本研究整合了公共儿科肺炎转录组学、小鼠肺组织单细胞RNA测序 芍药属-衍生的化合物筛选、分子对接和分子动力学模拟，以鉴定中性粒细胞相关的炎症靶点，并预测儿茶素的相互作用，供后续验证。
本文内容
摘要
摘要
儿童肺炎常伴随过度的炎症反应和免疫失调，可能导致严重的临床后果。儿茶素在多种疾病环境中已显示出抗炎活性，但其在肺炎中的作用及分子机制尚不明确。本研究分析了来自儿童肺炎的公共批量RNA测序数据（GSE261482）以及来自实验性肺炎模型的小鼠肺组织单细胞RNA测序公共数据（GSE295484），采用加权基因共表达网络分析、差异表达分析、细胞类型注释和基因集富集分析方法。通过分子对接和分子动力学模拟评估了儿茶素与选定蛋白之间的相互作用。研究鉴定出一个与肺炎相关性状显著关联的关键基因模块，并筛选出18个候选基因，这些基因主要富集于炎症和免疫相关通路。单细胞分析显示，这些基因主要在中性粒细胞和肺泡巨噬细胞中富集，在炎症条件下中性粒细胞比例升高。MMP9、PYGL 和 GADD45A 被选为候选基因。分子对接与动力学模拟结果支持儿茶素与这些选定蛋白之间存在稳定的预测相互作用。儿茶素可能通过调控中性粒细胞相关通路及与关键免疫相关蛋白的相互作用，参与肺炎相关的炎症通路。本研究从系统层面揭示了儿茶素在肺炎中的作用机制，为后续实验验证提供了潜在靶点。
引言
肺炎是儿童常见且可能严重的呼吸道疾病，主要由Mycoplasma pneumoniae等病原体感染引起。该病是社区获得性肺炎的重要组成部分，因过度的炎症反应和免疫失调而导致显著的疾病负担1,2。越来越多的证据表明，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）等炎症性细胞因子通过促进免疫细胞募集、组织损伤和肺功能障碍，在疾病进展中发挥关键作用3。尽管抗微生物治疗已取得进展，但驱动儿童肺炎炎症反应的分子机制仍尚未完全阐明4。
黄酮类化合物因其抗炎和抗氧化特性而受到广泛关注5。儿茶素是一种天然存在的多酚，广泛存在于茶叶和植物源性食物中，已有研究报道其可在多种疾病模型中减轻氧化应激和炎症反应6。先前的研究表明，儿茶素能够抑制促炎信号级联反应，包括MAPK和NF-κB通路，并调节细胞因子的表达，从而缓解炎症和代谢功能障碍7。然而，目前大多数研究集中于代谢性疾病或心血管疾病，儿茶素在呼吸系统炎症性疾病（尤其是肺炎）中的作用仍缺乏深入探讨。此外，儿茶素在肺炎中发挥保护作用的分子靶点及其潜在机制尚不明确。
本研究旨在探讨儿茶素在肺炎中的潜在分子机制。假设儿茶素可通过与参与免疫调控的关键蛋白及信号通路相互作用，从而减轻炎症反应。为验证该假设，整合了网络药理学、分子对接、分子动力学模拟和单细胞RNA测序分析，以系统性地鉴定候选基因并评估其与儿茶素的相互作用。进一步分析了免疫细胞分布和基因表达模式，以探究中性粒细胞和巨噬细胞在疾病进展中的作用。
结果表明，儿茶素与选定的蛋白质（包括PYGL、MMP9和GADD45A）之间具有稳定的预测结合能力，并且在分子动力学模拟过程中保持了结构稳定性。此外，单细胞分析显示，在炎症条件下，免疫细胞比例发生显著改变，尤其是中性粒细胞。这些发现提示，儿茶素可能与涉及免疫细胞功能及关键信号通路的抗炎机制相关。本研究提供了肺炎中儿茶素相关潜在机制的系统层面视角，并支持进一步验证儿茶素作为炎性呼吸系统疾病研究候选化合物的可能性。
方案
本研究涉及对基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus）中公开可用的去标识化数据集进行二次分析。本研究未招募、收集或生成任何新的人类受试者、动物实验或临床样本。原始数据集的伦理审批和知情同意由原始数据生成研究负责。因此，本次二次分析无需额外的伦理委员会批准。
数据收集与预处理
批量RNA测序（RNA-seq）数据来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）数据集GSE2614828。本研究使用的表达矩阵包含177个全血样本，其中包括139个儿童肺炎样本和38个健康对照样本。可用的元数据包括性别、病因分类、采血管类型、批次和疾病状态。根据原始数据集的注释，肺炎样本被标注为明确细菌性（DB）、明确病毒性（DV）、可能细菌性（PB）、可能病毒性（PV）或未知（U）。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据来自GEO数据库GSE2954849，该数据源自实验性肺炎模型中C57BL/6野生型小鼠的肺组织。该数据集包括出生后第5天（PND05）和第12天（PND12）的幼鼠，分别暴露于室内空气、PBS或E. coli，并在吸入后48小时或96小时采集样本。
