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在稳定转导的HEK293基因敲除细胞中靶向Cas9进行挽救实验

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DOI：

10.3791/72172

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2026年8月28日

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1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

本文内容

摘要

该方案在基因组编辑后消除Cas9蛋白，以促进在稳定转导的基因敲除细胞系中进行可靠的挽救实验。

摘要

CRISPR-Cas9 基因编辑技术彻底改变了分子生物学。该技术常用于删除编码目标蛋白的基因。由此产生的表型可为该蛋白的功能提供重要见解。通过重新引入目标蛋白以恢复其丧失的功能（即“拯救”实验），可进一步验证该蛋白的功能重要性。通常，这一过程通过使用表达载体以反式方式导入蛋白编码的 cDNA 来实现。然而，在稳定表达 CRISPR-Cas9 系统的基因敲除细胞系中，新导入的表达质粒也可能被 Cas9 切割。本文介绍的方案提供了一种策略，可克服这一可能阻碍拯救实验的技术障碍。本方法以 HEK293 细胞为例进行演示，其中编码 E3 泛素连接酶支架蛋白 CUL4B 的基因已被 CRISPR-Cas9 系统破坏。通过向这些细胞转导靶向整合的 Cas9 转基因的向导 RNA（gRNA），可使可检测的 Cas9 蛋白完全消失。Cas9 的消除使得在导入 CUL4B 表达质粒后，CUL4B 的表达和功能得以恢复。这些结果为通过拯救实验研究蛋白功能提供了一种具有广泛适用性的概念验证方法。

引言

CRISPR-Cas9 是一种强大的基因组编辑工具，源自原核生物用于抵御噬菌体感染的天然适应性免疫系统。由于其成本低、成功率高且操作简便，CRISPR-Cas9 技术已超越其他基因组编辑工具（如锌指核酸酶 ZFNs 和转录激活因子样效应物核酸酶 TALENs），成为细胞培养中实现精确遗传修饰的首选方法。该两组分系统由 Cas9 核酸酶和向导 RNA（gRNA）组成。通过 Watson-Crick 碱基配对，gRNA 将 Cas9 引导至位于原间隔序列邻近基序（PAM）附近的基因组靶位点。PAM 序列作为关键识别位点，激活核酸酶活性。在此位点，Cas9 产生双链断裂（DSB）。在缺乏同源修复模板的情况下，细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复 DSB。该修复机制可引入插入或缺失（indels），导致移码突变并使靶基因功能失活。因此，通过共表达 Cas9 与设计好的 gRNA 即可实现靶基因的破坏。该 20 个核苷酸的 gRNA 序列与 PAM 附近基因组位点互补。靶基因功能的丧失有助于揭示其在细胞过程中的特定作用1。

挽救实验或互补实验旨在通过恢复缺失的蛋白质来逆转所观察到的表型。该方法可作为严格的对照，用以排除非预期的实验效应，例如由CRISPR-Cas9脱靶删除所导致的效应。重新引入目标蛋白的最常用方法是通过转染或转导外源表达载体。然而，这种外源导入的DNA与内源基因座一样，同样可能受到CRISPR-Cas9的靶向切割。这一风险在稳定转导的细胞系中尤为突出，此类细胞系通常持续表达Cas9，并结合抗生素筛选以确保获得均一且稳定的基因敲除群体；这种策略常用于难以转染或转导的细胞系，例如来源于免疫系统、造血系统或神经元谱系的细胞系。

一种规避载体靶向的方法是引入编码目标蛋白的外源mRNA，从而绕过Cas9介导的切割以及对核内转录的需求。然而，与质粒DNA相比，合成mRNA的生产成本更高，本身稳定性较差，且表达持续时间极短。此外，它需要特定的化学修饰以避免激活胞质内的固有免疫反应2。

为避免Cas9/gRNA复合物对表达质粒的靶向作用，可采用编码序列的摇摆碱基（wobble base）工程化改造。利用遗传密码的简并性，可引入同义突变以消除必需的PAM序列和/或破坏gRNA互补性，同时不改变所编码蛋白的氨基酸序列。然而，使用同义突变并非没有风险。这些改变可能引入非最优密码子使用，从而干扰翻译动力学，导致蛋白质错误折叠、mRNA稳定性降低或RNA二级结构产生有害变化3,4。尽管发生频率较低，其他潜在后果还包括引入隐蔽的多聚腺苷酸化信号、破坏转录后调控元件以及CpG密度增加5,6。此外，如果工程化序列导致的mRNA结构干扰核糖体行进，可能意外激活细胞应激反应7,8。

