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方法文章

利用基于底物的免疫组织化学方法在免疫活性胶质母细胞瘤干细胞样细胞模型中检测肿瘤内免疫细胞抗原

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DOI：

10.3791/72193

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2026年8月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

本文内容

摘要

本研究提供了一种基于底物的详细且可重复的免疫组织化学工作流程，用于在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的胶质母细胞瘤干细胞来源的肿瘤组织切片中稳定检测单个及双重抗原。该方案有助于识别多种免疫和肿瘤标志物，同时解决了技术上的挑战，具有在其他肿瘤模型中应用的潜力。

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且致死率最高的原发性脑恶性肿瘤，目前缺乏有效的治疗方法。其特征之一是具有强烈的免疫抑制性肿瘤微环境，部分原因在于治疗抵抗性的胶质母细胞瘤干细胞样细胞（GSCs）。本文描述了可重复的基于底物的单色和双色免疫组化（IHC）技术流程，用于检测福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）脑肿瘤切片中肿瘤浸润免疫细胞相关表面抗原及细胞内抗原。这些脑肿瘤来源于小鼠GSCs，并通过原位移植至免疫健全小鼠体内获得。单色IHC流程采用基于辣根过氧化物酶（HRP）的显色检测系统，用于单独可视化免疫细胞抗原；而双色IHC流程则采用连续的碱性磷酸酶（AP）为基础的染色策略，可在同一组织切片中同时检测两种免疫细胞抗原，包括使用相同宿主来源的一抗的实验流程。这些方法为GBM组织中肿瘤浸润免疫细胞相关抗原的显色分析提供了实用且可重复的技术框架，并可能适用于其他临床前肿瘤模型，甚至人类FFPE样本。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是一种侵袭性强、高度浸润性且具有异质性的原发性恶性脑肿瘤，尽管采用当前的标准治疗方案，患者的生存率仍然很低1。GBM的一个显著特征是其强烈的免疫抑制性肿瘤微环境（TME），这导致对免疫治疗策略产生抵抗2,3。多种机制共同驱动GBM中的免疫抑制，包括效应T细胞浸润减少以及T细胞功能障碍和耗竭的诱导4。此外，胶质母细胞瘤干细胞样细胞（GSCs）作为GBM细胞的一个亚群，通过维持一种免疫学上的“冷”TME——其特征为细胞毒性免疫活性受限——进一步促进免疫逃逸5。这些特征凸显了准确表征GBM肿瘤微环境中浸润性免疫细胞群体及其功能状态的重要性。

免疫组织化学（IHC）仍是评估肿瘤组织内免疫细胞浸润最常用的方法之一，因其在保留组织结构的同时，能够在原位实现对细胞标志物的可视化、定位及半定量分析in situ6,7,8,9,10,11,12。既往的免疫组织化学和免疫谱型研究极大地加深了我们对胶质母细胞瘤（GBM）免疫微环境的理解，并鉴定了与肿瘤进展及治疗反应相关的免疫细胞群体12,13,14,15,16。单色显色免疫组织化学特别适用于在福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织切片中检测单一免疫标志物12,13,15,17,18,19,20。相比之下，双色显色免疫组织化学可在同一组织切片中同时可视化两种标志物，有助于评估细胞表型、增殖状态或活化状态12,19,21。

尽管已有这些进展，适用于免疫活性GSC来源GBM模型的实用且标准化的基于底物的显色免疫组化（IHC）方案仍然有限。此外，由于免疫细胞浸润稀疏且具有异质性、瘤内异质性广泛，以及高度免疫抑制且复杂的肿瘤微环境（TME），使得在同一组织切片中准确可视化和解读多种细胞群体变得困难，因此显色免疫组化在GBM中的应用仍比许多其他实体瘤更具挑战性2,3,4。双重显色免疫组化带来了额外的技术难题，尤其是当两种一抗来源于同一宿主物种时，需要仔细优化抗体兼容性，采用顺序染色策略以在同一组织切片中同时检测两种抗原，并选择适当的显色底物，以确保在光学显微镜下能够清晰区分不同标记物。