加权基因共表达网络分析（WGCNA）
在构建共表达网络时，首先对表达矩阵进行过滤，以去除低表达的基因。在移除低表达基因后，使用中位绝对偏差（MAD）评估表达变异度。选取MAD值最高的5,000个基因，用于在R语言中进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）。选择15作为软阈值幂指数，因其满足无标度拓扑结构的标准（R2> 0.8）。该阈值用于构建加权邻接矩阵，并进一步转换为拓扑重叠矩阵（TOM）。随后，基于TOM进行层次聚类，识别基因模块。为了鉴定与肺炎相关性状关联的模块，计算各模块的特征基因（module eigengenes），并检验其与疾病状态及病因学的关联性。
差异表达分析
使用 limma R 软件包比较肺炎组与健康对照组，以鉴定差异表达基因。采用 Benjamini-Hochberg 方法进行多重检验校正。只有当同时满足以下两个阈值时，基因才被认定为差异表达基因：|log2 倍数变化| > 1 且校正后 p 值 < 0.05。
鉴定 芍药属-衍生活性化合物与靶点预测
为了系统地鉴定芍药属植物中的生物活性化合物及其潜在的生物学靶点，采用多数据库整合策略，以确保结果的可靠性和全面性，该策略遵循既定的网络药理学研究框架。首先，获取芍药属植物的活性化合物 牡丹属 从传统中药系统药理学数据库（TCMSP，https://tcmsp-e.com）及其他公共数据库（包括ETCM）和文献来源中获取化合物。根据药代动力学参数，包括口服生物利用度（OB ≥ 30%）和类药性（DL ≥ 0.18），筛选候选的生物活性成分。
采用配体依赖的互补方法预测潜在的蛋白质靶点。利用 SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch）通过将化合物结构与已知活性配体进行比较，识别可能的人类靶点，仅保留预测概率 ≥ 0.1 的结果。为扩大靶点覆盖范围，还使用相似性整合分析方法（Similarity Ensemble Approach, SEA，http://sea.bkslab.org）在蛋白质家族范围内筛查可能的脱靶相互作用，包括经典靶点预测未能涵盖的相互作用。为进一步补充基于配体的预测结果，利用 PharmMapper 服务器（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/）针对全面的人类蛋白质数据库进行反向药效团匹配，筛选归一化匹配得分 ≥ 0.7 的靶点。此外，从 DrugBank 和 BindingDB 等公共数据库中收集实验验证的化合物-靶点相互作用数据，以提高靶点识别的可靠性。所有预测靶点随后通过 UniProt 数据库（https://www.uniprot.org）标准化为官方基因符号，并将物种限定为“Homo sapiens”。去除重复条目以确保数据准确性。整合的靶点集合定义为所有针对Paeonia预测和验证靶点的并集，代表其药理作用的潜在分子基础。由于儿茶素被鉴定为源自Paeonia的活性化合物之一，且具有明确记载的抗炎活性，因此被选为代表性化合物用于后续的分子对接和分子动力学模拟研究。
功能富集分析
使用 clusterProfiler R 软件包对基因本体（GO）生物学过程和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路进行功能富集分析。当错误发现率（FDR）< 0.05 时，保留富集的条目。
单细胞 RNA 测序分析及下游分析
单细胞 RNA 测序数据在 Seurat 中进行处理。使用已处理的 GSE295484 矩阵进行下游分析，导入后未再进行额外的细胞水平过滤。该处理后的矩阵包含 90,883 个细胞和 26,511 个基因。质量控制图采用的参考阈值为每个细胞检测到 200 至 8,000 个基因，线粒体读数占比为 1.4%。数据经过标准化、缩放处理，并进行主成分分析（PCA）。随后进行细胞聚类，并采用均匀流形近似与投影（UMAP）在降维空间中可视化细胞群体。根据经典标志基因对细胞身份进行注释。使用 FindAllMarkers 鉴定标志基因，参数设置为 only.pos = TRUE、min.pct = 0.25 和 logfc.threshold = 0.25。