除了使用合成mRNA或摆动碱基工程所伴随的挑战之外，基因编辑后Cas9的持续表达会在后续实验中引入多种混杂因素。由于Cas9的特异性可能并不完全，其长期表达会增加脱靶切割的可能性，导致随着时间推移不断积累非预期的突变9,10,11。此外，持续的基因组监控和重复的双链断裂（DSB）可能触发持续的DNA损伤应答，最终促使细胞进入细胞周期阻滞、衰老或凋亡状态12,13。这种组成型表达还会带来代谢负担，从而加剧克隆漂移，即低表达细胞逐渐取代高表达细胞，导致连续传代过程中外源基因表达水平不一致。最后，作为一种较大的原核蛋白，Cas9可能通过先天免疫信号通路引发细胞应激，或超出宿主细胞蛋白质稳态系统的负荷能力，诱导未折叠蛋白反应14,15,16。

为了减轻这些复杂情况，已开发出多种瞬时Cas9抑制策略，包括噬菌体来源的抗CRISPR蛋白（Acrs）17,18、小分子抑制剂或融合降解决定子的系统（如PROTACs）19,20，以及光遗传学控制机制19,21。然而，这些方法引入了实际应用中的障碍，限制了其在挽救实验中的实用性。Acrs通过分子模拟发挥作用，因此需要进行化学计量优化以实现精确控制。此外，Acrs还可能加剧与Cas9过表达相关的蛋白稳态和免疫原性应激。化学调控会带来药代动力学复杂性、潜在的细胞毒性，以及PROTAC相关的“钩效应”——即配体浓度过高时反而会阻碍功能性三元复合物的形成22。光遗传学平台则受限于细胞光毒性，以及需要专用硬件来维持稳定光照的条件19,21。重要的是，由于这些方法仅提供暂时性或可逆性抑制，在Cas9持续表达的应用中往往效果不足。

相比之下，自失活 CRISPR 系统通过在成功编辑目标基因后立即自主且永久地破坏 Cas9 转基因，提供了一种永久性的解决方案。该方法通过消除残留的核酸酶活性，可永久保护后续的拯救载体免受切割，同时减少长期的蛋白质稳态压力和脱靶基因组漂移。尽管自导向 gRNA 可通过瞬时核糖核蛋白或脂质介导的转染递送23,24，但这些方法容易发生稀释和随机变异，导致产生“嵌合”细胞群体，其中部分细胞逃逸了失活过程25,26,27。

为了克服这些局限性，本文所述方案利用慢病毒递送系统实现Cas9的自我失活，为稳定细胞系的改造提供了显著的实用优势。慢病毒递送可确保Cas9转基因与其自我靶向调控元件的连锁遗传，有效防止在快速分裂的细胞群体中出现典型的“稀释逃逸”现象。此外，慢病毒载体较大的载荷容量允许共表达筛选标记，从而确保获得均一的Cas9缺失细胞群体；而通过VSV-G假型化赋予的广泛嗜性，可实现对难转染细胞类型的高效递送25,28,29。

作为该方法的概念验证演示，本方案详细描述了Cas9的自我失活过程，以促进E3泛素连接酶支架蛋白CUL4B在CUL4B基因敲除的HEK293细胞中实现表型挽救30。

方案

本研究使用了已建立的永生化人源细胞系（HEK293 和 HEK293FT），未涉及人类受试者、原代人组织或动物实验。因此，无需机构伦理审批。

1. Cas9的生成-特异性gRNA慢病毒载体构建

  1. 将 Cas9 特异性的 gRNA 序列（表 1）插入 pLentiGuide-Puro 慢病毒载体中。
  2. 用与用于筛选稳定转导的 CRISPR-Cas9 细胞系的抗性标记不同的抗生素抗性基因替换原抗性基因。
  3. 使用载体特异性引物通过 Sanger 测序验证 Cas9 特异性 gRNA 和替换的抗生素抗性基因的成功插入及序列保真度。
    注：在本方案中，嘌呤霉素抗性（PuroR）基因被替换为潮霉素 B 抗性（HygroR）基因，以构建载体 Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro。其他可选的抗生素抗性基因包括杀稻瘟菌素 S（BlastR）、G418/遗传霉素（NeoR）和博来霉素（ZeoR）。