本文介绍了一种可重复的基于底物的单色和双色免疫组化（IHC）方案，成功检测了免疫功能健全的原位005 GSC来源胶质母细胞瘤（GBM）模型中具有代表性的肿瘤浸润免疫细胞相关表面抗原和细胞内抗原22,23,24。这些基于底物的显色免疫组化方案也可适用于其他临床前肿瘤模型，并可能拓展至人源福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤标本。采集的小鼠脑组织经10%中性缓冲福尔马林固定过夜（约12小时），随后进行常规组织处理和石蜡包埋，方法如前所述19。将FFPE组织块切片（厚度5 µm19）至带正电荷的显微镜载玻片上，室温保存备用。单色IHC采用以辣根过氧化物酶（HRP）为基础的显色检测系统，以3,3′-二氨基联苯胺（DAB）为底物，在光学显微镜下产生棕褐色信号以显示单个抗原。该实验流程适用于检测FFPE组织切片中的膜相关抗原和细胞内抗原。

双色免疫组化可实现在同一组织切片中同时检测两种抗原，但需要额外优化以确保抗体兼容性以及显色信号的清晰分离。当两种一抗来源于不同宿主物种时，可使用种属特异性的二抗，此时双色免疫组化染色相对简单。然而，当两种一抗均来自相同宿主物种时，同时检测的技术难度显著增加。为解决这一挑战，本文所述的双色免疫组化实验流程采用基于碱性磷酸酶（AP）的连续显色染色策略，利用不同的底物，使两种抗原信号在光学显微镜下能够被清晰区分。

两种实验流程均包括组织脱蜡、复水、抗原修复、封闭、染色、脱水、透明和封片步骤。试剂的配制对染色质量和可重复性至关重要（见补充文件1）。同样，一抗的适当稀释度也是成功染色方案的关键，应在使用前立即用2.5%的正常马或山羊血清进行稀释，具体选择取决于相应二抗的宿主物种（见表1）。用于单色和双色染色的种属特异性二抗列表也列于表2中。单色免疫组化使用基于二甲苯的透明和封片试剂，而双色免疫组化则需要无二甲苯的替代试剂（如Histo-Clear），因为底物在二甲苯中部分可溶（见表3中的底物列表）。

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方案

本方案的实施遵循所有相关的监管和机构指南，包括机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定（IACUC方案编号：2004N000067和LA24-0045）。

注意：单色和双色免疫组化（IHC）方案中的多个步骤涉及易燃试剂，包括乙醇和组织透明剂。因此，涉及易燃化学品的操作步骤（如脱蜡、复水、脱水、透明和封片）应在经过认证的化学通风橱中进行，并遵循适当的实验室安全规范。易燃试剂应置于正确标记、带螺旋盖的玻璃容器中，并存放在指定的易燃品储存柜内，符合机构安全指南的要求。所列材料和试剂体积适用于批量处理最多48张显微镜载玻片（两个染色架，每架24张玻片），但整个操作流程可根据实验需求灵活调整规模。