为了在单细胞水平上评估候选基因集的活性，使用 AUCell R 软件包进行了 AUCell 分析。根据预定义基因特征的表达对细胞进行评分，并在 UMAP 图上可视化富集模式。对于 GSE295484，计算了吸入后 48 小时和 96 小时在常氧空气、PBS 和 E. coli 组中包括肺泡巨噬细胞和中性粒细胞在内的免疫细胞群体的比例。采用非参数统计检验评估组间差异。从中性粒细胞标记基因的单细胞数据集中鉴定出基因，并与先前确定的候选基因取交集，以获得用于进一步分析的关键中性粒细胞相关基因。
分子对接
采用 AutoDock Vina 进行分子对接，受体和配体的准备使用 AutoDock Tools 完成。靶蛋白的晶体结构从蛋白质数据库（PDB）获取，包括 GADD45A（PDB ID: 2KG4）、MMP9（PDB ID: 6ESM）和 PYGL（PDB ID: 3DDS）。在对接前，对蛋白结构进行处理，删除水分子和共结晶配体，然后添加极性氢原子，并分配 Gasteiger 电荷。
三维儿茶素结构从 PubChem 获取，并使用 AutoDock Tools 进行预处理。随后采用 AutoDock Vina 将儿茶素与各个靶标蛋白进行分子对接，以评估预测的结合亲和力及相互作用模式。对接网格盒参数如下：GADD45A-儿茶素，center_x = 0.131，center_y = -0.002，center_z = -0.018，size_x = 47.25，size_y = 47.25，size_z = 47.25；MMP9-儿茶素，center_x = -0.434，center_y = 43.036，center_z = 14.868，size_x = 47.25，size_y = 47.25，size_z = 47.25；PYGL-儿茶素，center_x = 88.408，center_y = -80.795，center_z = 105.959，size_x = 100.45，size_y = 100.45，size_z = 100.45。
分子动力学模拟
蛋白质组分采用 AMBER14SB 力场。配体参数通过 sobtop_1.0 (dev3.1) 使用 GAFF2 力场生成，并分配 RESP 电荷。采用 TIP3P 水模型将每个蛋白质-配体复合物溶剂化于立方模拟盒子中。添加 Na⁺ 和 Cl⁻ 离子以中和体系并达到 0.15 M 的离子浓度。长程静电相互作用采用粒子网格 Ewald (PME) 方法处理，截断距离为 1 nm。化学键约束通过 LINCS 算法实现。为消除空间位阻冲突，采用最陡下降法和共轭梯度法进行能量最小化。
平衡后，在310 K和1 bar条件下，采用NPT系综进行生产阶段的分子动力学模拟，温度由Nosé–Hoover恒温器控制，压强由Parrinello–Rahman恒压器控制。每次模拟运行100 ns，时间步长为2 fs。
统计学分析
所有统计学分析均使用 R 软件进行。相关性分析根据情况采用 Pearson 或 Spearman 方法。组间比较采用非参数检验，包括 Kruskal–Wallis 检验。以 p 值 < 0.05 为具有统计学显著性。
结果
通过WGCNA鉴定与小儿肺炎相关的关键基因模块
为了鉴定与小儿肺炎相关的基因模块，对肺炎患者和健康对照者的全血转录组数据进行了WGCNA分析。样本聚类分析未发现明显离群样本，表明数据质量良好，适合后续分析（图1A）。主成分分析（PCA）进一步显示肺炎组与健康组之间存在明显的分离趋势，提示两组间具有不同的转录组特征（图1B）。为构建无标度网络，首先根据中位绝对偏差对基因进行排序，选取前5,000个基因用于网络构建，并依据无标度拓扑拟合指数准则（R2 > 0.8）同时保持相对较低的平均连接度，确定软阈值幂指数为15（图1C）。基于该阈值，通过层次聚类鉴定了多个具有不同表达模式的基因模块（图1D）。模块-性状关联分析显示，多个模块与临床表型显著相关。其中，蓝色模块与疾病状态（肺炎 vs. 健康）及病原学分类均表现出强相关性，提示其在疾病进展和宿主反应中可能发挥重要作用（图1E）。