2. 编码Cas9特异性gRNA的慢病毒的制备

  1. 在10 cm组织培养处理皿中接种2.5 × 106 个HEK293FT细胞。
    注意：将细胞维持在补充有10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM；高糖）中（下文简称cDMEM），并在含5% CO2的湿润化培养箱中于37 °C培养。使用HEK293FT细胞是因为其产生的慢病毒滴度高于其他源自HEK293的细胞系31。
  2. 将细胞培养12 h，直至其融合度至少达到60%，然后进行转染。
    注意：根据Pauwels等32所述，在涉及第三代慢病毒载体的所有操作中，必须在生物安全二级（BSL-2）条件下进行，并使用适当的个人防护装备（PPE）和经批准的去污染程序（例如II级生物安全柜、二级密闭容器和70%乙醇）。
  3. 配制标准的磷酸钙（CaPhos）转染混合液。将20 µg总质粒DNA溶于无菌分子生物学级水中，定容至终体积450 µL。随后加入50 µL 2.5 M CaCl2，再加入500 µL 2× HEPES缓冲盐溶液（HBS；pH 7.05），在1.5 mL微量离心管中得到终体积为1 mL的混合液。
    注意：使用经序列验证、主要为超螺旋构型的质粒DNA，并满足以下质量标准：A260/A280 = 1.8–2.0，A260/A230 = 2.0–2.2，内毒素 <0.1 EU/µg。转染混合液中各组分按近似等摩尔比例配制，包括5 µg Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro、5.6 µg pLP1（Gag/Pol）、3.8 µg pLP2（Rev）和5.6 µg pLP/VSVG（水疱性口炎病毒糖蛋白）。
  4. 通过轻柔移液充分混匀CaPhos转染溶液。
  5. 将1 mL CaPhos转染混合液逐滴加入HEK293FT细胞培养物中。
  6. 轻轻摇动培养皿，使转染复合物均匀分布。
  7. 将细胞继续培养12 h。
    注意：磷酸钙转染通常不受常规维持用抗生素的影响33。然而，对于更敏感的转染方法（如脂质体转染），建议使用无抗生素培养基，因为聚阴离子类抗生素可能干扰DNA-脂质复合物的形成34。
  8. 吸除并弃去培养基。
  9. 用10 mL室温无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。
  10. 吸除并弃去PBS。
  11. 加入10 mL新鲜的室温cDMEM。
  12. 将细胞放回培养箱，使慢病毒颗粒在培养基中积累36 h。
    注意：在此条件下，未浓缩的慢病毒上清液在48 h后预计可产生约1.0 × 106转导单位（TU）/mL，但实际滴度应通过实验测定，方法可参考Kutner等35或Barde等36所述。慢病毒上清液可在−80 °C保存长达2年。避免反复冻融，因其可使病毒滴度降低约55%37,38,39,40。

3. 收获编码 Cas9 特异性 gRNA 的慢病毒并转导靶细胞

  1. Seed 1.0 × 106 10 cm 组织培养处理培养皿中的贴壁靶细胞
  2. 在慢病毒转导前，将靶细胞孵育 12 h。
    注意：靶细胞为稳定表达HEK293细胞 Streptococcus pyogenes Cas9，一种 CUL4B靶向 gRNA（表1），以及嘌呤霉素抗性（PuroR）基因。将细胞培养在含cDMEM的培养基中 10 µg/mL 嘌呤霉素处理，并在Cas9自我失活前通过蛋白质印迹分析验证CUL4B的敲除。后续所有实验均使用早期传代的HEK293细胞进行。ΔCUL4B 细胞
  3. 小心地将 HEK293FT 生产细胞的上清液转移至无菌的 15 mL 锥形管中，收集含慢病毒的培养基，注意不要扰动细胞单层。
    注意：根据既定的生物安全指南丢弃 HEK293FT 生产细胞32.
  4. 将收集的上清液在1,000 × g离心 × g 室温（RT）下离心10分钟，以沉淀残留的HEK293FT生产细胞。
  5. 吸弃先前接种的 HEK293 细胞的培养液ΔCUL4B 细胞
  6. 将7 mL澄清的慢病毒上清液转移至含有HEK293细胞的10 cm培养皿中ΔCUL4B 细胞。避免扰动离心管底部的沉淀，至少保留1 mL上清液，以尽量减少生产细胞的残留。
    注意：将上清液通过滤器过滤 0.45 µm 必要时可进行过滤，以进一步去除残留的生产细胞。根据生物安全指南丢弃剩余的上清液。32. 在估计滴度为 1.0 时 × 106 TU/mL，7 mL 接种量预计产生的感染复数（MOI）介于 3.5 至 5.5 之间41.
  7. 孵育转导的 HEK293ΔCUL4B 细胞培养24小时，以确保慢病毒转导与整合完全。
  8. 吸弃病毒上清液。
  9. 用 10 mL 室温无菌 1 洗涤细胞一次× PBS
  10. 吸弃 PBS。
  11. 加入10 mL新鲜的室温cDMEM。
  12. 将细胞放回培养箱中，培养四天，以允许外源基因表达和Cas9介导的基因敲除。
    注意：如果慢病毒 Cas9 gRNA 载体未编码荧光报告基因，则需平行转导一组指示细胞，使用同样方式构建的表达荧光报告基因的慢病毒载体。利用该指示细胞体系，通过定性荧光显微镜观察或定量流式细胞术评估转导效率及靶基因敲低的时间进程。在本研究中，转导后四天即可通过荧光显微镜清晰检测到 GFP 表达。

