本研究提出了一种双中心双向队列工作流程，用于检测血清癌胚抗原、鳞状细胞癌抗原和糖类抗原125，并验证其在食管鳞状细胞癌中的联合诊断和预后价值。
本文内容
摘要
摘要
食管鳞状细胞癌在早期诊断和治疗前的准确分层方面仍存在困难。传统的肿瘤-淋巴结-转移（tumor-node-metastasis，TNM）分期提供了重要的解剖学信息，但未能充分反映循环中的生物学异质性。本研究是一项双中心双向观察性研究，开发并外部验证了一个联合血清生物标志物组合，该组合包含癌胚抗原（carcinoembryonic antigen）、鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen）和糖类抗原125（carbohydrate antigen 125），用于食管鳞状细胞癌的诊断鉴别和预后风险评估。研究共纳入来自一家三级医院和一家社区医疗中心的277名受试者，其中包括167例食管鳞状细胞癌患者、55例良性食管疾病患者和55名健康对照者。三级医院队列用于模型构建和内部验证，社区医疗中心队列用于外部验证。在初始治疗前采集血清生物标志物，进行对数转换，使用训练队列的参数进行标准化，并分别纳入诊断性逻辑回归模型和预后性Cox比例风险模型。与任一单独标志物相比，联合标志物组合在诊断区分能力上表现更优，在训练队列中受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.869，在外部验证队列中为0.842。较高的联合生物标志物负荷与肿瘤长度≥5 cm、pT3–4期病变、淋巴结转移以及TNM III–IV期疾病显著相关。在生存分析中，校正主要临床病理因素后，高联合生物标志物负荷可独立预测较差的总生存期和无进展生存期。将生物标志物负荷与临床病理变量整合的预后模型优于单独使用TNM分期，其训练队列的C指数为0.792，外部验证队列的C指数为0.761。这些结果支持将血清癌胚抗原、鳞状细胞癌抗原和糖类抗原125组合作为食管鳞状细胞癌治疗前评估和个体化风险分层的一种实用、无创的辅助手段。
引言
食管鳞状细胞癌是食管癌的主要组织学亚型，在东亚地区尤其是中国仍具有显著的临床负担1。尽管内镜诊断、影像学评估、手术、放化疗及全身治疗已改善了临床管理，但许多患者的预后仍不理想2。其中一个重要原因是该疾病常在局部浸润或淋巴结转移发生后才被发现3。另一个原因是相同肿瘤-淋巴结-转移分期的患者在治疗反应、复发风险和生存结局方面仍可能存在差异4。这些差异表明，仅靠解剖学分期无法充分描述食管鳞状细胞癌的生物学异质性。
目前的临床评估主要依赖内镜活检、影像学分期以及术后病理评估。这些方法虽不可或缺，但在重复监测、治疗前风险评估或广泛筛查中存在局限性。内镜检查具有侵入性，不适合频繁随访；而计算机断层扫描和内镜超声检查可能遗漏微小浸润或较小的转移病灶5。基于影像和分子的预后模型已提高了食管鳞状细胞癌的风险预测能力，但许多模型需要专用平台、图像后处理、组织测序或计算流程，而这些在所有临床实验室中并未常规具备6,7。因此，一种低成本且可重复的血液检测方法可能提供有价值的补充信息，特别是在临床医生需要在确定性治疗前进行治疗前风险分层时。
血清肿瘤标志物在这一背景下具有吸引力，因为它们常规可及、创伤小且易于重复检测。癌胚抗原反映肿瘤负荷和细胞异常分化，而鳞状细胞癌抗原则更密切地与鳞状上皮的恶性转化相关8。糖类抗原125已被证实与多种恶性肿瘤的全身炎症反应、浆膜受累及疾病进展相关9。这些标志物并不代表相同的生物学信号，相反，它们可能捕捉到肿瘤负荷、鳞状表型、全身反应以及宿主-肿瘤相互作用中部分重叠但又各自独立的多个维度。因此，当目标是识别食管鳞状细胞癌并评估临床风险时，联合检测多种标志物可能优于任一单一标志物10。
既往研究已评估了血清肿瘤标志物、炎症指标、影像学特征、分子谱型以及复合预后模型在食管鳞状细胞癌及相关胃肠道肿瘤中的应用11,12。然而，许多已发表的模型仅关注诊断或预后之一，采用单中心队列，缺乏独立的外部验证，或对标志物转换、截断值选择、校准及模型可重复性等方面提供的细节有限。本研究的创新之处在于开发了一个实用的三标志物血清检测组合，通过常规检测的癌胚抗原（carcinoembryonic antigen）、鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen）和糖类抗原125（carbohydrate antigen 125），在一个双中心工作流程中同时支持诊断鉴别和预后风险分层。该模型首先在一家三级医院队列中建立，随后在未经重新优化的情况下于一个独立的社区医疗中心队列中进行验证，从而评估其在不同临床环境下的稳定性。
本研究开发并验证了一种基于癌胚抗原、鳞状细胞癌抗原和糖类抗原125的联合血清生物标志物组合。分析遵循两个相互关联的研究目标：第一，评估与单个血清标志物相比，该联合组合是否能更有效地提高食管鳞状细胞癌与非恶性对照之间的诊断区分能力；第二，确定治疗前联合生物标志物负荷是否能够提供超出传统临床病理变量和肿瘤-淋巴结-转移分期的预后信息。该研究设计使得能够评估一种常规可获取的血清生物标志物组合是否可在治疗前临床评估中作为病理诊断、影像学评估和解剖学分期的无创辅助手段。
方案
本研究涉及人类参与者、临床记录和血清样本，遵循《赫尔辛基宣言》以及人类受试者研究的机构要求进行13。研究方案经江苏省中医院伦理审查批准，批准编号为CJ28J12-45。对于回顾性收集的匿名临床数据和剩余血清样本，根据机构伦理规定，免除额外书面知情同意的要求。对于前瞻性收集的样本，在入组前均获得了书面知情同意。所有参与者信息和血清样本在分析前均已匿名化处理。研究标识符用于数据关联，分析数据集中不包含任何个人身份信息。
研究设计与队列分配
这项双中心双向观察性研究评估了联合血清生物标志物组合（包括癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和糖类抗原125（CA125））在食管鳞状细胞癌（ESCC）中的诊断和预后价值。回顾性数据来自符合条件的临床记录和治疗前剩余血清样本，前瞻性入组用于在同一研究框架内收集额外的治疗前血清样本并完成随访。研究对象于2021年1月至2024年12月期间从一家三级医院和一家社区医疗中心招募，随访持续至2025年12月31日。A中心为三级医院，作为训练队列用于模型构建、系数估计、截断值选择及内部验证；B中心为社区医疗中心，作为外部验证队列。本研究的报告遵循个体预后或诊断多变量预测模型透明报告（TRIPOD）指南14。
共纳入277名参与者，其中194名来自中心A，83名来自中心B。训练队列包括114例食管鳞状细胞癌（ESCC）患者、40例良性食管疾病对照者和40例健康对照者。外部验证队列包括53例ESCC患者、15例良性食管疾病对照者和15例健康对照者。采用基于中心的分配方式而非随机拆分，以减少信息泄露，并在独立的临床环境中检验模型的稳定性。诊断分析比较了ESCC患者、良性食管疾病患者和健康对照者之间的血清癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和糖类抗原125（CA125）水平。预后分析仅限于ESCC患者，评估联合生物标志物负荷是否能改善总体生存期（OS）和无进展生存期（PFS）的风险分层。研究设计、参与者筛选、队列分配、血清生物标志物工作流程、诊断模型构建、外部验证及预后模型比较详见图1。
研究流程包括筛选、排除、诊断分组和基于中心的分配。共筛查了326名个体。49名个体被排除，其中包括12名在采血前接受过抗肿瘤治疗者、8名患有其他原发性恶性肿瘤者、9名患有严重感染、自身免疫性疾病或可能影响血清肿瘤标志物的未控制合并症者、11名存在溶血、脂血、黄疸干扰、血清量不足或处理间隔过长者，以及9名缺乏关键临床、病理或随访数据者。最终分析人群共包括277名参与者：167名食管鳞状细胞癌（ESCC）患者、55名良性食管疾病对照者和55名健康对照者。
样本量依据
样本量由预设研究期间符合条件的受试者、治疗前血清样本及随访信息的连续可获得性确定。诊断模型采用三个连续型血清生物标志物作为候选预测因子。在训练队列中，共有114例食管鳞状细胞癌（ESCC）病例和80例非ESCC对照，相当于每个候选生物标志物预测因子对应38.0例ESCC病例和26.7例非ESCC对照。该样本量支持低维逻辑回归分析，并降低了过拟合风险。外部验证队列包含53例ESCC病例和30例非ESCC对照，仅用于模型验证，不进行系数重新估计。样本量的设定依据符合当前预测模型的基本原则，强调结局事件频率、候选预测参数数量、预期模型性能以及独立验证，而非随机数据划分15。