此外，蓝模块内模块成员关系与基因显著性之间的散点图分析显示强烈的正相关关系（cor = 0.6，p = 2.1e−35），表明在模块内连接度较高的基因也与临床特征密切相关（图1F）。
蓝色模块与细菌性肺炎病因的关联
为进一步探究不同肺炎病因之间的基因表达差异，采用多种临床分类进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），包括对照组（C）、明确细菌性（DB）、明确病毒性（DV）、可能细菌性（PB）、可能病毒性（PV）和病因未明（U）组。模块-性状关联分析显示，多个模块与特定病因亚型存在显著相关性。值得注意的是，蓝色模块与DB组呈最强的正相关，提示其可能参与了针对细菌感染的特异性宿主反应（图 2A）。
基因聚类树状图及相应的模块划分进一步证实了模块构建的稳健性以及基因簇之间的清晰分离（图 2B）。在蓝色模块中，模块成员度与基因显著性之间的相关性分析显示出显著的正相关关系（cor = 0.41，p = 7.8e−14），表明该模块内连接度较高的基因也与病因学性状密切相关（图 2C）。
此外，不同病因组间模块特征基因表达的比较显示，蓝色模块存在显著差异（Kruskal–Wallis 检验，p = 1.5e−13）。具体而言，与其他病因类别相比，蓝色模块在细菌性肺炎组中表达升高，尤其是在 DB 亚组中（图 2D）。
十八 芍药属通过整合分析鉴定出的与小儿肺炎相关的化合物衍生候选基因
为了鉴定与儿童肺炎相关的候选基因及潜在 芍药属-相关靶点，首先在肺炎患者与健康对照之间进行了差异表达分析。根据这些标准，在肺炎患者与健康对照样本之间共鉴定出 1,110 个差异表达基因（DEGs），其中包括 524 个上调基因和 586 个下调基因。这 524 个上调的差异表达基因列于 补充表 S1 （另请参见 图3A）。为进一步筛选关键基因，将肺炎相关差异表达基因与DB表型相关基因及预测的靶基因取交集 芍药属. 这项整合分析共获得18个重叠基因，提示其在疾病进展中可能发挥重要作用 芍药属-相关的反应（图3B).
构建了化合物-靶点相互作用网络，以展示Paeonia活性成分与鉴定出的候选基因之间的关系，揭示了化合物与靶点之间广泛的关联性（补充表 S2 和 图3C）。为了探究这18个基因的生物学功能，进行了功能富集分析。GO生物学过程富集分析显示，候选基因主要与免疫和炎症功能相关，包括炎症反应的调控、肽类激素响应、活性氧代谢的正向调控以及II型干扰素介导信号通路的调控（图3D）。KEGG分析进一步表明，这些基因在炎症和免疫相关通路中显著富集，如IL-17和NF-κB信号通路，同时也富集于代谢和内分泌相关通路，包括胰高血糖素信号通路和类固醇激素生物合成通路（图3D）。
单细胞转录组分析中嗜中性粒细胞和肺泡巨噬细胞候选基因的富集
为研究候选基因在实验性肺炎背景下的细胞分布，分析了小鼠肺组织单细胞RNA测序数据集GSE295484。通过质量控制分析评估数据的可靠性。检测到的基因数量、UMI计数以及线粒体和核糖体基因百分比的分布表明，处理后的矩阵中单细胞数据整体质量较高（图4A）。散点图显示了质量控制可视化中用于基因检测和线粒体含量的参考阈值（图4B）。
标准化和降维处理后，采用 UMAP 对细胞进行聚类和可视化。鉴定了不同的细胞群体，包括中性粒细胞、肺泡巨噬细胞、单核细胞、上皮细胞以及其他免疫和基质细胞类型，展示了肺炎期间肺微环境的细胞异质性（图 4C）。为了在单细胞水平评估 18 个候选基因的活性，进行了 AUCell 分析。结果显示，该基因特征主要在中性粒细胞和肺泡巨噬细胞中富集，表现为这些细胞群体中的 AUC 评分较高（图 4D）。
与炎症相关的基因 芍药属-衍生化合物在小鼠细菌性肺炎模型中的靶点研究
