进行步态分析。步态分析系统由配备透明跑带的跑步机、置于跑带下方的高速数字摄像机以及计算机工作站组成。
8. 神经根组织的苏木精-伊红染色
注意:在模型手术后第15天进行行为学测试后,收集神经根组织样本进行苏木精-伊红染色(HE染色)。
9. 统计分析
机械缩足阈值(MWT)评估显示,造模前各组间的基线值具有可比性。造模和假手术后第3天,假手术组与对照组之间无显著差异(p > 0.05)。相比之下,模型组和针刀组的MWT均较假手术组显著降低(p < 0.01,图4)。治疗结束后,针刀组的MWT较模型组显著升高(p < 0.05,图4)。
肌电图(EMG)记录显示,在第3天rd 造模与假手术后的次日,在模型组和针刀组的静息针电极肌电图中可检测到异常自发电位活动,如纤颤电位和正锐波。相比之下,对照组和假手术组的静息针电极肌电图中未观察到异常自发放电现象。图5). 如果患侧未出现异常的自发电位,提示模型可能未成功损伤目标神经根,需重新检查手术操作。
步态分析显示,治疗结束后,假手术组的平均足迹面积、最大支撑面积和支撑期压力与对照组相比均无显著差异(p > 0.05)。相比之下,模型组的各项步态参数均较假手术组显著降低(p < 0.001)。与模型组相比,针刀组上述各项步态指标均显著升高(p < 0.05,图6)。平均足迹面积是指整个支撑期内足迹大小的平均值。最大支撑面积是指整个支撑期内足迹的最大尺寸。站立压力反映了步态分析系统记录的支撑相期间足爪压力的相对强度。
颈神经根组织的HE染色显示,在对照组和假手术组中,神经根组织形态基本正常,神经纤维和神经元胞体排列相对有序且致密,结构边界清晰,未见明显间质性水肿。与假手术组相比,模型组出现明显的病理性改变,提示存在神经根损伤,表现为神经纤维和胞体排列紊乱、疏松,部分神经细胞破裂变形,部分纤维断裂,以及显著的间质性水肿。与模型组相比,针刀治疗显著改善了上述病理改变,表现为神经纤维和胞体排列趋于规则,间质性水肿减轻,神经组织结构完整性得到部分恢复(图7)。

图1实验设计的时间轴示意图。 经过7天的适应性喂养后,在模型组和针刀组大鼠中建立了慢性应激(CS)模型。假手术组暴露于与模型组相同的脊髓区域,但未植入鱼线。针刀干预从第4天开始th 针刀组成功造模后第1天。于造模前、术后第3天及干预结束时的术后第14天检测大鼠机械痛阈值。于术后第3天进行肌电图评估,以评价神经根受压情况。干预结束后于术后第15天进行步态分析,以评估大鼠运动协调功能。行为学测试完成后,在术后第15天采集检测样本。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 2:CS 大鼠模型的建立。(A)用于模型诱导的手术器械。(B)颈背部切口及组织解剖。(C)左侧 C5–T1 颈椎椎板。请点击此处查看该图的放大版本。

图3:针刀干预操作流程。(A)用于固定大鼠的塑料板。(B)大鼠固定示意图。(C)对应于大鼠C6和C7棘突的体表解剖标志。(D)大鼠针刀治疗的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

图4:四组实验大鼠机械缩足阈值的比较(每组 n = 6)。 **p < 0.01,与假手术组相比;#p < 0.05,与模型组相比。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5:模型诱导后四个实验组的静息状态前肢肌电图。(A) 模型组前肢肌电图。(B) 针刀组前肢肌电图。(C) 对照组前肢肌电图。(D) 假手术组前肢肌电图。请点击此处查看该图的放大版本。

图6:四个实验大鼠组之间步态参数的比较(每组 n = 6)。(A)平均足迹面积的比较。(B)最大支撑面积的比较。(C)支撑压强的比较。***p < 0.001,与假手术组相比;#p < 0.05,与模型组相比。请点击此处查看该图的放大版本。