4. Cas9特异性gRNA转导子的抗生素筛选

注意：转导后第4天，靶细胞应达到或接近汇合状态，需要转移至更大的培养容器中。在开始抗生素筛选的同时进行细胞传代。

  1. 吸出并弃去 HEK293ΔCUL4B 细胞的培养基。
  2. 用 10 mL 室温无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。
  3. 吸出并弃去 PBS。
  4. 向培养皿中加入 2 mL 无菌、室温的胰蛋白酶-EDTA 溶液。
  5. 孵育 5 分钟，以促进细胞脱落。
  6. 加入 8 mL 室温的完全 DMEM 培养基（cDMEM）以中和胰蛋白酶。
  7. 将细胞悬液转移至无菌的 15 mL 圆锥形离心管中。
  8. 吹打细胞悬液 15–20 次，充分解离细胞团块。
  9. 在室温下以 200 × g 离心 10 分钟。
  10. 在细胞离心期间，准备一个 T150 组织培养处理过的细胞培养瓶，其中加入 20 mL 含 250 µg/mL 潮霉素 B 的 cDMEM 培养基。
    注意：不同细胞类型所需潮霉素 B 的筛选浓度可能不同。应使用 50–500 µg/mL 的潮霉素 B 进行杀灭曲线实验，以确定在 7–10 天内完全清除未转导细胞所需的最低浓度。若 Cas9 gRNA 载体中使用了其他抗生素抗性标记，则应分别使用 2–10 µg/mL 杀稻瘟菌素 S（blasticidin S）、400–800 µg/mL G418/Geneticin 或 50–400 µg/mL Zeocin 进行杀灭曲线实验。
  11. 小心吸出并弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。
  12. 将细胞沉淀重悬于 10 mL 含 250 µg/mL 潮霉素 B 的 cDMEM 培养基中。
  13. 将 10 mL 细胞悬液转移至已准备好的含 20 mL 筛选培养基的 T150 培养瓶中。
  14. 轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布。
  15. 在筛选条件下继续孵育三天。
  16. 筛选第 3 天，吸出筛选培养基，并更换为 30 mL 新鲜的含 250 µg/mL 潮霉素 B 的 cDMEM 培养基。
    注意：更换筛选培养基可去除未贴壁的死亡细胞，补充营养物质，并维持抗生素活性。
  17. 继续孵育，直至存活细胞形成的单层达到约 90% 汇合度，通常还需额外四天。