为了进一步研究小鼠实验性肺炎模型中免疫细胞的动态变化，分析了常氧空气、PBS 和 E. coli 48小时和96小时组在吸入后48小时和96小时。在吸入后48小时，肺泡巨噬细胞数量显著减少 E. coli 与空气和PBS条件相比，感染后中性粒细胞的细胞比例显著升高（图 5A）。在96小时时也观察到类似趋势，中性粒细胞比例仍因刺激而持续升高 E. coli 刺激，而肺泡巨噬细胞中的水平相对较低。这些结果表明，在细菌感染期间中性粒细胞显著扩增。为探究中性粒细胞的功能特征，鉴定了中性粒细胞标志基因，并进行了功能富集分析。KEGG 富集分析将中性粒细胞标志基因与炎症信号通路相关联，包括 TNF、MAPK 和 C 型凝集素受体通路（图5B）。GO生物学过程术语还富集于免疫应答功能，例如白细胞迁移、白细胞细胞间黏附、防御反应的正向调控以及对细菌来源分子的响应（图 5B）。为了鉴定连接中性粒细胞活性、肺炎和 芍药属 靶标，将中性粒细胞标记基因与先前鉴定的18个候选基因取交集。该分析得到三个重叠基因： MMP9, PYGL，以及 GADD45A (补充表 S3 和 图5C）。最后，单细胞基因表达可视化显示，这三个基因主要在中性粒细胞群体中表达（图 5D），进一步支持其在中性粒细胞介导的炎症反应中的潜在作用。
分子对接预测的儿茶素与选定蛋白质的结合亲和力
为进一步评估儿茶素与蛋白质之间可能的相互作用，我们对选定的蛋白质（MMP9、PYGL 和 GADD45A）与儿茶素（一种源自Paeonia的活性化合物）进行了分子对接分析。GADD45A、MMP9 和 PYGL 的晶体结构取自蛋白质数据库（Protein Data Bank），儿茶素的三维结构则来自 PubChem 数据库。对接结果表明，儿茶素能够结合于这三种选定蛋白质的结合位点，其结合能分别为：GADD45A 为 −6.3 kcal/mol，MMP9 为 −7.6 kcal/mol，PYGL 为 −8.0 kcal/mol（图6）。在这些选定蛋白质中，儿茶素对 PYGL 的预测结合亲和力最强，其次为 MMP9 和 GADD45A，提示儿茶素可能优先与一种与代谢相关的蛋白质发生相互作用。
在分子水平上，儿茶素与每种蛋白中的关键氨基酸残基形成了多个氢键和疏水相互作用。在GADD45A中，儿茶素与GLN33和TRP135等残基发生相互作用。在MMP9中，观察到与GLN227、TYR248和HIS236等残基形成的稳定氢键。类似地，在PYGL中，儿茶素与LYS554和ASN631等残基形成了多个氢键，有助于结合的稳定性。除了氢键作用外，相互作用分析还揭示了范德华力和π相关相互作用，表明存在一种多模式结合方式，可增强预测的配体-蛋白复合物的稳定性。总体而言，这些结果表明儿茶素能够与MMP9、PYGL和GADD45A形成稳定的预测复合物。然而，这些相互作用的治疗相关性仍需进一步的实验验证。
儿茶素与选定蛋白质之间预测的稳定相互作用
基于分子对接获得的对接构象，进行了100 ns的分子动力学模拟，以进一步评估儿茶素-蛋白质复合物的稳定性。RMSD分析显示，三种蛋白质-配体复合物在模拟期间均达到了平衡状态。其中，PYGL–儿茶素和MMP9–儿茶素复合物表现出相对稳定的RMSD波动，而GADD45A–儿茶素复合物的波动略高，但仍处于可接受范围内（图7A）。Rg分析表明，所有复合物在整个模拟过程中均保持了稳定的结构紧密性，随时间变化极小（图7B）。同样，SASA分析显示所有复合物的暴露水平保持稳定，进一步支持其结构稳定性（图7C）。氢键分析揭示了儿茶素与选定蛋白质之间持续存在的相互作用。PYGL–儿茶素复合物在模拟过程中维持的氢键数量高于MMP9和GADD45A，表明其结合相互作用更强且更稳定（图7D）。
采用均方根涨落（RMSF）评估残基水平的灵活性。结果显示，大多数残基表现出较低的波动性，仅有少数区域具有较高的灵活性，表明配体结合未引起蛋白质发生显著的结构不稳定性（图7E）。综上所述，这些发现表明儿茶素能够与MMP9、PYGL和GADD45A形成稳定的预测复合物，其中PYGL–儿茶素相互作用的稳定性最强。这些结果支持儿茶素与所选蛋白质之间存在稳定的预测相互作用，为后续实验验证提供了计算依据。
数据可用性：
本研究分析了公开可用的数据集。批量RNA测序数据集可从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取，登录号为GSE261482（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE261482）；小鼠肺组织单细胞RNA测序数据集的登录号为GSE295484（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE295484）。本文所使用的经处理的数据输出结果见补充表S1、补充表S2和补充表S3。