1. 针对石蜡包埋脑肿瘤切片的单色免疫组化

注意：以下方案描述了基于底物的单色免疫组化法，用于检测源自原位005 GSC模型的福尔马林固定石蜡包埋脑肿瘤切片中代表性表面抗原和细胞内抗原。

  1. 脱蜡（20 分钟）：
    1. 将切片放入聚甲醛（POM）切片架中，并将切片架依次浸入染色容器中的二甲苯 I 和二甲苯 II 中，每步各 10 分钟，均在通风橱内进行。确保组织切片在脱蜡过程中始终保持完全浸没在二甲苯中。
      警告：此步骤必须在化学通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、护目镜、面罩和手套。在此步骤及后续任何步骤中，切勿让切片干燥，否则可能导致组织损伤或切片脱落。将二甲苯溶液储存在密闭的玻璃容器中，若溶液保持清洁可重复使用。
  2. 逐步复水（15 分钟）：
    1. 依次将切片在 100%、90% 和 70% 乙醇中各复水 5 分钟。具体操作为：将切片浸入染色容器中的 100% 乙醇中 5 分钟（然后将 100% 乙醇倒回玻璃瓶中以备重复使用），接着在 90% 乙醇中 5 分钟（然后倒回瓶中），最后在 70% 乙醇中 5 分钟（然后倒回瓶中）。
      警告：此步骤必须在化学通风橱中进行，并佩戴与步骤 1.1 相同的个人防护装备。若乙醇溶液储存在密闭玻璃容器中且保持清洁，可在不同实验间重复使用。
  3. 水洗（5 分钟）：
    1. 将切片置于蒸馏水中 5 分钟，完成复水过程。
      注意：在此步骤进行时，请按照补充文件 1中的说明，在 2 L 可微波加热的玻璃烧杯中配制 600 mL（用于 1 个切片架）至 800 mL（用于 2 个切片架）的 1× 抗原修复缓冲液（10 mM 柠檬酸钠缓冲液）。
  4. 抗原修复（约 20 分钟）：
    1. 用塑料封膜覆盖装有新配制的 10 mM 柠檬酸钠抗原修复缓冲液的 2 L 烧杯，以防止预热和长时间微波加热过程中过度蒸发。
    2. 在塑料封膜上戳几个小孔，防止组织切片煮沸时因压力过高导致缓冲液喷溅。
      注意： 佩戴与步骤 1.1 相同的个人防护装备。
    3. 将新配制的 10 mM 柠檬酸钠抗原修复缓冲液预热 3 分钟。将装有复水后组织切片的切片架放入预热的抗原修复液中。
    4. 然后 在最高微波功率（例如 P10）下微波加热组织切片 15 分钟，密切观察烧杯，确保切片始终浸没在液体中，避免因蒸发导致干燥。
      注意： 也可将切片架放入置于蒸锅内的塑料染色槽中进行抗原修复，约 15 分钟，此方法加热更温和，需监控较少。本研究中列出的所有一抗均成功验证并使用了柠檬酸钠缓冲液（10 mM，pH 6.0）作为抗原修复缓冲液，见 表 1。 根据一抗种类及生产商建议，未在本研究中评估的抗体可能需要其他缓冲液，如 EDTA 或 Tris-EDTA。 
  5. 冷却（10–20 分钟）：
    1. 将烧杯从微波炉中取出，放置于工作台面上，静置冷却至室温约 20 分钟。为加速冷却，可将烧杯置于冰水（自来水）中约 10 分钟。
      警告：烧杯温度极高，操作时必须使用耐热手套或烧杯夹。佩戴与步骤 1.1 相同的个人防护装备。
  6. Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤（约 10 分钟）：
    1. 将切片架从烧杯中取出，将切片浸入染色容器中的 1× DPBS 溶液中。
    2. 用 1× DPBS 轻柔静态洗涤两次，每次 5 分钟，避免组织脱落。
  7. 疏水屏障（每张切片 <1 分钟）：
    1. 在 DPBS 洗涤（步骤 1.6）期间，逐一小心取出每张切片，用无绒布（如 Kim Wipes）轻轻擦拭组织切片周围，避免接触组织本身。
    2. 使用疏水屏障笔（如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）笔）在每张组织切片周围画出拒液屏障，然后将切片放回染色容器中的 DPBS 洗涤液中。对所有切片重复此步骤。
