通过对比增强磁共振成像技术示踪脑脊液转运 通过 啮齿类动物脑室内输注

摘要

本文介绍了一种适用于啮齿类动物动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）研究的脑室插管与示踪剂灌注方案。该方案能够在图像采集期间持续输送示踪剂，从而在一次连续且不间断的成像过程中，实现示踪剂在全脑内转运及其从脑组织清除过程的映射。

摘要

脑室内（ICV）插管技术可将外源性示踪剂或治疗剂直接输送至侧脑室，即脑脊液（CSF）循环通路的起始部位。注入的分子通过脑脊液的团流经脑室系统运输至蛛网膜下腔，并进一步进入脑实质。 通过 血管周围间隙。然而，传统的脑室内插管方法通常使用铁磁性套管，这与MRI研究不兼容，因此需要在扫描仪外进行灌注，并在成像前移除套管。动物转运和成像准备所需的时间常常导致示踪剂运输最初阶段（ arguably 最关键的阶段）的丢失。本文介绍一种适用于啮齿类动物的MRI兼容性脑室内插管与灌注方案，可在动态MRI采集期间支持扫描仪内持续示踪剂输送。灌注管路由完全非磁性材料构成，能够在单次扫描会话中实现 uninterrupted 的图像采集。该方法适用于脑脊液动力学、类淋巴运输、溶质清除以及鞘内药物递送的动态增强MRI研究。

引言

大脑是体内代谢最活跃且最动态的器官之一，持续产生必须被高效清除的代谢废物，以维持正常的神经功能¹。代谢废物的积聚是神经退行性病变和脑衰老的典型特征²。类淋巴系统在这一清除过程中发挥核心作用，通过脑脊液（CSF）的大规模流动以及脑脊液与组织间液（ISF）的交换，促进代谢副产物和有毒废物的清除^3,4,5，该过程由星形胶质细胞终足上表达的水通道蛋白-4（AQP4）介导⁶。通过研究多种脑脊液示踪剂的运输，人们对脑脊液动力学已有了较为深入的理解。利用基于钆的对比剂（GBCA）进行的动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）特别适用于全脑范围内的示踪剂运输评估^7,8。该方法的临床相关性已在人类转化研究中得到证实。通过鞘内注射GBCA并进行连续MRI扫描，可用于评估人脑中的脑脊液动力学⁹。后续研究进一步证实了示踪剂在全脑范围内的运输及其过夜清除过程¹⁰。最近，该方法被用于揭示颅内压-容积储备能力降低的受试者以及特发性正常压力脑积水患者中动脉周围示踪剂运输受损的现象¹¹。这些研究确立了脑脊液示踪剂运输的DCE-MRI技术作为一种具有临床转化潜力的方法，并推动了严格、可重复的临床前方法的发展，以深入探究脑脊液动力学及废物清除调控机制。

小脑延髓池（ICM）插管常用于类淋巴系统研究中的示踪剂递送¹²然而，仅有约20%的钆基造影剂被递送 通过 此通路进入脑实质的物质大部分直接引流至脊髓或淋巴系统⁸这种方法还存在损伤小脑或脑干的风险，且在纵向研究中固定套管仍存在技术上的挑战。脑室内（ICV）套管植入已成为一种更为可靠的替代方案^13,14,15最近一项研究证明了其在递送荧光示踪剂方面的可重复性及主要优势，包括稳定的套管固定，可允许动物自由活动，并支持在纵向研究中进行多次示踪剂注射¹³.

尽管具有这些优势，现有的脑室插管（ICV）造影方案与磁共振成像（MRI）研究并不直接兼容¹⁶。由于脑室插管需要穿透脑实质，通常使用铁磁性插管，这会在MRI图像中产生严重的磁化率伪影。因此，示踪剂的灌注必须在扫描仪外进行，并在将动物转移至成像设备前移除插管。典型的工作流程包括：首先获取基线扫描图像，随后将动物移出以进行插管和示踪剂灌注，再重新安置动物以进行后续的动态扫描。这种中断式的工作流程无法实现连续的、以基线为参照的数据采集，并且会因动物重新定位而引入错位，从而干扰基于体素的动力学分析。更重要的是，由于示踪剂动力学的早期摄取阶段通常是变化最剧烈但持续时间最短的部分，在此关键时间段内进行动物转移和扫描仪准备将导致最具信息价值的数据丢失。

本文介绍了一种克服上述局限性的实验方案，该方案通过整合一种与磁共振成像（MRI）兼容的脑室内（ICV）输注管路，并具备在扫描仪内持续输送对比剂的能力，从而实现对啮齿类动物进行连续动态 MRI 采集。该方法能够在单次不间断的成像过程中，实现对脑脊液（CSF）示踪剂全脑运输过程的定量可视化 mapping。本方案适用于全脑脑脊液动力学、类淋巴系统运输及溶质清除动力学的研究。尽管本文以成年大鼠为例进行描述，但通过适当调整插管坐标和输注参数，该方案亦可适用于小鼠¹⁵。