图1. WGCNA 构建及疾病相关模块的鉴定（A）基于基因表达谱进行样本聚类，相应的性状注释显示在系统发育树下方。（B）主成分分析展示了样本在前两个主成分上的分布情况。（C）通过无尺度拓扑拟合指数和平均连接度评估软阈值幂参数。（D）根据拓扑重叠对基因进行聚类，模块分配以不同颜色表示。（E）模块特征基因与临床性状的相关性以热图形式展示。（F）显示蓝色模块中基因的模块成员关系与基因显著性之间的关系。请点击此处查看该图的高清版本。
图2。基于肺炎病因的加权基因共表达网络分析（WGCNA）。（A）显示了不同病因组的模块特征基因相关性，包括对照组、明确细菌性、明确病毒性、可能细菌性、可能病毒性及病因未明组。（B）根据基于拓扑重叠的聚类树状图划分基因模块。（C）绘制蓝色模块的模块成员关系（module membership）与基因显著性（gene significance）。（D）比较不同病因组间蓝色模块特征基因的表达水平。缩写：WGCNA = 加权基因共表达网络分析；C = 对照组；DB = 明确细菌性；DV = 明确病毒性；PB = 可能细菌性；PV = 可能病毒性；U = 病因未明。请点击此处查看该图的放大版本。
图3。候选基因的鉴定与功能分析。（A）火山图显示肺炎样本与对照样本之间差异表达的基因。（B）维恩图显示肺炎差异表达基因、明确的细菌相关基因与Paeonia靶基因之间的重叠。（C）Paeonia活性成分与候选基因之间的化合物-靶点相互作用网络。（D）条形图显示重叠基因的基因本体论生物过程富集（左）和KEGG通路富集（右）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4．肺炎的单细胞转录组学分析。（A）小提琴图总结了质量控制指标，包括 nCount_RNA、nFeature_RNA、线粒体基因百分比和核糖体基因百分比。（B）散点图显示了UMI计数、每个细胞检测到的基因数以及线粒体基因百分比之间的关系。（C）基于细胞类型注释的细胞簇UMAP可视化图。（D）显示候选基因特征在单个细胞中AUCell评分的UMAP图。请点击此处查看该图的放大版本。
图5．中性粒细胞动态变化及关键基因的鉴定。（A）箱线图显示在不同条件下（空气、PBS 和 E. coli）48 h 和 96 h 时肺泡巨噬细胞和中性粒细胞的细胞比例。（B）柱状图显示中性粒细胞标志基因的 KEGG 通路富集（左）和 GO 生物过程富集（右）。（C）维恩图显示中性粒细胞标志基因与细菌性肺炎和Paeonia共同靶基因之间的重叠。（D）UMAP 图显示 MMP9、PYGL 和 GADD45A 在不同细胞群体中的表达模式。请点击此处查看该图的高清版本。
图6．儿茶素与选定蛋白质的分子对接。 蛋白质-配体复合物的三维结构，显示儿茶素与GADD45A（上）、MMP9（中）和PYGL（下）的结合情况。放大图显示了结合区域及与关键氨基酸残基的相互作用。二维图展示了儿茶素与选定蛋白质之间的氢键及其他相互作用。请点击此处查看该图的放大版本。
图7。蛋白质-配体复合物的分子动力学模拟。（A）模拟过程中复合物的均方根偏差。（B）回转半径随时间的变化。（C）模拟过程中的溶剂可及表面积。（D）儿茶素与靶蛋白之间氢键数量随时间的变化。（E）各复合物中蛋白质残基的均方根涨落。缩写：RMSD = 均方根偏差；Rg = 回转半径；SASA = 溶剂可及表面积；RMSF = 均方根涨落。请点击此处查看该图的放大版本。
补充表 S1. 儿童肺炎样本相对于健康对照样本上调的差异表达基因，包括基因符号、log2 倍数变化、P 值、校正后 P 值及相关 limma 统计数据。 请点击此处下载该文件。
补充表 S2。Paeonia 化合物-靶标相互作用表，用于网络分析，包含化合物标识符、化合物名称及相关靶基因。 请点击此处下载该文件。
补充表 S3。来自 GSE295484 的单细胞标志基因表，包含 P 值、平均 log2 倍数变化、表达百分比、校正后 P 值、细胞簇注释以及基因符号。 请点击此处下载该文件。
讨论
肺炎是全球婴幼儿发病和死亡的主要原因，给公共卫生带来了沉重负担1。儿童肺炎的发病机制复杂，涉及多个相互关联的过程，包括过度的炎症反应、氧化应激以及免疫和代谢通路的失调2,10,11。先前的研究表明，先天免疫细胞（尤其是中性粒细胞和巨噬细胞）的失控性活化可通过释放促炎性细胞因子、蛋白水解酶和活性氧（ROS）导致肺组织损伤12。尽管抗微生物和支持性治疗已取得进展，但针对这些潜在分子机制的有效治疗策略仍然有限。因此，寻找能够调节炎症反应并恢复免疫稳态的新型治疗药物具有重要意义。