      注意：在组织周围建立疏水屏障可防止试剂在不同切片间溢出，并有助于抗体保留在组织上。
  8. 封闭内源性过氧化物酶（5 分钟）：
    1. 倒掉染色容器中的 1× DPBS，加入 3% H₂O₂ 溶液，确保切片或组织切片完全浸没 5 分钟。
      注意：在 3% H₂O₂ 中孵育时间过长可能损伤组织。封闭内源性过氧化物酶活性是防止显色过程中因内源性过氧化物酶导致背景染色的关键步骤。佩戴与步骤 1.1 相同的个人防护装备。
  9. DPBS 洗涤（约 12 分钟）：
    1. 倒掉 3% H₂O₂ 溶液，再次用 1× DPBS 洗涤切片两次，每次 5 分钟。
    2. 第二次洗涤后，将切片从切片架上取下，平放于湿盒中，并在湿盒边缘加入蒸馏水。
    3. 切勿让切片干燥，应立即进入步骤 1.10 的封闭步骤。
      注意：材料表中列出的每个湿盒均可容纳 30 张切片。
  10. 血清封闭（约 70 分钟）：
    1. 每张切片加入 50 µL 5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液，在室温下孵育 30 分钟，同时盖上湿盒盖子，防止封闭液从组织切片上蒸发。
    2. 30 分钟后，将切片轻轻在工作台上的无绒布上轻拍，以去除 BSA 溶液。
    3. 然后，每张切片加入 2.5% 正常马或山羊血清（每张切片一滴），血清宿主物种需与二抗相匹配，在室温下继续孵育 30 分钟，盖上湿盒盖子。孵育结束后，将切片在吸水纸或无绒布上轻拍以去除血清，并立即进入步骤 1.11。
      注意：切勿让切片干燥。在封闭步骤接近结束时，配制用适当封闭缓冲液稀释的一抗（见表 1），以便在封闭完成后立即用于步骤 1.11。
  11. 一抗孵育（约 16 小时）：
    1. 将约 50 µL 一抗（用适当的封闭缓冲液优化稀释，见表 1）加至组织切片上，在湿盒中于 4 °C 孵育过夜（约 16 小时）。
      注意：确保湿盒中指定区域加满蒸馏水，以维持整夜湿度。同时需注意，切勿将组织切片所在的区域或隔间加水，以免切片被淹没。
  12. DPBS（0.1% Tween 20）洗涤（约 18–20 分钟）：
    1. 将切片架放入染色容器中，并加入洗涤缓冲液（1× DPBS，0.1% Tween 20）。
    2. 过夜孵育后，将切片从湿盒中取出，轻轻在吸水纸上轻拍以去除一抗，然后将切片放入染色容器中浸没于洗涤缓冲液（1× DPBS，0.1% Tween 20）的切片架中，倒掉洗涤缓冲液。
    3. 然后，用 1× DPBS（0.1% Tween 20）洗涤切片三次，每次 5 分钟。洗涤完成后，将切片从切片架上取下，平放于湿盒中，并立即进入步骤 1.13。
      注意：若在步骤 1.15 显色后背景染色较强，每次洗涤时间可延长至 10–15 分钟。洗涤过程应轻柔且静态（避免摇动或振荡），以防组织从切片上脱落。
  13. 二抗孵育（约 32–35 分钟）：
    1. 每张切片加入一滴适当的 HRP 标记二抗（根据需要选择抗兔或抗大鼠 IgG，见表 2），盖上湿盒盖子，在室温下孵育 30 分钟。
      注意：为降低步骤 1.15 中的背景，二抗可用 PBS 稀释 1:1。
  14. DPBS（0.1% Tween 20）洗涤（约 18–20 分钟）：
    1. 二抗孵育后，将切片从湿盒中取出，轻轻在吸水纸上轻拍以去除二抗。
    2. 然后将切片放入染色容器中装有洗涤缓冲液（1× DPBS 含 0.1% Tween 20）的切片架中进行短暂洗涤，并倒掉洗涤缓冲液。
    3. 随后，用 1× DPBS（0.1% Tween 20）洗涤组织切片三次，每次 5 分钟。
      1. 在开始显色剂显色步骤（即步骤 1.15）前，将另一个切片架放入装有蒸馏水的染色容器中，作为步骤 1.16 的准备步骤，用于终止显色反应。
      2. 在最后一次洗涤期间，新鲜配制 DAB 工作液（每 1 mL 底物加 1 滴显色剂；见补充文件 1）。