参与者招募、纳入标准及数据收集
在研究期间连续纳入受试者。在A中心，食管鳞状细胞癌（ESCC）患者来自胸外科、消化内科和肿瘤科。在B中心，通过基于社区的筛查、随访记录或转诊途径确定ESCC患者，仅在获得病理学确诊且有治疗前血清样本的情况下纳入研究。良性食管疾病对照组纳入因吞咽困难、反流症状或疑似食管异常而接受胃镜检查且病理结果为非恶性病变的个体。健康对照组选自同期进行常规健康体检的个体，无恶性肿瘤病史、活动性感染、严重肝肾功能障碍，或影像学/内镜检查显示食管占位性病变证据。
如果食管鳞状细胞癌（ESCC）患者经胃镜活检或术后病理学检查确诊为原发性ESCC，采血前未接受过抗肿瘤治疗，并且具有完整的基线临床资料、病理记录和治疗前血清样本，则符合入组条件。若患者存在其他原发性恶性肿瘤、采血前曾接受抗肿瘤治疗、严重急性感染、活动性自身免疫性疾病、可能影响血清肿瘤标志物水平的未控制合并症、明显溶血、脂血、黄疸干扰、血清量不足、关键临床变量缺失或无法获得随访数据，则予以排除。预后分析仅限于具有可获取的肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期以及可测量的生存或疾病进展结局的ESCC患者。随访时间短于6个月的患者，若在此期间内发生死亡或疾病进展，则仍予以保留。
基线变量包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、体重指数、参与中心、诊断分组、病变类型以及血清癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和糖类抗原125（CA125）水平。对于食管鳞状细胞癌（ESCC）患者，额外变量包括肿瘤位置、肿瘤长度、组织学分化程度、浸润深度、淋巴结状态、TNM分期、淋巴管血管浸润、初始治疗方式、复发情况、疾病进展、生存状态及末次随访日期。吸烟史定义为当前吸烟或 lifetime 内曾规律吸烟至少100支。饮酒史定义为每周至少饮酒一次，持续超过6个月。TNM分期依据美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟（AJCC/UICC）食管癌分期系统第8版确定16。ESCC病例及良性病变的病理切片由两名高级病理学家独立复核，如有分歧，则由第三位病理学家裁定。
两名经过培训的研究人员根据预定义的数据字典，独立从电子病历、病理报告、实验室信息系统、治疗记录、随访记录和死亡登记记录中提取临床信息。差异通过核对原始记录进行解决，必要时由第三名研究人员做出最终决定。肿瘤位置分为上段、中段或下段胸段食管。组织学分化程度分为高分化、中分化或低分化。在分析前，两个参与中心的连续变量单位已进行标准化。
血液采样、血清处理及生物标志物检测
所有血液样本均在初始治疗前采集，即病理确诊后7天内，且至少在治疗开始前3天完成采集。采集时间为早晨7:00至9:00之间，在前一晚禁食后采集5–8 mL外周静脉血，使用血清分离管。若受试者在采样前72小时内接受过输血、大剂量白蛋白输注或侵入性操作，则推迟采样。样本于室温静置凝固30分钟，随后在1,500 × g 条件下离心10分钟。血清被分离后分装至3–5个带有条形码标记的冻存管中，每管含300–500 µL。分装后的样本储存于−80°C直至检测，且每份样本仅允许经历一次冻融循环。若样本出现明显溶血、脂血、黄疸干扰、体积不足，或从采集到冷冻间隔超过2小时，则予以排除。
根据制造商说明书，采用自动化学发光免疫分析系统检测血清癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和糖类抗原125（CA125）。检测前，血清分装样本在4°C条件下解冻，轻轻混匀，并尽可能在同一次运行中完成分析。若需进行批次检测，则对样本顺序进行合理安排，以避免按疾病状态、研究中心、病理分期或随访结果出现系统性分组。对于超出分析测量范围的样本，依据试剂说明书进行稀释后重新检测。实验室工作人员对受试者的分组情况、病理分期、治疗状态及随访结果均设盲。
根据本地实验室标准和制造商提供的参考范围，临床界值分别为：CEA 5.0 ng/mL、SCC-Ag 1.5 ng/mL 和 CA125 35 U/mL。这些界值用于定义标志物升高以及高复合生物标志物负荷，以进行临床病理关联分析和生存分层分析。在诊断分类中，仅在训练队列中使用Youden指数选择数据驱动的截断值，随后将其直接应用于外部验证队列。检测前进行仪器校准和内部质量控制。每次检测当天均包含高值和低值质控样本，且仅在质控结果处于可接受范围内时才进行检测。
在最终模型分析之前，使用盲法桥接血清等分试样和常规质控材料评估了不同检测间和不同中心间的可重复性。一组包含30份盲法血清等分试样的桥接样本在两个实验室工作流程中进行了检测。不同中心间的变异系数分别为：CEA 4.8%，SCC-Ag 5.6%，CA125 5.1%。相应的组内相关系数分别为：CEA 0.94，SCC-Ag 0.92，CA125 0.93。由于未发现系统性偏差超出预设的实验室质控范围，因此未对任一中心的检测进行特异性重新校准。在模型构建前，最终的生物标志物数值通过单位标准化以及基于训练队列的统计学标准化进行了数据整合。
生物标志物联合定义与模型构建
联合血清生物标志物组合包括癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和糖类抗原125（CA125）。在进行临床病理特征关联分析和Kaplan-Meier生存分层时，每种标志物根据预设的临床阈值被分类为升高或未升高。高联合生物标志物负荷定义为三种标志物中至少有两种升高。在诊断和预后模型构建中，这三种生物标志物作为连续变量保留，使用自然对数进行转换，并利用训练队列的均值和标准差进行标准化。相同的转换参数应用于外部验证队列。
采用以下训练队列参数计算标准化的对数转换生物标志物：
zlnCEA = (lnCEA - 1.42)/0.71
zlnSCC - Ag = (lnSCC - Ag - 0.28)/0.57
zlnCA125 = (lnCA125 - 3.05)/0.62
采用多变量逻辑回归在训练队列中构建联合诊断组合。诊断线性预测值的计算方法如下：
LP诊断 = -0.46 + 0.59 × zlnCEA + 1.05 × zlnSCC - Ag + 0.42 × zlnCA125
食管鳞状细胞癌的个体预测概率按如下方法计算：
PESCC = 1/1+exp(-LPdiagnostic)
联合检测组合的最佳诊断界值为0.57，该界值在训练队列中使用Youden指数确定，并在外部验证中直接应用而未作更改。
预后生物标志物评分采用Cox比例风险模型构建。TNM分期单独模型被用作解剖学分期的比较基准。生物标志物模型采用了联合生物标志物负荷。临床病理模型纳入了年龄、肿瘤长度、组织学分化程度、pT分期、淋巴结状态和初始治疗方式。整合模型在临床病理模型基础上增加了高联合生物标志物负荷。对于总生存期（OS），整合预后线性预测因子的计算方法如下：
LPOS = 0.33 × 年龄 ≥65 岁 + 0.36 × 肿瘤长度 ≥5 cm + 0.25 × 分化差 + 0.31 × pT3
- 4期 + 0.66 × 淋巴结转移
-0.58 × 根治性手术为基础的治疗
+0.81 × 高度联合生物标志物负荷
对于无进展生存期（PFS），整合的预后线性预测因子按如下方式计算：
LPPFS = 0.27 × 年龄 ≥ 65岁 + 0.31 × 肿瘤长度 ≥ 5cm + 0.24 × 分化差 + 0.25 × pT3
-4阶段 + 0.55 × 淋巴结转移
- 0.46 × 以根治性手术为基础的治疗
+0.71 × 高度联合生物标志物负荷
预后方程中的所有二元变量均在存在时编码为1，不存在时编码为0。所有系数、标准化参数和截断值均在训练队列中估计，并直接应用于外部验证队列，无需重新优化。
诊断与预后终点