植物化学物质，尤其是儿茶素，因其明确的抗炎、抗氧化和免疫调节特性而受到越来越多的关注13,14,15。然而，儿茶素在肺炎中发挥保护作用的具体分子机制仍不甚清楚。本研究采用整合转录组学、单细胞RNA测序、分子对接和分子动力学模拟的综合方法，系统探讨了儿茶素在小儿肺炎中的潜在相关作用机制。
与最初的假设一致，研究结果表明，通过WGCNA鉴定出的蓝色模块与疾病状态及病因学分类均显著相关，提示该模块代表了参与小儿肺炎的核心转录程序。进一步整合差异表达分析与Paeonia靶基因预测，发现18个重叠基因，这些基因在免疫相关通路中显著富集，包括炎症反应、活性氧代谢以及II型干扰素信号通路16,17。这些发现进一步支持了免疫应答失调和氧化应激是疾病进展核心驱动因素的观点。
单细胞RNA测序分析进一步揭示，候选基因集主要在中性粒细胞和肺泡巨噬细胞中富集，凸显了先天免疫细胞在肺炎进展中的核心作用。在大肠杆菌（E. coli）刺激下，中性粒细胞比例显著升高，尤其在48 h和96 h时更为明显，表明其在急性炎症期间持续活化，这与其通过炎症介质和活性氧（ROS）在病原体清除和组织损伤中发挥的双重作用一致18。进一步分析鉴定出三个关键基因——MMP9、PYGL 和 GADD45A，它们可能是连接免疫反应、代谢调控与细胞应激的潜在枢纽。其中，MMP9参与细胞外基质重塑和炎症浸润19，GADD45A调控应激与免疫反应，而PYGL则提示代谢重编程在免疫活化中的潜在作用20,21。分子对接与分子动力学模拟显示，儿茶素与这些选定蛋白之间具有稳定的预测结合能力，表现为有利的结合能以及稳定的RMSD、Rg和SASA曲线，同时存在持续的氢键相互作用和较低的RMSF值。这些结果提示儿茶素可能与上述炎症和代谢靶点相关联，但其直接调控作用仍需进一步的实验验证22。
除了抗炎作用外，儿茶素还可能通过调节氧化应激和代谢平衡发挥保护作用。与活性氧（ROS）相关通路的富集表明，儿茶素可能通过增强抗氧化能力来减轻氧化损伤，这与既往关于儿茶素抗氧化特性的研究报道一致。此外，代谢酶（如PYGL）的参与凸显了儿茶素在调节免疫代谢中的潜在作用，而免疫代谢是炎症性疾病中的一个新兴概念。
本研究存在若干局限性，需予以说明。首先，本研究主要基于公开可获取的转录组数据集及计算分析，所预测的作用机制尚未经过实验验证。尽管分子对接与分子动力学模拟表明儿茶素与候选靶标蛋白之间存在稳定的相互作用，但这些结果并不能证明其具有功能上的抑制、激活作用或治疗效果。仍需进一步开展生化检测、细胞实验以及体内研究，以验证儿茶素对 MMP9、PYGL 和 GADD45A 的调控作用，并明确其在肺炎治疗中的潜在应用价值。其次，可用于儿童肺炎数据集的临床信息较为有限。GSE261482 数据集提供了来自儿童肺炎患者和健康对照者的全血转录组数据，以及包括性别、病因分类、采血管类型、批次和疾病状态等在内的元数据。
然而，本研究使用的 GEO 元数据中并未完全提供详细的临床变量，包括个体年龄、肺炎严重程度、采样时的治疗状态以及其他疾病进程信息。因此，无法根据临床严重程度、治疗阶段或年龄亚组进行进一步的分层分析。第三，批量 RNA 测序（bulk RNA-seq）和单细胞 RNA 测序（single-cell RNA-seq）数据集来源于不同的生物学背景。GSE261482 数据集来自儿科患者的全血样本，而 GSE295484 数据集则来自实验性肺炎模型中 C57BL/6 野生型小鼠的肺组织。因此，单细胞分析结果应被视为对炎症细胞群体及候选基因分布的支持性细胞背景证据，而非对人类儿童肺炎的直接验证。此外，由 E. coli 诱导的小鼠肺炎模型并不能完全代表儿童肺炎的异质性病因，包括细菌性、病毒性、可能细菌性、可能病毒性以及未知病因等多种类型。
最后，选择MMP9、PYGL和GADD45A是基于整合性生物信息学筛选及其已知的生物学相关性，但它们在中性粒细胞相关炎症及儿茶素介导的调控中的确切作用仍有待证实。未来需要利用儿童临床队列、人类单细胞数据集、靶点特异性功能检测以及实验性肺炎模型等进一步研究，以验证这些发现并阐明儿茶素的转化潜力。