  15. 显色剂显色（30 秒–5 分钟）：
    1. 在步骤 1.14 的第三次洗涤后，将切片从切片架上取出，平放在工作台上，背景为白色。
    2. 每张切片加入 50 µL DAB 工作液，在白色背景上或在光学显微镜下目视监测棕褐色显色情况。
      注意：佩戴与步骤 1.1 相同的个人防护装备。使用白色吸水纸有助于在 DAB 显色阶段观察棕褐色的形成。某些标志物显色可能需要 20–60 秒，其他标志物则需 2–5 分钟（详见步骤 1.16）。
  16. 终止反应（1–2 分钟）：
    1. 一旦在步骤 1.15 中观察到理想的棕褐色信号，立即通过将切片浸入步骤 1.14.3.1 中准备的蒸馏水容器中来终止反应。
    2. 将切片在蒸馏水中冲洗 1 分钟。倒掉蒸馏水，然后进入步骤 1.17（复染）。
      注意：切片可在蒸馏水中停留长达 1 小时而不影响染色效果。 显色所需时间决定了何时启动终止反应步骤。此外，若同一张切片上有 2–3 个标志物（如 CD3、CD4、CD8 或其他，本研究即为此情况），反应时间可能不同；例如，在本系统中，CD8+ 细胞显色通常约需 30 秒，CD3+ 或 CD4+ 细胞需 1–3 分钟，Granzyme B+ 和 Ki67+ 细胞则需更长时间（3–5 分钟）。由于显色时间不同，无法将整张切片浸入蒸馏水中终止反应。相反，应通过直接向每张切片上加入 200–300 µL 蒸馏水，分别终止每个区域的反应。
  17. 复染（<1 分钟）：
    1. 为增强与棕褐色染色的对比度，向染色容器中加入稀释的苏木精（蒸馏水 1:3 稀释），确保切片在稀释苏木精中浸没约 10–20 秒。
      注意：若 DAB 背景较强，可延长复染时间（最长 1 分钟）或短暂使用未稀释的苏木精。
  18. 自来水洗涤（6 分钟）：
    1. 倒掉染色容器中的苏木精，并倒回玻璃瓶中以备重复使用。
    2. 将切片在自来水中冲洗 1 分钟，然后在缓慢流动的自来水中冲洗 5 分钟，冲洗时切片应背对水流方向。倒掉自来水，进入步骤 1.19。
      注意：从此时起至封片的所有步骤均在通风橱内进行。
  19. 逐步脱水（15–17 分钟）：
    1. 将切片依次浸入染色容器中的 70% 乙醇（5 分钟，然后倒回玻璃瓶）、90% 乙醇（5 分钟，倒回瓶中）和 100% 乙醇（5 分钟，倒回瓶中）中进行脱水。
    2. 进入步骤 1.20。
      注意：此步骤在化学通风橱中进行。本脱水步骤使用的乙醇溶液与步骤 1.2 相同，若保持清洁可多次重复使用。
  20. 透明：
    1. 使用与脱蜡步骤（步骤 1.1）相同的二甲苯 I 和 II 溶液清洁组织切片/切片。
    2. 首先将切片在染色容器中的二甲苯 I 溶液中浸 10 分钟（然后倒回玻璃瓶），再在二甲苯 II 溶液中浸 10 分钟。
    3. 将切片保留在二甲苯 II 中，直至完成封片（即步骤 1.21）。
      注意：此步骤中切片绝不能干燥，干燥的切片会变得脆弱；因此，若需要，切片可在二甲苯 II 中停留更长时间以便封片。
  21. 封片：
    1. 将切片逐张从二甲苯 II 中取出，平放在化学通风橱中。在适当大小的盖玻片上滴加一滴以二甲苯为基础的封片介质，然后将盖玻片盖在切片上，使封片介质面向组织切片。
    2. 用拇指轻轻按压盖玻片，使封片介质均匀覆盖所有三张切片，并去除气泡。
      注意：一张切片上有三张组织切片时需使用 24 × 50 mm 盖玻片；两张切片用 24 × 40 mm 盖玻片；单张切片用 24 × 24 mm 盖玻片。每张切片的封片操作必须在 30 秒内完成，因为在通风橱的持续气流下，封片介质会迅速干燥，导致切片上的二甲苯 II 快速蒸发，使切片变得脆弱。
  22. 空气干燥与光学显微镜观察：
    1. 将切片在通风橱中空气干燥至少 2 小时，然后使用光学显微镜进行评估和成像。干燥后，可将封好的切片在室温下长期保存于切片盒中。