病理诊断被用作诊断的参考标准。主要诊断终点为区分食管鳞状细胞癌（ESCC）与非ESCC对照组，包括良性食管疾病患者和健康对照者。次要诊断终点包括区分ESCC与良性食管疾病、ESCC与健康对照者，以及早期ESCC与非恶性对照者。早期ESCC定义为TNM I–II期疾病。诊断性能通过受试者工作特征曲线、曲线下面积、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确率、F1分数、精确率-召回率曲线、校准曲线、Brier评分、校准截距、校准斜率以及决策曲线分析进行评估。
仅对食管鳞状细胞癌（ESCC）患者进行预后分析。主要预后终点为总生存期（OS），定义为首次确定性抗肿瘤治疗日期至因任何原因死亡的时间间隔。次要预后终点为无进展生存期（PFS），定义为从首次治疗开始至疾病进展、复发或死亡的时间间隔。对于接受根治性手术的患者，若术后无残留病灶，则局部复发、远处转移或肿瘤相关死亡均计为PFS事件。对于接受根治性化疗放疗或姑息治疗的患者，疾病进展根据影像学检查、内镜评估及临床评价确定。
随访数据通过门诊就诊记录、住院记录、社区随访记录、转诊记录以及电话联系获得。治疗后前2年内每3个月随访一次，第3至第5年每6个月随访一次，此后每年随访一次。截至末次随访日期仍无死亡、复发或进展的患者，以其最后确认的联系时间作为删失时间。结局事件由两名研究者独立审核。当不同来源的事件日期存在差异时，通过核对影像学报告、出院记录、内镜报告、转诊文件及死亡登记记录来确定最终的事件日期。两家参与中心的随访截止日期均为2025年12月31日。
统计学分析
采用 R 4.3.2 和 SPSS 27.0 进行统计分析。连续变量根据分布情况以均值 ± 标准差或中位数（四分位间距）表示。分类变量以频数和百分比表示。组间比较根据数据特征适当采用独立样本 t 检验、Mann–Whitney U 检验、单因素方差分析、Kruskal–Wallis 检验、卡方检验或 Fisher 精确检验。在构建模型前对缺失数据进行评估。根据预设的纳入标准，排除关键诊断状态、治疗前生物标志物值、TNM 分期或生存/进展结局数据缺失的受试者。对于缺失率低于 5.0% 的非关键协变量，采用链式方程多重插补法处理，生成 20 个插补数据集，迭代 20 次17。插补模型包括诊断分组、研究中心、年龄、性别、吸烟史、饮酒史、生物标志物值、TNM 分期、治疗方式、总生存状态、无进展生存状态及随访时间。同时进行完全病例分析作为敏感性分析。
诊断模型在训练队列中建立。采用受试者工作特征曲线计算曲线下面积、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确率和F1分数。使用DeLong检验比较曲线下面积18。以精确率-召回率曲线作为补充的诊断评估手段。通过校准曲线、Brier评分、校准截距和校准斜率评估模型校准度。采用决策曲线分析评估临床实用性19。通过1,000次自助法重采样进行内部验证，以估计经乐观校正的区分能力和校准性能。外部验证则直接将训练队列所得方程、标准化参数和截断值应用于中心B，不进行重新拟合。
在预后分析中，采用Kaplan–Meier曲线比较不同生物标志物负荷组之间的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS），并使用log-rank检验评估生存差异。采用Cox比例风险回归模型估算风险比及95%置信区间。将具有临床相关性的变量以及单变量分析中与结局相关的变量纳入多变量模型。模型性能通过Harrell的C指数、时间依赖性受试者工作特征曲线、校准曲线、Brier评分和决策曲线分析20进行评估。预后校准在1年、3年和5年时点进行评估。通过Schoenfeld残差和log-minus-log生存图检验比例风险假设21。全局Schoenfeld检验的P值在OS模型中为0.42，在PFS模型中为0.37。在最终模型解释前，采用方差膨胀因子评估多重共线性，最终诊断和预后模型中的所有候选变量的方差膨胀因子均低于2.1。使用净重新分类改善和综合判别改善评估模型相较于TNM分期及传统临床病理模型的额外预后价值。训练队列中估计的模型参数直接应用于外部验证队列，无需重新拟合22。所有检验均为双侧检验，P < 0.05被认为具有统计学显著性。
结果
受试者流程与检测重复性
共筛查了326名个体，其中49名被排除：12名在采血前已接受过抗肿瘤治疗，8名患有其他原发性恶性肿瘤，9名患有严重感染、自身免疫性疾病或可能影响血清肿瘤标志物的未控制合并症，11名存在溶血、脂血、黄疸干扰、血清量不足或样本处理间隔过长，9名缺少关键的临床、病理或随访数据。最终分析人群共277名参与者：167名为食管鳞状细胞癌（ESCC）患者，55名为良性食管疾病患者，55名为健康对照者。中心A提供了194名参与者组成训练队列，中心B提供了83名参与者组成外部验证队列。参与者流程、队列分配、生物标志物检测流程、诊断模型构建、外部验证及预后建模框架见图1，筛选与排除详情汇总于补充表1。
使用30份设盲的桥接血清等分试样评估了不同检测间和不同中心间的可重复性。癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和糖类抗原125（CA125）的中心间变异系数分别为4.8%、5.6%和5.1%。相应的组内相关系数分别为0.94、0.92和0.93。在进行统计学标准化和模型构建之前，无需针对特定中心进行重新校准。检测可重复性结果见补充表2。
研究人群的基线特征
总体人群的中位年龄为59岁（IQR，53–66岁），其中男性参与者198人（71.5%）。有当前或既往吸烟史者141人（50.9%），有当前或既往饮酒史者127人（45.8%）。队列中包括167例食管鳞状细胞癌（ESCC）患者（60.3%）、55例良性食管疾病患者（19.9%）和55例健康对照者（19.9%）。血清CEA、SCC-Ag和CA125的中位水平分别为3.9 ng/mL（IQR，2.0–6.6 ng/mL）、1.4 ng/mL（IQR，0.8–2.3 ng/mL）和22.8 U/mL（IQR，13.9–35.7 U/mL）。年龄、性别、吸烟史、饮酒史、诊断分组以及基线血清生物标志物水平在训练队列和外部验证队列之间具有可比性（表1）。
在167例食管鳞状细胞癌（ESCC）患者中，中位年龄为61岁（四分位距，55–68岁），其中133例患者（79.6%）为男性。肿瘤最常位于胸中段食管（89/167，53.3%），其次为胸下段食管（56/167，33.5%）和胸上段食管（22/167，13.2%）。中分化和低分化肿瘤分别占81例（48.5%）和66例（39.5%）。68例患者（40.7%）的肿瘤长度至少为5 cm，121例患者（72.5%）为pT3–4期疾病，100例患者（59.9%）存在淋巴结转移，111例患者（66.5%）表现为肿瘤-淋巴结-转移（TNM）III–IV期疾病。65例患者（38.9%）发现淋巴管血管侵犯。113例患者（67.7%）的初始治疗为根治性手术联合或不联合辅助治疗，32例患者（19.2%）接受根治性放化疗，22例患者（13.2%）接受姑息性全身治疗或支持治疗。训练队列与外部验证队列ESCC患者的基线临床病理学特征具有可比性（表2）。
各研究组间血清生物标志物的多维度分布
血清CEA、SCC-Ag和CA125在食管鳞状细胞癌（ESCC）患者、良性食管疾病对照组和健康对照组之间的分布存在差异（图2）。经对数转换后，这三种生物标志物在ESCC组中的水平均高于两个非恶性组。ESCC患者的中位CEA水平为5.2 ng/mL，而良性食管疾病对照组为2.4 ng/mL，健康对照组为1.9 ng/mL。ESCC患者的中位SCC-Ag水平为1.9 ng/mL，而其他两组分别为0.9 ng/mL和0.7 ng/mL。ESCC患者的中位CA125水平为28.9 U/mL，而其他两组分别为18.7 U/mL和16.1 U/mL。各组血清生物标志物分布情况总结于补充表3中。
CEA 和 SCC-Ag 在区分食管鳞状细胞癌（ESCC）与非恶性对照组方面，比 CA125 表现出更清晰的区分能力。在经对数转换的 CEA 和 SCC-Ag 的二维分布图中，ESCC 样本更多地集中在高值区域，而健康对照组则更多地聚集在低值区域。高复合生物标志物负荷（定义为三种标志物中至少有两种升高）在 167 例 ESCC 患者中有 61 例（36.5%），55 例良性食管疾病对照中有 8 例（14.5%），55 例健康对照中有 4 例（7.3%）。三组间升高的生物标志物负荷分布差异具有显著性（P < 0.001），如补充表 3中所报道。