5. Cas9 清除及反式 CUL4B 补救的验证

注意：当细胞融合度达到约90%时，需在初始实验中确认Cas9敲除效果，并立即冻存剩余的细胞群体42。该方法可最大限度地减少继发性代偿机制的产生。

  1. 种子早期传代的HEK293细胞ΔCUL4B 稳定表达靶向Cas9的gRNA的细胞（下文简称HEK293）ΔCUL4BΔcas9) 接种至6孔组织培养处理板的4个孔中，密度为2.5 × 105 每孔细胞数
  2. 种子 HEK293ΔCUL4B 将细胞接种到另一块6孔板的四个孔中。同时，将亲本HEK293细胞接种至至少一个额外的孔中作为对照。
    注意：使用 HEK293ΔCUL4B 并分别以亲代HEK293细胞培养物作为Cas9和CUL4B表达的对照。
  3. 将所有培养物孵育12小时，以确保细胞完全贴壁并处于活跃增殖状态。
  4. 制备含0、0.5、1.0或 2.0 µg pCMV-FLAG-CUL4B 的混合物，调整至相同的总体积 10 µg 通过添加空的 pCMV 载体来补充质粒 DNA。
  5. 将每种DNA混合物用无菌分子生物学级水稀释至终体积 180 µL，添加 20 µL 2.5 M CaCl₂2，然后加入 200 µL 2 的× HEPES 缓冲盐溶液（HBS；pH 7.05），以获得终体积 400 µL 在1.5 mL微量离心管中。
    注意：当使用由强启动子（如 CMV）驱动的表达质粒时，应进行 DNA 滴定，以获得与内源性表达水平相当的蛋白表达量。应使用序列验证、以超螺旋构型为主的质粒 DNA，其 A260/A280 值为 1.8–2.0，A260/A230 值为 2.0–2.2，且内毒素水平低于规定限值。 <0.1 EU/µg.
  6. 通过轻柔吹打充分混匀每种 CaPhos 转染溶液。
  7. 添加 200 µL 将每种转染混合物逐滴加入指定的含有 HEK293 的孔中ΔCUL4BΔCas9 细胞。每次更换样本时需更换移液器吸头，以防止交叉污染。
  8. 加入剩余的 200 µL 将每种相应的转染混合物逐滴加入指定的含有 HEK293 的孔中ΔCUL4B 细胞
  9. 将转染后的培养物孵育 12 h。
  10. 吸出每个孔中的培养基。
  11. 用 1 mL 室温无菌 1 洗涤细胞一次× PBS
  12. 吸去并弃去 PBS。
  13. 向每个孔中加入 2 mL 新鲜的室温 cDMEM。
  14. 继续培养细胞 24 小时，以允许 CUL4B 表达及其下游功能反应的发生。
  15. 使用标准的胰蛋白酶消化法收集细胞。
  16. 将每种细胞悬液转移至单独的1.5 mL微量离心管中。
  17. 将每份细胞悬液用1次洗涤× PBS
  18. 短暂地以14,000离心样品 × g 在室温下离心以沉淀细胞。
  19. 吸去并弃去 PBS 上清液。
    注意： β-巯基乙醇是一种具有强烈气味的挥发性皮肤和呼吸道刺激物。操作贮存液时应在经认证的化学通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备，包括耐化学腐蚀手套、实验服和护目镜。受污染的枪头、离心管及废弃物应根据机构的危险废物处理指南进行处置。
  20. 直接在细胞沉淀中进行裂解 200 µL Laemmli上样缓冲液，添加5%（v/v） β-巯基乙醇
  21. 通过加热样本使蛋白质变性 95 °C 15 分钟。
  22. 分离 20–40 µg 每泳道总蛋白量通过标准十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。
  23. 将已分离的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
  24. 使用封闭缓冲液在室温下封闭膜 30 分钟。
    注意：使用5% (w/v)脱脂干奶粉或5% (w/v)牛血清白蛋白（BSA）溶于标准洗涤缓冲液（0.1%吐温20溶于1）中制备封闭缓冲液× Tris缓冲盐溶液或1× PBS
  25. 用标准洗涤缓冲液将膜洗涤三次，每次10分钟。
  26. 用针对 CUL4B、Cas9、WDR5、CDC6 的一抗孵育膜 α-TUBULIN 孵育 12 小时 4 °C 轻柔振荡。
    注意：将一抗用标准洗涤缓冲液按 1:1,000 稀释。
  27. 移除一抗溶液，使用标准洗涤缓冲液将膜清洗三次，每次10分钟。
  28. 将膜与相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗在4℃孵育12小时 4 °C 轻轻摇动。
    注意：将二抗用封闭缓冲液按1:3,000比例稀释。
  29. 除去二抗溶液，使用标准洗涤缓冲液将膜洗涤三次，每次10分钟。
  30. 将增强型化学发光（ECL）底物均匀地覆盖于膜上，孵育1分钟。
  31. 使用数字成像系统捕获化学发光信号。
    注意：若需确认基因敲除是否成功，可在对分离出的基因组DNA进行PCR扩增后，对靶向的基因组区域进行Sanger测序以验证。43.