综上所述，本研究提示儿茶素可能与肺炎中性粒细胞相关的炎症反应以及参与免疫调节、氧化应激和代谢通路的部分基因有关。通过整合分析bulk RNA测序、单细胞RNA测序、分子对接和分子动力学模拟，本研究鉴定出与疾病相关的基因模块，并选取MMP9、PYGL和GADD45A进行儿茶素对接与模拟分析。候选基因在中性粒细胞和肺泡巨噬细胞中的富集，以及儿茶素与所选蛋白之间预测的稳定相互作用，支持了进一步实验验证的潜在机制。总体而言，这些发现为儿茶素在肺炎中的潜在作用机制提供了系统层面的视角，但仍需进一步的实验和临床研究来验证这些结果并阐明其治疗意义。
披露
作者声明无利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AMBER14SB 力场 类型：力场 | 用于分子动力学模拟的蛋白质力场 | ||
| AUCell R 包 类型：R 包 | 单细胞基因集活性评分 | ||
| AutoDock Tools 类型：软件 | 受体与配体准备 | ||
| AutoDock Vina 类型：软件 | 分子对接 | ||
| BindingDB 类型：数据库 | BindingDB | 实验验证的化合物-靶标相互作用；文中未提供 URL/版本 | |
| clusterProfiler R 包 类型：R 包 | GO 与 KEGG 富集分析 | ||
| DrugBank 类型：数据库 | DrugBank | 实验验证的化合物-靶标相互作用；文中未提供 URL/版本 | |
| ETCM 数据库 类型：数据库 | ETCM | 芍药活性化合物筛选；文中未提供 URL/版本 | |
| GAFF2 力场 类型：力场 | 用于分子动力学模拟的配体力场 | ||
| GROMACS 2022 类型：软件 | GROMACS | 分子动力学模拟 | |
| GSE261482 类型：公开的批量 RNA-seq 数据集 | 基因表达综合数据库（GEO） | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE261482 | 儿童肺炎与健康对照全血表达数据 |
| GSE295484 类型：公开的单细胞 RNA-seq 数据集 | 基因表达综合数据库（GEO） | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE295484 | 实验性肺炎模型小鼠肺组织单细胞 RNA 测序数据 |
| limma R 包 类型：R 包 | 差异表达分析 | ||
| PharmMapper 服务器 类型：数据库/工具 | PharmMapper | http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/ | 反向药效团映射 |
| 蛋白质数据库（PDB） 类型：数据库 | Protein Data Bank | GADD45A（2KG4）、MMP9（6ESM）和 PYGL（3DDS）的蛋白质结构 | |
| PubChem 数据库 类型：数据库 | PubChem | 儿茶素的三维结构 | |
| R 软件 类型：软件 | R 项目 | 统计分析 | |
| Seurat R 包 类型：R 包 | 单细胞 RNA 测序质量控制、标准化、聚类、UMAP 可视化及细胞注释 | ||
| 相似性整合分析方法（SEA） 类型：数据库/工具 | SEA | http://sea.bkslab.org | 潜在脱靶相互作用预测 |
| sobtop_1.0 (dev3.1) 类型：软件 | 配体参数生成 | ||
| SwissTargetPrediction 类型：数据库/工具 | SwissTargetPrediction | http://www.swisstargetprediction.ch | 化合物靶标预测 |
| TIP3P 水模型 类型：水模型 | 蛋白质-配体复合物的溶剂化 | ||
| 中药系统药理学数据库（TCMSP） 类型：数据库 | TCMSP | https://tcmsp-e.com | 芍药活性化合物筛选 |
| UniProt 数据库 类型：数据库 | UniProt | https://www.uniprot.org | 基因符号标准化 |
| WGCNA R 包 类型：R 包 | 加权基因共表达网络分析 |
参考文献
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