训练队列中联合诊断标志物的开发
联合诊断标志物在训练队列中通过CEA、SCC-Ag和CA125的对数转换值建立（图3）。两两相关性分析显示这三种标志物之间存在中等程度的正相关关系。其中CEA与SCC-Ag之间的相关性最强（r = 0.58），其次是SCC-Ag与CA125（r = 0.47）以及CEA与CA125（r = 0.41），表明支持将这些标志物联合建模，但不将其视为可互换的检测指标。
在单变量逻辑回归分析中，CEA、SCC-Ag 和 CA125 均与食管鳞状细胞癌（ESCC）状态相关，其比值比分别为 2.81、3.94 和 2.14。在多变量诊断模型中，SCC-Ag 的校正效应量最大（OR，2.87；95% CI，1.62–5.09；P < 0.001），其次是 CEA（OR，1.80；95% CI，1.19–2.72；P = 0.006）和 CA125（OR，1.52；95% CI，1.03–2.25；P = 0.034）。诊断模型的系数汇总于补充表 4。最终的诊断线性预测公式为：
LP诊断 = -0.46 + 0.59 × zlnCEA + 1.05 × zlnSCC - Ag + 0.42 × zlnCA125
食管鳞状细胞癌（ESCC）的个体预测概率计算公式如下：
PESCC = 1/1 + exp( -LP诊断 )
联合诊断模型预测的概率分布显示，食管鳞状细胞癌（ESCC）患者与非ESCC参与者之间存在明显区分。最佳截断值为0.57。在此截断值下，联合模型在训练队列中的受试者工作特征曲线下面积（AUC）达到0.869（95% CI，0.817–0.921），阳性预测值为85.8%，阴性预测值为73.0%。
联合生物标志物组合的诊断性能及外部验证
在训练队列中，SCC-Ag 在三种单独生物标志物中显示出最高的诊断效能，其 AUC 为 0.802（95% CI，0.735–0.869）。CEA 和 CA125 的 AUC 分别为 0.711（95% CI，0.635–0.786）和 0.668（95% CI，0.591–0.744）。联合检测组合实现了最高的总体区分能力，AUC 为 0.869（95% CI，0.817–0.921），敏感性为 79.8%，特异性为 81.2%，阳性预测值为 85.8%，阴性预测值为 73.0%，准确率为 80.4%，F1 得分为 82.7%（表 3）。
受试者工作特征曲线证实，与单个生物标志物相比，联合检测组合具有更高的诊断区分能力（图 4A）。在最佳截断值 0.57 时，该联合检测组合的敏感性为 79.8%，特异性为 81.2%。联合检测组合的曲线下面积（AUC）显著高于单独使用 SCC-Ag 的情况（P = 0.032）。通过 1,000 次重采样的自助法内部验证显示，校正乐观偏倚后的 AUC 为 0.856，校正乐观偏倚后的校准斜率为 0.97，校正乐观偏倚后的 Brier 评分为 0.154。内部验证结果详见补充表 4。
在外部验证队列中，精确率-召回率分析显示，该模型在区分食管鳞状细胞癌（ESCC）与健康对照组时具有最高的平均精确率（AP = 0.912；图4B）。ESCC与非ESCC组之间的平均精确率为0.863，ESCC与良性食管疾病组之间的平均精确率为0.841。早期ESCC与非恶性对照组之间的平均精确率为0.535。校准分析显示，两个队列中预测概率与实际观察结果之间具有良好一致性（图4C）。训练队列的Brier评分为0.148，校准斜率为1.02，截距为0.01。在外部验证队列中，Brier评分为0.164，校准斜率为0.93，校准截距为−0.04。决策曲线分析显示，在大多数概率阈值下，联合检测组相比“全部治疗”和“全部不治疗”策略均具有更高的净收益（图4D）。
外部验证结果总结于表4中。该联合检测组在区分食管鳞状细胞癌（ESCC）与非ESCC时，AUC为0.842（95% CI，0.753–0.930），敏感性为75.5%，特异性为76.7%，准确率为75.9%，Brier评分为0.164，校准斜率为0.93，在阈值概率为0.30时净收益为0.218。在区分ESCC与良性食管疾病时AUC为0.801（95% CI，0.686–0.916），在区分ESCC与健康对照时AUC为0.889（95% CI，0.800–0.979），在区分早期ESCC与非恶性对照时AUC为0.818（95% CI，0.704–0.932）。ESCC与健康对照相比具有最高的特异性（86.7%），而早期ESCC与非恶性对照相比的敏感性为70.6%，特异性为78.3%。
食管鳞状细胞癌中联合生物标志物组合的临床病理学关联特征
在食管鳞状细胞癌患者中评估了血清生物标志物升高与临床病理特征之间的关联（表5）。年龄和性别与单个生物标志物升高之间的关联较弱。年龄≥65岁的患者具有较高复合生物标志物负荷的比例高于年龄<65岁的患者（47.6% vs. 29.8%；P = 0.028），而性别与单个生物标志物升高或复合生物标志物负荷均无关联。
与生物标志物升高相关性更强的为肿瘤相关变量。肿瘤长度不小于5 cm的患者中，有50.0%存在高复合生物标志物负荷，而肿瘤长度小于5 cm的患者中该比例为27.3%（P = 0.004）。高复合生物标志物负荷在分化程度差的患者中也比分化良好或中等分化的患者中更常见（50.0% vs. 28.2%；P = 0.006）；在pT3–4期患者中比pT1–2期患者中更常见（42.1% vs. 21.7%；P = 0.011）；在有淋巴结转移的患者中比无淋巴结转移的患者中更常见（43.0% vs. 26.9%；P = 0.038）；以及在TNM III–IV期患者中比TNM I–II期患者中更常见（43.2% vs. 23.2%；P = 0.009）。
患者水平的可视化分析显示，较高的综合风险评分伴随着更晚期的临床病理学特征（图5A）。评分较高的患者更常被归类为pT3–4期、淋巴结阳性、低分化或TNM III–IV期。箱线图分析显示，在肿瘤长度较大、分化程度低、pT3–4期、淋巴结阳性以及TNM III–IV期的患者中，生物标志物的分布水平更高（图5B）。桑基图显示，具有两种或三种升高生物标志物的患者更常被归类为TNM III–IV期，而无升高生物标志物的患者则更常被归类为TNM I–II期（图5C）。综合生物标志物负荷与TNM分期分布之间的关联具有统计学意义（P < 0.001）。
基于联合血清生物标志物组合的预后分层
食管鳞状细胞癌（ESCC）患者的中位随访时间为34个月。随访期间共记录到78例死亡事件和96例无进展生存事件。随访及事件详情汇总于补充表5中。高复合生物标志物负荷与较差的生存结局相关。在单变量Cox回归分析中，高复合生物标志物负荷与死亡风险增加相关（HR，2.91；95% CI，1.89–4.46；P < 0.001），以及疾病进展或死亡风险增加（HR，2.63；95% CI，1.80–3.84；P < 0.001）。在对年龄、肿瘤长度、分化程度、pT分期、淋巴结转移及治疗方式进行校正后，高复合生物标志物负荷仍独立地与总生存期（OS；HR，2.24；95% CI，1.41–3.54；P = 0.001）和无进展生存期（PFS；HR，2.03；95% CI，1.35–3.05；P = 0.001）相关。相比之下，当癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和糖类抗原125（CA125）分别单独纳入多变量模型时，其统计学意义不再显著。Cox回归分析结果汇总于表6中。
Kaplan–Meier 分析显示，高、低联合生物标志物负荷组之间存在明显分离（图 6A、B）。低负荷组的中位总生存期为 38 个月，高负荷组为 19 个月（log-rank P < 0.001）。低负荷组的中位无进展生存期为 28 个月，高负荷组为 13 个月（log-rank P < 0.001）。整合预后模型的时间依赖性判别能力优于单独的 TNM 分期（图 6C），其 1、3 和 5 年的 AUC 分别为 0.829、0.806 和 0.781，而单独 TNM 分期分别为 0.701、0.676 和 0.648。与单独 TNM 分期相比，训练队列中 C 指数提高了 0.130，外部验证队列中提高了 0.120。随访标志点热图显示，各风险分层中的累积死亡率逐渐上升（图 6D）。在低风险三分位组中，6、12、24、36 和 60 个月时的累积死亡概率分别为 6%、12%、24%、37% 和 52%。在中等风险三分位组中，相应概率分别为 14%、26%、44%、59% 和 74%；在高风险三分位组中，分别为 28%、47%、68%、82% 和 91%。