2. 石蜡包埋脑肿瘤切片的双色免疫组化

注意：以下方案描述了一种基于底物的双色显色免疫组化（IHC）工作流程，用于在同一张福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）脑肿瘤切片中同时检测两种抗原。与单色免疫组化相比，双色工作流程耗时更长，因其需要进行连续的染色循环，并对每种抗体独立孵育一抗，包括每轮染色均需过夜孵育步骤。然而，这一延长的工作流程能够在同一组织切片中实现可靠的抗原共定位检测，同时保持组织形态完整性，并在光学显微镜下获得清晰区分的显色信号。

  1. 脱蜡（20 分钟）：
    1. 在化学通风橱中，按照上述单色免疫组化步骤 1.1 中所述的相同脱蜡流程进行操作，但使用非二甲苯类透明剂（例如 Histo-Clear I 和 Histo-Clear II 代替二甲苯）。
      注意：使用个人防护装备（PPE），并在化学通风橱中进行此步骤。推荐使用 Histo-Clear，因为显色剂部分溶于二甲苯，无二甲苯处理有助于在双色免疫组化过程中保持染色强度。切勿让切片干燥。若将这些透明剂储存在密封的玻璃容器中且外观清洁，可重复使用。
  2. 梯度复水（15 分钟）：
    1. 与步骤 1.2 中所述的单色免疫组化操作相同；依次使用乙醇浓度逐渐降低的溶液（100%、90% 和 70%）复水，每步 5 分钟。
      ​注意：此处使用一套独立的无二甲苯梯度乙醇，因为步骤 1.2 中用于单色免疫组化的梯度乙醇可能已被 Xylene II 污染。
  3. 水洗（5 分钟）：
    1. 与步骤 1.3 中的单色免疫组化操作相同；将切片置于蒸馏水中 5 分钟，以完成复水过程。
      ​注意：同步骤 1.3；在此 5 分钟期间准备抗原修复液。
  4. 抗原修复（约 20 分钟）：按照步骤 1.4 中所述的单色免疫组化抗原修复流程进行操作。
  5. 冷却（10–20 分钟）：按照步骤 1.5 中所述的单色免疫组化冷却流程进行操作。
  6. DPBS 洗涤（10 分钟）：按照步骤 1.6 中所述的单色免疫组化流程，洗去抗原修复液。
  7. 疏水屏障（每张切片 <1 分钟）：
    1. 在步骤 2.6 的 DPBS 洗涤过程中，按照步骤 1.7 的相同流程/方案，在组织切片周围构建疏水屏障。
    2. 使用疏水屏障笔在每张组织切片周围绘制拒液屏障，然后将切片放回染色容器中的 DPBS 洗涤液中。对所有切片重复此步骤。
  8. 阻断碱性磷酸酶（5 分钟）：
    1. 在所有组织切片完成疏水屏障绘制后，将切片从染色容器中取出，平放于湿化室中，每张切片加一滴内源性碱性磷酸酶阻断液（例如 BLOXALL），孵育 5 分钟。立即进入步骤 2.9。
      ​注意：由于双色免疫组化方案中使用了碱性磷酸酶（AP）偶联的二抗，必须阻断内源性碱性磷酸酶活性，以减少红色或蓝色显色过程中的背景信号。此处使用 BLOXALL 阻断液抑制内源性碱性磷酸酶。该试剂还可抑制内源性过氧化物酶，因此也可用于单色免疫组化方案中替代 3% H₂O₂ 溶液，以阻断内源性过氧化物酶活性。
  9. DPBS 洗涤（10 分钟）：
    1. 在染色容器中用 1× DPBS 溶液清洗切片，每次 5 分钟，共洗两次。
    2. 第二次洗涤后，将切片从染色容器中取出，平放于湿化室中，并在湿化室边缘加入蒸馏水。
      注意：切勿让切片干燥，应立即进入步骤 2.10 的非特异性抗原-抗体结合阻断步骤。
  10. 血清封闭（约 70 分钟）：
    1. 按照步骤 1.10 中所述的单色免疫组化血清封闭流程进行操作。
      1. 首先，在室温下用通用封闭缓冲液（5% BSA；每张切片 50 µL）封闭 30 分钟，然后在加盖湿化室盖的条件下，用与 AP 偶联的抗兔 IgG 二抗宿主物种匹配的 2.5% 正常马血清（每张切片一滴）再封闭 30 分钟。
      2. 封闭结束后，轻轻将切片在吸水纸上轻拍以去除血清，立即进入步骤 2.11。
        注意：在封闭步骤的最后 1 分钟内，按照步骤 1.10 的说明准备一抗 I（见 表 1）。
  11. 一抗 I 孵育（约 16 小时）：
    1. 按照步骤 1.11 中所述的相同流程进行一抗孵育。例如，每张组织切片加入约 50 µL 兔抗 CD3 抗体（用 2.5% 正常马血清稀释至 1:100，见 表 1）。
    2. 在 4 °C 湿化室中孵育过夜（约 16 小时）。
  12. DPBS（0.1% Tween 20）洗涤（约 18–20 分钟）：
    1. 按照步骤 1.12 中所述的单色免疫组化方案进行相同洗涤程序（3 次洗涤，每次 5 分钟）。
    2. 第三次洗涤后，将切片平放于湿化室内。立即进入步骤 2.13。
      注意：注意事项同步骤 1.12，例如每次洗涤时间可延长至 10–15 分钟，洗涤过程应轻柔且保持静止。切勿让切片干燥。
  13. 二抗 I 孵育（约 32–35 分钟）：
    1. 每张切片加一滴 AP 偶联的抗兔 IgG 二抗（见 表 2），在加盖湿化室盖的条件下于室温孵育 30 分钟。
      注意：可在步骤 2.15 中将二抗用 PBS 稀释 1:1 以降低背景信号。
  14. DPBS（0.1% Tween 20）洗涤（约 18–20 分钟）：