结果

为了生成Cas9敲除的细胞系以用于实验性重建，使用标准包装质粒（pLP1、pLP2和pLP/VSVG）在HEK293FT细胞中产生编码靶向Cas9的gRNA的慢病毒（Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro）。收集产生的病毒上清液并用于转导目标细胞。在潮霉素B筛选过程中的细胞存活证实了慢病毒转导成功，随后的蛋白质印迹分析验证了Cas9的敲除（图1）。

在亲代 HEK293 细胞中可 readily 检测到 CUL4B 蛋白，但在空载体转染的 HEK293 细胞中则未检测到ΔCUL4B 和 HEK293ΔCUL4BΔCas9 细胞中，与CUL4B的缺失一致，WDR5和CDC6分别表现出预期的稳态表达水平上升和下降，证实CUL4B功能受到破坏。在HEK293细胞中检测到Cas9蛋白ΔCUL4B 细胞中可检测到，但在亲本HEK293和HEK293中未检测到ΔCUL4BΔCas9 细胞，证实了Cas9成功敲除。如预期所示，将CUL4B表达质粒转染至HEK293细胞中ΔCUL4B 细胞仅导致CUL4B蛋白表达的轻微恢复。相比之下，在转染HEK293后观察到强烈的CUL4B表达。ΔCUL4BΔcas9 细胞，同时伴随下游蛋白表达的恢复，表现为WDR5水平降低和CDC6水平升高。综上所述，这些结果表明，Cas9的缺失可通过防止Cas9介导的拯救质粒切割，有效恢复CUL4B的表达与功能。图2).

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图1：Cas9 靶向敲除及 CUL4B 功能回补验证的实验流程图。 本流程图概述了通过磷酸钙转染法，将 pLP1、pLP2、pLP/VSVG 以及 Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro 质粒共同转染至 HEK293FT 包装细胞中，从而产生 Cas9 敲除的 CRISPR 基因敲除细胞。收集产生的慢病毒上清液，经离心去除残留的包装细胞后，用于转导目的细胞。经过筛选后，通过蛋白质印迹分析验证 Cas9 是否成功敲除，以建立纯净的基因敲除细胞系，为后续实验中 CUL4B 的功能回补做好准备。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 2：在 CRISPR-Cas9 编辑的 HEK293 细胞中恢复 CUL4B 的表达与功能。 （A）转染实验流程示意图。将空载体或不同剂量的 pCMV-FLAG-CUL4B 转染至 HEK293ΔCUL4B   和 HEK293ΔCUL4BΔcas9 细胞中。转染后 36 小时收集细胞，通过 SDS-PAGE 分离裂解液中的蛋白质。（B）恢复效率及下游功能对照的 Western blot 分析。通过 Western blot 检测所示蛋白。WDR5 和 CDC6 作为 CUL4B 功能的对照。α-TUBULIN 作为上样对照。亲本 HEK293 细胞作为基础表达水平的对照。结果为重复实验的代表性图像（n = 2）。请点击此处查看该图的放大版本。

靶基因gRNA 序列 (5′→3′)PAM (5′→3′)靶位点位置靶位点描述
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 外显子 3人 CUL4B 开放阅读框的 N 端区域，用于产生移码敲除
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)cas9 转基因的保守内部区域，用于诱导自我失活的插入缺失突变

表1：CRISPR-Cas9 指导RNA序列及基因组靶标信息。

讨论

本方案能够在CRISPR-Cas9编辑后敲除Cas9的细胞系中，有效恢复目标蛋白的表达与功能。本研究的一个重要发现是，组成型表达Cas9会显著抑制质粒驱动的外源基因表达。本方案的优势在于能够同时挽救丢失的蛋白及其相关表型。该方法还为研究多种蛋白变异的表型效应提供了框架。例如，引入磷酸化模拟突变（如丝氨酸突变为天冬氨酸）可在无内源蛋白背景干扰的情况下，深入揭示该翻译后修饰的功能作用。

因此，该方案广泛适用于标准的贴壁细胞系（如 HeLa、A549）和悬浮细胞系（如 Jurkat、THP-1）。然而，这种序贯筛选策略在原代细胞或非分裂细胞（如原代神经元或巨噬细胞）中可能难以实施。在这些敏感体系中，未转导的旁观者细胞快速清除会向共有的微环境释放细胞毒性碎片和促凋亡应激信号，从而引发间接毒性46,47。该策略在高度适应性、非整倍体的癌细胞系（如 U87 胶质母细胞瘤或 A375 黑色素瘤）中也可能失效，这些细胞系可通过快速的染色体重排或快速筛选出预先存在的耐药克隆，逃避 CRISPR 介导的表型效应48,49。最终，该方案的适用性取决于细胞系是否能够耐受双载体表达带来的代谢负荷，抵抗上述间接筛选压力，并在整个持续数周的实验过程中维持稳定的生长动力学。