整合模型的外部验证及增量预后价值
在两个队列中，整合模型在所有评估模型中表现出最高的预后区分能力。在训练队列中，整合模型的C指数为0.792，而临床病理模型为0.736，生物标志物组合单独使用为0.703，仅TNM分期为0.662。在外部验证队列中，整合模型的C指数为0.761，而其他模型分别为0.708、0.681和0.641。时间依赖性AUC结果也支持整合模型。在训练队列中，整合模型在1年、3年和5年的AUC分别为0.829、0.806和0.781；在外部验证队列中，相应的AUC分别为0.801、0.774和0.748。与仅使用TNM分期相比，整合模型的净重分类改善指数（NRI）为+0.274，综合判别改善指数（IDI）为+0.102。Bootstrap内部验证显示，整合模型的乐观校正C指数为0.779。模型性能指标见表7，额外的预后验证结果见补充表5。
模型比较图显示，在两个队列中，整合模型的Harrell’s C指数最高（图7A）。列线图纳入了年龄、肿瘤长度、组织学分化程度、pT分期、淋巴结状态、初始治疗方式以及高联合生物标志物负荷，用于估计1年、3年和5年的总生存率（OS）概率（图7B）。在外部验证队列中，1年、3年和5年OS的校准曲线均接近理想参考线（图7C）。Brier评分分别为0.141、0.164和0.178，校准斜率分别为0.97、0.93和0.91。决策曲线分析显示，在主要阈值概率范围内，整合模型的净获益高于仅使用TNM分期、临床病理模型以及“全部治疗”或“全部不治疗”策略（图7D）。在阈值概率为0.30时，整合模型的净获益为0.181，而临床病理模型为0.139，仅TNM分期为0.117。上述校准和决策曲线结果汇总于补充表5中。
数据可用性：
本研究期间生成和分析的数据集可公开获取，存放于 Figshare 仓储中：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33154580.v1。
图1：研究设计与分析流程。参与者筛选、队列分配、血清生物标志物检测、诊断模型构建、外部验证及预后模型建立的示意图。中心A作为训练队列，中心B作为外部验证队列。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：不同研究组中血清 CEA、SCC-Ag 和 CA125 的分布情况。（A）小提琴图与箱线图显示食管鳞状细胞癌患者、良性食管疾病对照组及健康对照组中经对数转换的血清生物标志物水平。（B）对数转换后的 CEA 与 SCC-Ag 的双变量分布。（C）雷达图总结不同诊断组中多种生物标志物联合分布特征。（D）不同诊断组中升高的生物标志物负荷分布。CEA = 癌胚抗原；SCC-Ag = 鳞状细胞癌抗原；CA125 = 糖类抗原 125；ESCC = 食管鳞状细胞癌。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：训练队列中联合诊断标志物的建立。（A）CEA、SCC-Ag 和 CA125 对数转换后的相关性热图。（B）单变量及多变量逻辑回归分析结果，包括各单独生物标志物及联合诊断模型。（C）基于联合诊断模型的食管鳞状细胞癌（ESCC）患者与非 ESCC 参与者的预测概率分布。请点击此处查看该图的高清版本。
图4：联合生物标志物组合的诊断性能及外部验证。（A）训练队列中单个生物标志物与联合组合的受试者工作特征曲线比较。（B）不同外部验证场景下的精确率-召回率曲线。（C）训练队列与外部验证队列的校准图。（D）决策曲线分析显示在不同阈值概率下的净获益。ROC = 受试者工作特征曲线。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：联合生物标志物组合在食管鳞状细胞癌（ESCC）中的临床病理学关联谱。 (A) 联合风险评分、血清生物标志物水平及临床病理特征的患者层面图谱。(B) 主要临床病理亚组中生物标志物分布的箱线图。(C) 显示生物标志物负荷升高与TNM分期之间关系的桑基图。TNM = 肿瘤-淋巴结-转移（tumor-node-metastasis）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：基于综合生物标志物负荷的预后分层。（A）根据综合生物标志物负荷绘制的总生存期Kaplan-Meier曲线。（B）根据综合生物标志物负荷绘制的无进展生存期Kaplan-Meier曲线。（C）比较整合模型与单独TNM分期的时间依赖性受试者工作特征曲线。（D）显示不同风险三分位数及随访时间点累积死亡概率的热图。OS = 总生存期；PFS = 无进展生存期。 请点击此处查看该图的高清版本。
图7：整合预后模型的外部验证与临床转化。（A）在训练队列和外部验证队列中，不同预后模型的Harrell’s C指数比较。（B）列线图，整合了年龄、肿瘤长度、组织学分化程度、pT分期、淋巴结状态、初始治疗方式以及高联合生物标志物负荷，用于估计1年、3年和5年的总生存率。（C）1年、3年和5年总生存率的外部验证校准图。（D）决策曲线分析，比较整合模型与仅TNM分期、临床病理模型以及“全部治疗”或“全部不治疗”策略的临床净收益。请点击此处查看此图的放大版本。
| 变量 | 总体 (n = 277) | 训练队列，中心 A (n = 194) | 外部验证队列，中心 B (n = 83) | P 值 |
| 年龄，岁，中位数 (IQR) | 59 (53–66) | 59 (52–65) | 60 (54–67) | 0.284 |
| 男性，n (%) | 198 (71.5) | 137 (70.6) | 61 (73.5) | 0.622 |
| 当前/既往吸烟者，n (%) | 141 (50.9) | 95 (49.0) | 46 (55.4) | 0.321 |
| 当前/既往饮酒，n (%) | 127 (45.8) | 87 (44.8) | 40 (48.2) | 0.603 |
| 诊断分组，n (%) | 0.701 | |||
| 食管鳞状细胞癌（ESCC） | 167 (60.3) | 114 (58.8) | 53 (63.9) | |
| 良性食管疾病 | 55 (19.9) | 40 (20.6) | 15 (18.1) | |
| 健康对照 | 55 (19.9) | 40 (20.6) | 15 (18.1) | |
| 血清 CEA，ng/mL，中位数 (IQR) | 3.9 (2.0–6.6) | 3.8 (1.9–6.4) | 4.1 (2.1–6.8) | 0.367 |
| 血清 SCC-Ag，ng/mL，中位数 (IQR) | 1.4 (0.8–2.3) | 1.4 (0.8–2.2) | 1.5 (0.9–2.4) | 0.418 |
| 血清 CA125，U/mL，中位数 (IQR) | 22.8 (13.9–35.7) | 22.4 (13.5–34.9) | 23.6 (14.6–36.8) | 0.447 |
表1：训练队列和外部验证队列中参与者的基线特征。 总体人群、训练队列和外部验证队列的人口学特征、队列构成以及基线血清癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和糖类抗原125（CA125）水平均已汇总。
| 变量 | 总体 ESCC (n = 167) | 训练队列 (n = 114) | 外部验证队列 (n = 53) | P 值 |
| 年龄，岁，中位数 (IQR) | 61 (55–68) | 61 (55–67) | 62 (56–68) | 0.386 |
| 男性，n (%) | 133 (79.6) | 91 (79.8) | 42 (79.2) | 0.931 |
| 当前或既往吸烟者，n (%) | 110 (65.9) | 74 (64.9) | 36 (67.9) | 0.701 |
| 当前或既往饮酒者，n (%) | 95 (56.9) | 66 (57.9) | 29 (54.7) | 0.688 |