    1. 按照步骤 1.14 的方法，使用 1× DPBS/0.1% Tween 20 进行相同洗涤程序。
    2. 注意：在最后一次洗涤期间，根据制造商说明书（见 补充文件 1 中的试剂配制）新鲜配制底物工作液（推荐 5 mL，见 表 3）。
  15. 红色显色（12–15 分钟）：
    1. 完成步骤 2.14 后，将切片平放于工作台面上，背景为白色（如白色吸水纸），操作同步骤 1.15。
    2. 充分混匀新鲜配制的红色底物工作液，然后每张组织切片加入 50 µL（剩余溶液弃去）。
    3. 在室温下孵育组织切片，直至红色显色出现，每隔 2–3 分钟在白色背景下或在光学显微镜下定期观察。
      注意：红色显色所需时间因标志物而异，可能需要 20–30 分钟。但对于使用 AP 检测系统对 005 脑肿瘤切片中的 CD3+ 细胞染色，红色显色通常在 12–15 分钟内完成。
  16. 缓冲液冲洗（5 分钟）：
    1. 一旦在步骤 2.15 中出现理想的红色信号，立即在染色容器中用 1× DPBS/0.1% Tween 20 冲洗切片 5 分钟。
    2. 在此冲洗期间，用适当的封闭缓冲液新鲜配制二抗 II（例如兔抗 Ki67 抗体用 2.5% 正常马血清稀释至 1:100，见 表 1）。
      注意：与单色免疫组化中使用的蒸馏水冲洗（步骤 1.16）不同，此处使用 DPBS/0.1% Tween 20 不仅用于终止反应，还可彻底洗去多余的显色剂，为第二轮染色做准备。
  17. 一抗 II 孵育（约 16 小时）：
    1. 将切片移入湿化室，每张组织切片加入约 50 µL 新鲜配制的兔抗 Ki67 抗体。在 4 °C 孵育过夜（约 16 小时）。
  18. DPBS（0.1% Tween 20）洗涤（约 18–20 分钟）：
    1. 按照步骤 1.12 的相同流程进行操作。
    2. 第三次洗涤后，将切片从染色容器中取出，平放于湿化室中。立即进入步骤 2.19。
  19. 二抗 II 孵育（约 32–35 分钟）：
    1. 按照步骤 2.13 的相同流程进行操作。每张切片加一滴 AP 偶联的抗兔 IgG（见 表 2），在加盖湿化室盖的条件下于室温孵育 30 分钟。
  20. DPBS（0.1% Tween 20）洗涤（约 18–20 分钟）：
    1. 按照步骤 1.14 的方法，使用 1× DPBS/0.1% Tween 20 进行相同洗涤程序。
      注意：在最后一次洗涤期间，根据制造商说明书（见 补充文件 1 中的试剂配制）新鲜配制底物工作液（推荐 5 mL，见 表 3）。
  21. 蓝色显色（10–12 分钟）：
    1. 完成步骤 2.20 后，将切片平放于工作台面上，背景为白色。
    2. 充分混匀新鲜配制的蓝色底物工作液，然后每张组织切片加入 50 µL（剩余溶液弃去）。
    3. 在室温下孵育组织切片，直至蓝色显色出现，每隔 2–3 分钟在白色背景下或在光学显微镜下定期观察。
      注意：与步骤 2.15 中的红色显色类似，蓝色显色所需时间可能为 20–30 分钟。但对于使用 AP 检测系统对 005 脑肿瘤切片中的 Ki67+ 细胞染色，蓝色显色通常在 10–12 分钟内完成。
  22. 缓冲液洗涤（5 分钟）：
    1. 一旦在步骤 2.21 中出现理想的蓝色信号，立即将切片浸入染色容器中的 1× DPBS/0.1% Tween 20 中 5 分钟。弃去洗涤液。
  23. 水洗（1 分钟）：将切片在蒸馏水中冲洗 1 分钟。冲洗后弃去蒸馏水。
  24. 梯度脱水（15–17 分钟）：
    1. 将切片依次浸入染色容器中的 70% 乙醇中 5 分钟（然后将 70% 乙醇倒回玻璃瓶中重复使用），接着在 90% 乙醇中 5 分钟（倒回瓶中），最后在 100% 乙醇中 5 分钟（倒回瓶中）。
    2. 在通风橱中重复每一步。完成后进入步骤 2.25。
      注意：本脱水步骤使用步骤 2.2 中的相同（无二甲苯）乙醇溶液，若溶液外观清洁，可多次重复使用。
  25. 非二甲苯类透明：
    1. 使用步骤 2.1 中使用的相同无二甲苯溶液（即 Histo-Clear）清洗组织切片/切片。
      1. 首先，将切片在染色容器中浸入无二甲苯溶液 I 中 10 分钟（然后将溶液 I 倒回玻璃瓶中重复使用），再浸入无二甲苯溶液 II 中额外 10 分钟。
      2. 将切片保留在无二甲苯溶液 II 中，直至封片（即步骤 2.26）完成。
        注意：若需要，切片可在无二甲苯溶液 II 中停留更长时间以便封片。
        注意：使用个人防护装备（PPE），并在化学通风橱中进行此步骤。
  26. 非二甲苯类封片：
    1. 将切片从无二甲苯溶液 II 中逐一取出，平放于通风橱中。在适当大小的盖玻片上滴加一滴非二甲苯类封片介质，然后将盖玻片盖在切片上，使封片介质面向组织切片。
    2. 用拇指轻轻按压盖玻片，使封片介质均匀覆盖所有三个切片区域，并去除气泡。
      注意：每张切片的封片操作应在 30 秒内完成，因为封片介质干燥较快。使用个人防护装备（PPE），并在化学通风橱中进行此步骤。
  27. 空气干燥与光学显微镜观察：在通风橱中空气干燥切片至少 2 小时，然后使用光学显微镜进行评估和成像。干燥后，封片切片可在室温下的切片盒中长期保存数年。