方案

以下所述方案已获得凯斯西储大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）（A-3145-01-2023-0015）的批准，符合《实验动物照护与使用指南》及《公共卫生服务实验动物人道照护与使用政策》的要求。所用试剂与设备列于材料表中。

1. 输注管路的准备

1. 使用锯齿剪刀剪取一段30 mm长的铜套管和一段2 m长的聚乙烯（PE）管。
2. 在显微镜下，用30 G针头轻轻将PE管的一端扩张，然后将铜套管插入扩张端，并用氰基丙烯酸酯胶水固定连接处。将PE管的另一端连接至30 G针头。
   注意：铜材质延展性高；切割时注意不要压塌管腔。组装过程中避免变形套管或刺破管路。PE管的长度应足以使注射泵置于扫描仪边缘磁场之外。
3. 用脱气的示踪剂溶液填充套管-管路组件，并将其连接至50 µL Hamilton注射器。在注射器针头处缠绕聚四氟乙烯（PTFE）生料带以防止泄漏。操作过程中需小心，避免引入气泡。
4. 将Hamilton注射器安装到注射泵上，并从注射器中额外抽出30 µL示踪剂溶液。

2. 插管操作

1. 称取大鼠体重，并通过腹腔注射给予氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。通过脚趾夹捏反射确认麻醉深度充分；必要时追加初始剂量的三分之一，并在继续操作前重新检查。
2. 剃除头部和颈部毛发，清除松散的毛发，并用70%乙醇棉片对暴露的皮肤进行消毒。
3. 将大鼠固定于立体定位仪中，在动物身下放置覆盖吸水纸的加热垫。双眼涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。
4. 调整鼻夹使颅骨水平。沿中线做切口，用四个止血钳夹住并牵开皮肤，暴露前囟和后囟。在颅骨上滴加3%过氧化氢溶液，清除残留的骨膜，增强解剖标志的可见性。
   注意：准确的颅骨水平调整对于重复性定位埋管至关重要。作为一项实用的质量控制措施，比较前囟和后囟处的内外侧（ML）和背腹侧（DV）坐标：若颅骨已正确调平，则两个标志点在ML或DV轴上的差异均不应超过0.2 mm。
5. 将装有细钻头的电动钻安装至立体定位臂上，并确保该臂已牢固锁定。
6. 将钻头置于前囟位置，然后向后移动0.7 mm，向右移动1.4 mm。降低钻头直至接触颅骨表面，并记录DV坐标。
7. 在显微镜观察下，以0.1 mm为步长推进钻头。一旦穿透颅骨即刻停止（成年大鼠颅骨典型厚度为0.3–0.4 mm）。
8. 将立体定位臂上的钻头更换为预装好导管的埋管装置。短暂启动输注泵，使液体刚好从导管尖端渗出，以确认液体通路畅通无阻。
9. 确保导管垂直于颅骨表面，然后将其对准钻孔位置。以0.1 mm/s的速度将导管推进至最终目标深度，即硬脑膜表面以下3.5 mm处。
10. 在导管与颅骨交界处滴加一滴组织粘合剂。待其固化后，用缝线闭合头皮切口，并轻柔地将铜制导管沿颅骨表面弯曲，以避免与MRI线圈接触。

3. MRI 设置与动态采集

1. 将体积发射线圈置于扫描仪的等中心位置。
2. 将动物转移至俯卧位的磁共振成像兼容托架中。连接生理监测系统，包括呼吸传感器和直肠温度探头。开启循环温水浴，以维持体温在~37 °C.
3. 在整个扫描过程中，通过补充异氟烷来维持适当的麻醉状态 通过 鼻锥。调节异氟烷浓度在0.25%至1.0%之间，以维持呼吸频率为50–70次/分钟。
   注意：在插管手术前给予的氯胺酮-赛拉嗪麻醉在将动物初始转移至MRI托架期间仍具有残留镇静作用。扫描过程中应逐步引入异氟烷，并持续监测呼吸频率。
   警告：异氟烷是一种具有吸入危害的挥发性试剂；使用时需采用主动回收装置，并尽量减少人员暴露。
4. 将输注泵置于磁体边缘磁场外，设定输注速率为 1 µL/min 输注持续时间延长至20分钟，对应的总输注体积为 20 µL小心地将输液管路沿托架固定好，以防止张力和移位。
   警告：铁磁性物体在靠近磁共振成像（MRI）扫描仪时可能成为危险的抛射物。所有与MRI不兼容的设备必须置于边缘磁场区域之外。
5. 将表面阵列线圈直接安装在颅骨背侧，中心对准脑部。在线圈与切口部位之间放置一小块吸水纸，以吸收任何伤口渗出液。
6. 将床体推进磁体，直至大脑位于等中心位置。确认灌注管路和生理监测导线保持通畅无阻。
7. 执行初始扫描仪设置，并获取解剖图像以确认导管放置成功。
8. 在获取基线图像后，同时启动输注泵和动态扫描，并持续采集数据共计3小时（参见 表1 获取详情）。