| 肿瘤位置，n (%) | 0.879 | |||
| 上胸段 | 22 (13.2) | 15 (13.2) | 7 (13.2) | |
| 中胸段 | 89 (53.3) | 60 (52.6) | 29 (54.7) | |
| 下胸段 | 56 (33.5) | 39 (34.2) | 17 (32.1) | |
| 组织学分化程度，n (%) | 0.944 | |||
| 高分化 | 20 (12.0) | 14 (12.3) | 6 (11.3) | |
| 中分化 | 81 (48.5) | 56 (49.1) | 25 (47.2) | |
| 低分化 | 66 (39.5) | 44 (38.6) | 22 (41.5) | |
| 肿瘤长度 ≥5 cm，n (%) | 68 (40.7) | 45 (39.5) | 23 (43.4) | 0.621 |
| pT3–4 期，n (%) | 121 (72.5) | 82 (71.9) | 39 (73.6) | 0.821 |
| 淋巴结转移，n (%) | 100 (59.9) | 68 (59.6) | 32 (60.4) | 0.924 |
| TNM III–IV 期，n (%) | 111 (66.5) | 75 (65.8) | 36 (67.9) | 0.785 |
| 淋巴血管侵犯，n (%) | 65 (38.9) | 42 (36.8) | 23 (43.4) | 0.404 |
| 主要治疗方式，n (%) | 0.753 | |||
| 根治性手术 ± 辅助治疗 | 113 (67.7) | 79 (69.3) | 34 (64.2) | |
| 根治性放化疗 | 32 (19.2) | 21 (18.4) | 11 (20.8) | |
| 姑息性全身/支持性治疗 | 22 (13.2) | 14 (12.3) | 8 (15.1) |
表2：训练队列和外部验证队列中食管鳞状细胞癌患者的临床病理特征。 比较了训练队列与外部验证队列中食管鳞状细胞癌患者的肿瘤位置、组织学分化程度、肿瘤长度、pT分期、淋巴结状态、TNM分期、淋巴血管浸润以及主要治疗方式。
| 模型 | 最佳截断值 | AUC（95% CI） | 敏感性（%） | 特异性（%） | 阳性预测值（%） | 阴性预测值（%） | 准确率（%） | F1 分数（%） |
| CEA | 4.85 ng/mL | 0.711 (0.635–0.786) | 58.8 | 76.2 | 77.9 | 56.6 | 66.2 | 67.1 |
| SCC-Ag | 1.52 ng/mL | 0.802 (0.735–0.869) | 70.2 | 78.8 | 82.5 | 65.6 | 73.8 | 76.1 |
| CA125 | 31.8 U/mL | 0.668 (0.591–0.744) | 44.7 | 82.5 | 78.5 | 52.4 | 60.3 | 57 |
| 联合检测组合 | 0.57 | 0.869 (0.817–0.921) | 79.8 | 81.2 | 85.8 | 73 | 80.4 | 82.7 |
表3：训练队列中单个生物标志物及联合血清生物标志物组合的诊断准确性。诊断效能通过最优截断值、受试者工作特征曲线下面积、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确率和F1分数进行报告。
| 比较 | AUC (95% CI) | 灵敏度，% | 特异性，% | 准确率，% | Brier 评分 | 校准斜率 | 阈值概率 0.30 时的净收益 |
| ESCC vs 非-ESCC | 0.842 (0.753–0.930) | 75.5 | 76.7 | 75.9 | 0.164 | 0.93 | 0.218 |
| ESCC vs 良性食管疾病 | 0.801 (0.686–0.916) | 73.6 | 73.3 | 73.5 | 0.171 | 0.9 | 0.196 |
| ESCC vs 健康对照 | 0.889 (0.800–0.979) | 77.4 | 86.7 | 79.5 | 0.122 | 0.97 | 0.252 |
| 早期 ESCC vs 非恶性对照 | 0.818 (0.704–0.932) | 70.6 | 78.3 | 76.3 | 0.153 | 0.89 | 0.173 |
表4：联合血清生物标志物组合诊断效能的外部验证。 模型性能在四种诊断场景下进行了总结：食管鳞状细胞癌（ESCC）与非ESCC的对比、ESCC与良性食管疾病的对比、ESCC与健康对照的对比，以及早期ESCC与非恶性对照的对比。
| 特征 | 类别 | CEA 升高 (n %) | SCC-Ag 升高 (n %) | CA125 升高 (n %) | 高联合负荷 (n %) | CEA 的 P 值 | SCC-Ag 的 P 值 | CA125 的 P 值 | 联合负荷的 P 值 |
| 年龄 | <65 岁 (n = 104) | 40 (38.5) | 54 (51.9) | 29 (27.9) | 31 (29.8) | 0.129 | 0.108 | 0.151 | 0.028 |
| ≥65 岁 (n = 63) | 32 (50.8) | 41 (65.1) | 25 (39.7) | 30 (47.6) | |||||
| 性别 | 女性 (n=34) | 13 (38.2) | 17 (50.0) | 13 (38.2) | 12 (35.3) | 0.513 | 0.367 | 0.402 | 0.871 |
| 男性 (n = 133) | 59 (44.4) | 78 (58.6) | 41 (30.8) | 49 (36.8) | |||||
| 肿瘤长度 | <5 cm (n = 99) | 35 (35.4) | 49 (49.5) | 24 (24.2) | 27 (27.3) | 0.015 | 0.021 | 0.009 | 0.004 |
| ≥5 cm (n = 68) | 37 (54.4) | 46 (67.6) | 30 (44.1) | 34 (50.0) | |||||
| 分化程度 | 高/中等 (n = 103) | 38 (36.9) | 52 (50.5) | 27 (26.2) | 29 (28.2) | 0.018 | 0.032 | 0.027 | 0.006 |
| 低分化 (n=64) | 34 (53.1) | 43 (67.2) | 27 (42.2) | 32 (50.0) | |||||
| pT 分期 | pT1–2 (n = 46) | 13 (28.3) | 20 (43.5) | 9 (19.6) | 10 (21.7) | 0.016 | 0.028 | 0.036 | 0.011 |
| pT3–4(n = 121) | 59 (48.8) | 75 (62.0) | 45 (37.2) | 51 (42.1) | |||||
| 淋巴结状态 | 阴性 (n = 67) | 21 (31.3) | 31 (46.3) | 15 (22.4) | 18 (26.9) | 0.012 | 0.025 | 0.021 | 0.038 |
| 阳性 (n = 100) | 51 (51.0) | 64 (64.0) | 39 (39.0) | 43 (43.0) | |||||
| TNM 分期 | I–II (n = 56) | 16 (28.6) | 25 (44.6) | 11 (19.6) | 13 (23.2) | 0.008 | 0.021 | 0.014 | 0.009 |
| III–IV (n= 111) | 56 (50.5) | 70 (63.1) | 43 (38.7) | 48 (43.2) |
表5：食管鳞状细胞癌患者血清生物标志物升高与临床病理特征之间的关联。 在不同人口统计学和肿瘤相关亚组中比较了癌胚抗原（CEA）升高、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）升高、CA125升高以及高联合生物标志物负荷的比例。