图7:四组实验大鼠神经根组织在400×放大倍数下的苏木精-伊红(HE)染色结果。(A)对照组的HE染色。(B)假手术组的HE染色。(C)模型组的HE染色。(D)针刀组的HE染色。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
选择合适的动物模型是阐明颈椎病(CS)发病机制并严格评估治疗干预措施的前提。目前,椎体内尼龙缝线法因其相对简便、造模周期短以及高重复性和可靠性而被广泛采用15,20。该方法通过将致压材料植入大鼠脊髓腔内,对颈段脊神经根施加持续性压迫,从而模拟临床上因椎间盘突出或骨赘增生所导致的神经根受压病理状态。在颈椎病相关的继发性损伤中,神经根受压最为常见,并是引起显著临床表现的主要原因,通常表现为颈部疼痛、僵硬以及上肢放射性症状5,7,21。因此,本研究采用椎体内尼龙缝线法建立大鼠颈椎病模型,并提供了该模型建立及针刀干预的可视化操作流程。
神经根受压后,局部缺血、炎症反应和机械性刺激可能引发外周和中枢敏化,最终导致痛觉过敏22,23,24,25,26。本研究结果显示,造模后大鼠同侧前爪的机械痛阈显著降低,表明该模型成功诱导了机械性痛觉过敏。接受针刀干预的大鼠,其机械缩足阈值显著恢复,提示针刀松解可有效减轻痛觉敏化状态。疼痛不仅影响感觉阈值,还会改变动物的自发运动模式。步态分析系统通过捕捉行走过程中足印的空间-时间参数,能够客观量化疼痛引起的代偿性步态改变,从而克服传统行为学评分方法中固有的明显主观性27。本研究中,模型组大鼠表现出同侧前爪平均足印面积、最大站立面积及站立压强的降低,反映出因疼痛所致的负重回避行为和保护性步态改变。相比之下,接受针刀干预的大鼠在上述步态参数上呈现趋于正常化的趋势,表明针刀治疗在缓解疼痛的同时,亦可改善运动协调性。组织形态学观察进一步揭示了各组间神经根内神经纤维和神经元胞体排列与形态的差异,以及间质水肿程度的不同。这些结果提示,针刀治疗可能减轻神经根的病理改变。
神经根受压不仅会引起感觉传导障碍,还可能导致所支配肌肉的失神经支配或异常性过度兴奋。静息状态下的肌电图(EMG)通过记录完全放松肌肉中的自发性电活动(如纤颤电位和正锐波),可敏感地反映继发于神经源性损伤的肌膜兴奋性异常,是临床和实验条件下评估神经根病变的关键电生理手段28,29,30。在生理状态下,完全放松的肌肉应表现为电静息,无自发性放电。本研究中,在模型建立后的大鼠同侧前肢肌肉静息状态下检测到明显的自发性放电。此类异常的静息期肌电活动是神经源性损伤的典型表现,提示这些大鼠的颈神经根可能持续受到压迫31。模型组与针刀组在造模后的异常肌电图结果进一步从电生理角度证实了大鼠脊髓型颈椎病模型的成功建立。
为了避免反复麻醉的累积效应对行为学评估造成干扰,本研究在清醒动物中使用固定装置进行针刀干预32。既往研究表明,充分的适应性训练和重复暴露可显著减弱固定所引起的压力反应33,34,35,36。这提示本方案中干预前的适应性训练可有效减少急性固定应激对实验指标的干扰。
本研究并非没有局限性。首先,椎体内尼龙缝线法主要模拟急性或亚急性机械性压迫,而人类颈椎病通常遵循慢性退行性病程。其次,尽管目前的束缚方案旨在尽量减少应激反应,但未来的研究应评估应激相关生物标志物(如血清皮质醇),以更全面地评价束缚装置的影响。
综上所述,本研究提供了一套建立坐骨神经卡压(CS)大鼠模型并 subsequently 采用针刀治疗的详细操作流程。结果表明,针刀松解可显著提高机械性痛觉阈值,改善避痛步态模式,并减轻神经根的病理改变。因此,本研究为阐明针刀疗法治疗坐骨神经卡压(CS)的作用机制提供了系统且实用的实验框架。
所有作者均已声明不存在潜在的利益冲突。
本研究由国家重点研发计划(项目编号:2023YFC3502703)和湖北省自然科学基金创新与发展联合基金重点项目(项目编号:2024AFD271)资助。
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