尽管该方法可作为大多数细胞系的通用概念验证，但其实施需要在递送效率与基因组完整性之间进行谨慎权衡。如文中所述，使用慢病毒递送“自我”靶向的gRNA可确保获得均一的Cas9敲除细胞群体，尤其适用于难转染的细胞。然而，由于病毒载体半随机整合可能引发插入突变，仍存在一定的风险。通过优化感染复数（MOI）可有效控制此类风险。在HEK293等易感细胞系中，MOI为1–5即可实现高效感染，同时最大限度地减少整合所致的突变及细胞毒性41。相比之下，免疫细胞或神经元等难感细胞通常需要10–50的MOI，并往往需借助聚凝胺（polybrene）和/或离心感染（spinoculation）等增强手段以达到相似的效率50,51,52,53,54,55。

这种技术上的权衡也体现在多克隆群体与单克隆群体的选择之间。本研究中构建的 HEK293ΔCUL4BΔcas9 细胞为多克隆群体，这一选择避免了单细胞亚克隆所需的数周扩增时间，从而加快了实验进程。此外，多克隆群体能够反映细胞培养物的平均表型，有效缓冲了克隆特异性偏差或位点特异性整合问题带来的影响。尽管由于遗传均一性，单克隆细胞系更可能获得一致的结果，但本文结果表明，当优先考虑实验速度和群体代表性时，多克隆筛选是一种可行且往往更优的替代方案。

所得表型的时间稳定性也可能是一个关键变量。在本研究展示的系统中，CUL4B 对 WDR5 和 CDC6 的调控作用随着敲除细胞系的连续传代而逐渐减弱，这与同源蛋白 CUL4A 的代偿性上调相关（数据未显示）。这一现象与 Nakagawa 等人的研究结果一致，后者表明 CUL4A 能够在 CUL4B 缺失的细胞中部分恢复 CUL4B 的功能44。此类稳态代偿在细胞生物学中较为常见，尤其是在靶向一种与其他细胞蛋白具有高度结构同源性和功能冗余性的蛋白时。

为了应对这些次级代偿机制，可根据实验目标和所用细胞系选择两种不同的策略。对于优先考虑效率或使用高度适应性细胞系的研究人员，必须采用紧凑的实验时间表。该策略包括在筛选后细胞培养物达到90%融合度时，立即验证目标蛋白的丢失，随后迅速进行自失活Cas9靶向及功能检测。通过采用这种加速的工作流程，可以在细胞稳态机制有足够时间上调冗余旁系同源物或干扰表型结果之前，更有可能捕捉到基因敲除的初级生物学效应。

或者，对于需要长期稳定性或高精度拯救实验的研究，特别是在转染困难的模型（如免疫细胞和神经元细胞）中，可采用四环素调控系统（Tet-On/Off）作为可行方案56,57。尽管该诱导系统的实施需要额外的慢病毒转导步骤以及不同的抗生素抗性标记，但它能够在触发短暂的、由多西环素介导的“缺失与拯救”事件之前，持续恢复目标蛋白，从而稳定细胞环境57。