| 变量 | 总生存期的单变量风险比（95% 置信区间） | P 值 | 总生存期的多变量风险比（95% 置信区间） | P 值 | 无进展生存期的单变量风险比（95% 置信区间） | P 值 | 无进展生存期的多变量风险比（95% 置信区间） | P 值 |
| 年龄 ≥65 岁 | 1.52 (1.01–2.31) | 0.046 | 1.39 (0.90–2.14) | 0.138 | 1.41 (0.97–2.06) | 0.074 | 1.31 (0.88–1.95) | 0.186 |
| 男性性别 | 1.18 (0.67–2.08) | 0.566 | — | — | 1.13 (0.69–1.84) | 0.632 | — | — |
| 肿瘤长度 ≥5 cm | 1.89 (1.25–2.86) | 0.003 | 1.44 (0.93–2.23) | 0.103 | 1.76 (1.22–2.55) | 0.003 | 1.36 (0.92–2.01) | 0.122 |
| 低分化 | 1.63 (1.07–2.47) | 0.024 | 1.29 (0.84–1.99) | 0.245 | 1.58 (1.09–2.28) | 0.016 | 1.27 (0.86–1.87) | 0.228 |
| pT3–4 期 | 2.04 (1.19–3.49) | 0.009 | 1.36 (0.76–2.44) | 0.304 | 1.92 (1.18–3.11) | 0.009 | 1.29 (0.77–2.18) | 0.335 |
| 淋巴结转移 | 2.46 (1.50–4.03) | <0.001 | 1.94 (1.15–3.28) | 0.013 | 2.12 (1.37–3.28) | 0.001 | 1.73 (1.08–2.79) | 0.023 |
| 以根治性手术为基础的治疗 | 0.43 (0.28–0.65) | <0.001 | 0.56 (0.36–0.88) | 0.012 | 0.51 (0.35–0.74) | <0.001 | 0.63 (0.43–0.94) | 0.024 |
| 癌胚抗原升高 | 1.88 (1.24–2.85) | 0.003 | 1.34 (0.86–2.10) | 0.199 | 1.71 (1.18–2.49) | 0.005 | 1.26 (0.84–1.88) | 0.267 |
| 鳞状细胞癌抗原升高 | 1.95 (1.25–3.03) | 0.003 | 1.29 (0.80–2.08) | 0.302 | 1.82 (1.22–2.72) | 0.004 | 1.25 (0.81–1.93) | 0.315 |
| 糖类抗原 125 升高 | 1.79 (1.16–2.78) | 0.009 | 1.21 (0.76–1.93) | 0.421 | 1.68 (1.13–2.50) | 0.011 | 1.18 (0.77–1.82) | 0.446 |
| 高复合生物标志物负荷 | 2.91 (1.89–4.46) | <0.001 | 2.24 (1.41–3.54) | 0.001 | 2.63 (1.80–3.84) | <0.001 | 2.03 (1.35–3.05) | 0.001 |
表6：总生存期和无进展生存期的单变量与多变量Cox回归分析。 展示了临床病理学变量、单个生物标志物升高以及高联合生物标志物负荷的风险比及95%置信区间。
| 模型 | 训练队列 C 指数 | 训练 1 年 AUC | 训练 3 年 AUC | 训练 5 年 AUC | 外部验证 C 指数 | 外部 1 年 AUC | 外部 3 年 AUC | 外部 5 年 AUC | 与 TNM 相比的 NRI | 与 TNM 相比的 IDI |
| 仅 TNM 分期 | 0.662 | 0.701 | 0.676 | 0.648 | 0.641 | 0.672 | 0.651 | 0.628 | — | — |
| 仅生物标志物组合 | 0.703 | 0.744 | 0.713 | 0.689 | 0.681 | 0.709 | 0.687 | 0.666 | 0.118 | 0.049 |
| 临床病理学模型 | 0.736 | 0.772 | 0.748 | 0.721 | 0.708 | 0.741 | 0.719 | 0.694 | 0.153 | 0.061 |
| 整合模型 | 0.792 | 0.829 | 0.806 | 0.781 | 0.761 | 0.801 | 0.774 | 0.748 | 0.274 | 0.102 |
表7：不同预后模型在训练队列和外部验证队列中的预测性能。 比较了仅TNM分期、仅生物标志物组合、临床病理学模型以及整合模型在Harrell's C指数、时间依赖性曲线下面积、净重新分类改善和综合判别改善方面的表现。
补充表 1：参与者筛选、排除及最终队列分配。 汇总了筛选人数、排除原因、最终分析人群、诊断分组分布以及按研究中心划分的队列分配情况。请点击此处下载该文件。
补充表 2：血清生物标志物检测的批间与中心间重复性。 使用中心间变异系数和组内相关系数总结对 CEA、SCC-Ag 和 CA125 进行盲法桥接血清分装样本检测的结果。请点击此处下载该文件。
补充表3：血清生物标志物在不同诊断组中的分布及联合生物标志物负荷情况。 对食管鳞状细胞癌患者、良性食管疾病对照组及健康对照组，分别总结了血清 CEA、SCC-Ag 和 CA125 的组别特异性分布情况，以及具有高联合生物标志物负荷的个体比例。请点击此处下载该文件。
补充表4：诊断模型系数及自助法内部验证。 本表总结了诊断模型的截距、生物标志物系数、单变量与多变量逻辑回归估计值、训练队列的截断值、自助重采样次数、经乐观校正的曲线下面积、校准斜率以及Brier评分。请点击此处下载该文件。
补充表5：预后验证的随访、时间点死亡率、校准及决策曲线分析结果。 按生物标志物负荷分组的随访时间、生存事件、中位总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）；C指数改善情况；经乐观校正的C指数；时间点累积死亡概率；外部验证Brier评分；校准斜率；以及决策曲线分析的净获益估计值汇总如下。请点击此处下载该文件。
讨论
这项双中心研究开发并外部验证了一种联合血清生物标志物组合，该组合整合了癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和糖类抗原125（CA125），用于食管鳞状细胞癌（ESCC）的诊断与预后评估。该联合标志物组合在区分ESCC患者与非恶性对照组方面的表现优于各单项生物标志物，并在外部验证队列中保持了可接受的判别能力。这一结果与既往关于ESCC的研究一致，表明血清肿瘤标志物可提供具有临床意义的诊断和预后信息，尽管单个标志物的性能常因恶性与非恶性疾病之间的生物学重叠而受限23,24。因此，本研究的主要贡献在于建立了一种可重复的三标志物工作流程，将治疗前诊断、临床病理学关联分析和生存分层整合到一个统一的分析框架中。
联合检测组性能的提升具有生物学合理性，因为CEA、SCC-Ag和CA125反映了部分不同的肿瘤相关过程。SCC-Ag与鳞状上皮恶性肿瘤密切相关，在本队列中表现出最强的独立诊断效能。CEA可能反映肿瘤负荷、侵袭性表型及全身性恶性活动，而CA125可能捕捉的是更广泛的炎症、浆膜或晚期疾病信号，而非食管鳞状细胞癌（ESCC）特异的生物学特征25,26。这三种生物标志物之间呈中等程度相关，提示它们相互关联但并不冗余，支持联合建模分析，而非依赖单一循环指标的检测。
高复合生物标志物负荷与较大的肿瘤、pT3–4期疾病、淋巴结转移以及TNM III–IV期疾病相关，表明该检测组合提供的信息超出单纯的二元诊断信号。这一模式具有临床相关性，因为解剖学分期仍是食管鳞状细胞癌（ESCC）管理的核心依据，但处于相同分期的患者在肿瘤侵袭性、全身疾病负荷及生存预后方面仍可能存在差异。27因此，基于血清的生物标志物谱可能有助于进一步优化治疗前的风险评估，尤其是在临床医生需要在手术、根治性放化疗、全身治疗或强化随访前获取额外信息的情况下。在生存分析中，校正主要的临床病理学变量后，较高的复合生物标志物负荷仍独立地与较差的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相关，且整合模型的C指数及时间依赖性AUC均高于仅基于TNM分期的模型。28.