结果

手术工作站经过配置，可精确定位钻孔位置以靶向侧脑室（前囟后0.7 mm，外侧1.4 mm；图1A、D）。输注管路由一段30 mm长的铜制套管、一段2 m长的PE导管以及连接至汉密尔顿注射器的30 G针头组成（图1B）。延长的导管长度允许将注射泵置于磁共振扫描仪边缘磁场之外。钻孔完成后，将预先装填好的输注管线安装至立体定位臂上，并将套管推进至侧脑室，深度为硬脑膜表面下3.5 mm（图1C）。固定后，将套管弯曲至与颅骨表面平行，以避免与MRI线圈接触（图1E）。

通过能够清晰显示脑室系统及套管轨迹的解剖图像，可以确认脑室内（ICV）套管置入的成功，可在矢状面（图2A）和轴状面（图2B）图像中直接观察...

讨论

本文所述方案结合了脑室内插管、扫描仪内灌注和动态磁共振成像，可在单次成像过程中实现对脑脊液示踪剂运输的全脑定量评估。脑室内（ICV）灌注的价值与局限性，需与小脑延髓池（ICM）灌注相比较才能得到最佳评价。ICM 灌注避免了穿透脑实质的插管操作，因此侵入性较小。然而，由于小脑延髓池位于脑脊液循环通路的中游位置，ICM 灌注（尤其是在较高灌注速率下）可能引起驱动脑脊液循环的压力梯度发生短暂性逆转¹⁷。更重要的是，经 ICM 注入的示踪剂会迅速分布至下游的蛛网膜下腔，并进一步进入血管周围间隙。尽管星形胶质细胞终足处的 AQP4 通道有助于脑脊液与组织间液（CSF-ISF）的交换，但由于钆类对比剂（GBCAs）分子体积较大，这些通道对其不具备通透性。因此，与脑室内灌注相比，经 ICM 注入的示踪剂在脑实质中表现出显著降低的对比增强效果¹⁵，使得 ICM 灌注在研究脑内溶质清除方面适用性较差。脑室内灌注通过将示踪剂输送至内源性脑脊液生成部位附近，克服了上述局限性^13,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30 G × 1 英寸带塑料柄皮下注射针头	Exel	26439
50 µL，气密型注射器，鲁尔接头（LT）	Hamilton	80901
解剖用窄头镊子	Fine Science Tools	11003-12
人工脑脊液	TOCRIS	3525
Attane 异氟烷 1000 mg/g	ScanVet	55226
铜质毛细管，外径 0.32 mm × 内径 0.16 mm	Nippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd.	C1220-11-109
铜夹	IEUYO	FEBA 1801
棉签	Puritan	868-WCS
Dotarem（钆特酸葡甲胺）注射液，0.5 mmol/mL	Guerbet	NDC 67684-2001-1
钻机	Foredom	Model SR
钻头	Fine Science Tools	19007-05
钻头夹持器	Stoelting	51630
Dumont 医用镊子	Fine Science Tools	11252-00, 11253-20
眼膏	Rugby	NDC 0536
E-Z Anesthesia EZ-7000 经典系统	E-Z Systems	EZ-7000
Graefe 镊子	Fine Science Tools	11052-10,11152-10
加热垫	Braintree Scientific	5381
高温电灼套装	Fine Science Tools	18010-00
Ketaminol Vet 100 mg/mL（氯胺酮）	Intervet International BV	511519
KWIK-SIL 硅胶粘合剂，低毒性，套装	World Precision Instruments	KWIK-SIL
5/8 英寸一次性无菌针头，26 G	BD	305115
聚乙烯导管，外径 0.61 mm × 内径 0.28 mm	Scandidact	SKU252
Rompin Vet 20 mg/mL（赛拉嗪）	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
手术刀片	Fine Science Tools	10023-00
剪刀	Fine Science Tools	91460-11, 14007-14
刮勺	Fine Science Tools	10090-13
立体定位仪	Stoelting	51600U
外科持针器	AgnTho’s	12502-12
注射泵	New era pump system	NE-4000
Xylocain 20 mg/mL（利多卡因）	AstraZeneca	158543