披露

作者使用 Google Gemini 辅助优化技术术语并编辑手稿。该人工智能工具仅用于语言润色，并未参与数据的原始整合、研究概念的形成或文本的初步撰写。作者已审阅并编辑了输出内容，对最终手稿的内容承担全部责任。作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了 Le Moyne 学院的启动资金、Le Moyne 学院研究与发展委员会、Le Moyne 学院学生研究委员会、Walter L. '66 和 MaryAnne Poland 耶稣会教学与研究创新基金以及 Le Moyne 学院生物与环境科学系的资助。作者感谢使用 BioRender.com 制作图形插图。图 1 由 BioRender 制作（Sharifi, J., 2026；https://BioRender.com/72u0wl3），图 2 的上半部分由 BioRender 制作（Sharifi, J., 2026；https://BioRender.com/lc6o2lu）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗 Cas9 抗体Cell Signaling65832该小鼠单克隆抗体可特异性检测人裂解液中的 S. pyogenes Cas9，适用于验证自导向 gRNA 介导的 Cas9 清除效果。
抗 CDC6 抗体Cell Signaling3387该兔单克隆抗体可特异性检测人源 CDC6，适用于监测 CUL4B 的下游功能影响。
抗 CUL4B 抗体Sigma-AldrichC9995该亲和纯化的兔多克隆抗体可特异性检测人源 CUL4B，且不与结构相近的同源蛋白 CUL4A 发生交叉反应。
抗小鼠 IgG HRP 标记二抗Cell Signaling7076该马源抗小鼠 IgG 抗体与辣根过氧化物酶（HRP）偶联，适用于化学发光法检测小鼠单克隆一抗。
抗兔 IgG HRP 标记二抗Cell Signaling7074该山羊抗兔 IgG 抗体与辣根过氧化物酶（HRP）偶联，适用于化学发光法检测兔多克隆和单克隆一抗。
抗 WDR5 抗体Cell Signaling13105该兔单克隆抗体可特异性检测人源 WDR5，适用于监测 CUL4B 的下游功能影响。
抗α-微管蛋白抗体Cell Signaling3873该小鼠单克隆抗体靶向人源 α-微管蛋白，适用于 Western blot 分析中作为均一上样对照以进行标准化。
磷酸钙转染试剂盒ThermoFisher ScientificK278001该试剂盒提供高效的瞬时转染试剂，优化用于在贴壁的 HEK293FT 生产细胞中规模化、低成本地生产慢病毒载体。
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation 定制合成cas9 gRNA 序列：CGTGATCACCGACGAGTACA，PAM 序列：AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation 定制合成cas9 gRNA 序列：CGTGATCACCGACGAGTACA，PAM 序列：AGG
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 GibcoD5796该高糖培养基添加了 L-谷氨酰胺和丙酮酸钠，适用于维持快速增殖的哺乳动物细胞系（如 HEK293FT）的生长、活力和代谢稳定性。
胎牛血清，优等品（热灭活）Corning35-016-CV该优质热灭活血清提供必需的生长因子和激素，同时最大限度减少补体介导的细胞毒性，适用于哺乳动物细胞培养。
HEK293美国模式培养物集存库CRL-1573该特征明确的人胚肾细胞系具有高转染效率，是研究基因敲除表型和蛋白挽救体系的可靠标准模型。
HEK293FT 细胞 ThermoFisher ScientificR70007该人胚肾细胞系的快速增殖、高转染效率变体稳定表达 SV40 大 T 抗原，适用于在慢病毒载体生产过程中最大化病毒滴度。
潮霉素 BsigmaaldrichH7772该氨基核苷类抗生素在哺乳动物细胞培养中用作筛选剂，用于分离表达潮霉素抗性标记的稳定转导细胞。
pCLIP-All-hCMV-Puro 质粒（CUL4B gRNA）Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bCUL4B gRNA 序列：ATCAAACCCTACAAACTCCA，PAM 序列：AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/A该哺乳动物表达质粒利用巨细胞病毒（CMV）启动子驱动带 FLAG 标签的 Cullin 4B 蛋白（CUL4B）的组成型表达，由 Jianping Jin 惠赠。
pCMV-M1 哺乳动物表达载体Addgene23007空表达载体对照（由 Linda Wordeman 惠赠）
pLentiGuide-PuroAddgene52963该慢病毒转移载体利用人 U6 启动子驱动可定制 gRNA 的表达，同时利用 EF-α 启动子驱动嘌呤霉素抗性标记，用于在表达 Cas9 的细胞中进行 CRISPR 靶向，由 Feng Zhang 惠赠。
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 编码 GFP 的慢病毒载体，用于评估转导效率（由 Kevin Janes 惠赠）
嘌呤霉素Sigma-AldrichP8833该氨基核苷类抗生素在哺乳动物细胞培养中用作筛选剂，用于分离表达嘌呤霉素抗性标记的稳定转导细胞。
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）Corning21-040-CV该标准平衡盐溶液用于洗涤细胞单层，可有效去除微量培养基、血清蛋白或酶，同时不破坏渗透压或细胞活力。
胰蛋白酶 EDTA 1XCorning25-051-CI该标准酶解解离溶液通过切割肽键使贴壁哺乳动物细胞从培养容器上脱落，同时 EDTA 螯合二价阳离子以破坏细胞间黏附。
ViraPower 慢病毒包装混合物ThermoFisher ScientificK497500该优化的包装质粒混合物（pLP1、pLP2 和 pLP/VSVG）用于共转染生产细胞，以促进高滴度、复制缺陷型慢病毒表达载体的组装与生产。

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