与基于影像学、放射组学、基因表达或多组学模型相比，本检测组合具有实际应用优势，但生物学覆盖范围较窄。放射组学和转录组学模型可能捕捉到肿瘤的空间异质性、肿瘤微环境特征及分子亚型，其中一些模型在食管鳞状细胞癌（ESCC）中已显示出良好的预后预测能力29,30。然而，这些方法通常需要标准化的影像采集协议、先进的计算流程、高质量的组织样本、测序平台或专业的生物信息学支持。相比之下，癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）和糖类抗原125（CA125）在许多临床实验室中均可常规检测，成本相对较低，且可在随访期间重复测定。因此，本检测组合的临床价值在于其可及性和与现有工作流程的兼容性，而非取代影像学、病理学、分子分型或TNM分期的能力。
校准和决策曲线分析支持谨慎地进行临床转化。联合诊断模型在训练队列和外部验证队列中均表现出可接受的校准性能，决策曲线分析表明在临床相关阈值范围内具有正的净收益。整合的预后模型在外部验证中也显示出更好的区分能力和可接受的校准性能。这些发现具有重要意义，因为仅具有高区分能力的模型仍可能存在校准不佳或临床实用性差的问题31。本研究通过报告AUC、C指数、校准结果、Brier评分以及决策曲线结果，相较于仅依赖区分度指标或风险比的研究，对模型性能进行了更全面的评估。
应承认本研究存在若干局限性。尽管研究包含了外部验证，但仅限于两个中心，且验证队列的样本量小于训练队列。生物标志物数值仅在治疗前基线时测量，因此未评估新辅助治疗、放化疗、术后随访或复发监测期间的纵向变化情况，尽管连续监测肿瘤标志物的变化趋势可能提供额外的预后信息32。在同一患者群体中，血清标志物组合未与影像组学、基因表达、循环肿瘤DNA或其他液体活检模型进行直接比较，且在炎症、良性疾病或合并症情况下可能出现假阳性升高。总之，联合血清CEA、SCC-Ag和CA125检测组合相比单个生物标志物具有更好的诊断区分能力，与不良的临床病理特征相关，并在加入传统临床变量后改善了预后分层效果。在常规临床应用之前，仍需进一步开展多中心验证、连续生物标志物评估，并与基于影像和分子的模型进行直接比较。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢中国中医科学院江苏省中医院检验科、南京中医药大学附属医院以及南京市南湖社区卫生服务中心的工作人员在样本采集、实验室检测和数据管理方面提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CEA校准品 | Beckman Coulter | 33205 | 血清CEA检测的校准 |
| CEA质控品 | Beckman Coulter | 33029 | 血清CEA检测的日常室内质控 |
| CEA试剂盒 | Beckman Coulter | 33200 | 在UniCel DxI 800 Access免疫分析系统上进行血清CEA测定 |
| 可调移液器，100–1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | 离心后血清分装 |
| ARCHITECT CA 125 II校准品 | Abbott Diagnostics | 02K4502 | 血清CA125检测的校准 |
| ARCHITECT CA 125 II质控品 | Abbott Diagnostics | 02K4511 | 血清CA125检测的日常室内质控 |
| ARCHITECT CA 125 II试剂盒 | Abbott Diagnostics | 02K4529 | 在ARCHITECT i2000SR免疫分析仪上进行血清CA125测定 |
| ARCHITECT i2000SR免疫分析仪 | Abbott Diagnostics | i2000SR | 用于SCC-Ag和CA125检测的全自动化学发光微粒子免疫分析平台 |
| ARCHITECT SCC校准品 | Abbott Diagnostics | 8D1801 | 血清SCC-Ag检测的校准 |
| ARCHITECT SCC质控品 | Abbott Diagnostics | 8D1810 | 血清SCC-Ag检测的日常室内质控 |
| ARCHITECT SCC试剂盒 | Abbott Diagnostics | 8D1828 | 在ARCHITECT i2000SR免疫分析仪上进行血清SCC-Ag测定 |
| 条形码标签打印机 | Brady | BMP51 | 血清分装样本和冻存管的条形码标记 |
| 采血针 | BD Biosciences | 367286 | 外周静脉采血 |
| 冻存储存盒 | Corning | 431131 | 冷冻血清分装样本的有序储存 |
| 冻存管，2.0 mL，外螺纹，自立式 | Corning | 430659 | 条形码标记后于−80 °C保存血清分装样本 |
| 数据提取表及预定义数据字典 | 研究团队 | 不适用 | 临床、病理、实验室及随访变量的标准化提取 |
| dcurves软件包 | R软件包 | 版本 0.4.0 | 决策曲线分析及临床净获益估计 |
| 电子病历系统 | 参与医院 | 不适用 | 人口统计学、临床、治疗及随访数据的提取 |
| 带滤芯移液器吸头，100–1000 µL | Eppendorf | 30073594 | 防污染的血清分装操作 |
| ggplot2软件包 | R软件包 | 版本 3.5.1 | 统计可视化及图表制作 |
| IBM SPSS Statistics | IBM | 版本 27.0 | 基线比较及补充统计检验 |
| 实验室信息管理系统 | 参与医院实验室 | 不适用 | 血清生物标志物检测记录的检索与关联 |
| mice软件包 | R软件包 | 版本 3.16.0 | 链式方程多重插补法 |
| nricens软件包 | R软件包 | 版本 1.6 | 净重分类改善分析 |
| 病理报告系统 | 参与医院 | 不适用 | 确认食管鳞状细胞癌诊断、良性病理、肿瘤特征及分期相关变量 |
| pROC软件包 | R软件包 | 版本 1.18.5 | 受试者工作特征曲线分析及DeLong比较 |
| R统计软件 | R统计计算基金会 | 版本 4.3.2 | 统计分析、模型构建、验证及图表生成 |
| 冷藏离心机 | Eppendorf | 5810 R | 以1,500 × g离心10分钟进行血清分离 |
| rms软件包 | R软件包 | 版本 6.8-1 | 校准分析、列线图构建及回归模型支持 |
| 血清分离采血管，5 mL | BD Biosciences | 367955 | 采集空腹外周静脉血用于血清生物标志物检测 |
| survival软件包 | R软件包 | 版本 3.5-7 | Cox比例风险回归及生存分析 |
| survminer软件包 | R软件包 | 版本 0.4.9 | Kaplan–Meier曲线可视化 |
| 电话随访记录表 | 研究团队 | 不适用 | 生存、复发、进展及末次联系信息的收集与核实 |
| timeROC软件包 | R软件包 | 版本 0.4 | 时间依赖性受试者工作特征曲线分析 |
| 超低温冰箱 | Thermo Fisher Scientific | TSX60086A | 在−80 °C储存血清分装样本 |
| UniCel DxI 800 Access免疫分析系统 | Beckman Coulter | DxI 800 | 用于血清CEA检测的全自动化学发光免疫分析平台 |
参考文献
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