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结果

使用基于HRP的显色检测系统进行单色免疫组化，在FFPE 005脑肿瘤切片中产生了清晰且可重复的染色结果。表面抗原染色的代表性图像如图1所示，成功检测到T细胞标志物（CD3、CD4、CD8）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）标志物（CD68、F4/80）以及免疫检查点分子程序性死亡配体1（PD-L1）。在所有情况下，均使用DAB作为显色剂呈现出明显的棕色显色信号，组织形态得以保持，背景染色极少，表明该单色免疫组化方案适用于多种膜相关抗原。

单色免疫组化（IHC）染色法用于检测细胞内抗原的适用性如图2所示。代表性染色图像显示，该方法成功检测到多种细胞内标志物，包括转录因子、信号分子、增殖标志物、细胞毒性标志物和凋亡相关标志物，如T-bet、FoxP3、磷酸化STAT1（pSTAT1）、Ki67、颗粒酶B以及裂解型caspase-3。与表面抗原染色类似，细胞内标志物的检测产生了清晰的棕褐色显色信号，同时保持了组织结构的完整性，且非特异性背景染色极少（

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讨论

本研究描述了一种基于底物的显色免疫组化（IHC）工作流程，用于在源自原位GSC模型的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）脑肿瘤组织中，对表面抗原和细胞内抗原进行单色和双色检测，该方法详细且可重复。本研究的主要目标是方法学上的，旨在建立一套实用的、分步操作的实验方案，以实现免疫活性GBM组织中抗原的可靠显色检测。

显色法免疫组化（IHC）因其可在保留组织结构的同时实现抗原在肿瘤微环境（TME）中的空间定位，仍是评估福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中细胞标志物的常用方法15,16。可重复的显色染色需要对多个技术参数进行仔细优化，包括抗原修复、封闭条件、抗体浓度、显色剂显色时间以及染色和封片过程中的组织处理。这些步骤中的微小偏差可能导致组织丢失、信号强度弱、背景染色过强或形态学保存不佳。本实验方案通过提供详细的步骤指导，解决常见的技术难题，以提高染色的一致性和可重复性。

采用单色免疫组化工作流程，代表性染色结果成功检...

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披露

S.D.R. 是与溶瘤性单纯疱疹病毒相关专利的共同发明人，这些专利由乔治城大学和麻省总医院拥有和管理，上述机构已从安进公司（Amgen）和Acti\Vec公司获得专利使用费；S.D.R. 还曾担任Replimune、Cellinta和Greenfire Bio的顾问，并从这些公司获得酬金，同时从EG 427获得酬金和股权。其余作者声明，本手稿的撰写不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系。

致谢

D.S. 部分得到了北卡罗来纳农业和技术州立大学（NCA&T）理学院基金、NCA&T 教师研究员资助（GRADS-4C）以及美国国立卫生研究院（NIH）资助（1R16NS147983-01）的支持。同样，S.D.R. 部分得到了托马斯·A·帕帕斯神经科学讲席基金的支持，R.H.N. 部分得到了美国国立卫生研究院资助（1R35GM153737）的支持。我们感谢 Inder Verma 博士和 Yasushi Soda 博士提供 005 GSCs。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 L 玻璃瓶 CorningCORN1395-2L用于制备和储存 10× DPBS、1× DPBS、蒸馏水和柠檬酸钠缓冲液
2 L Pyrex 玻璃烧杯 Corning1000-2L用于在柠檬酸钠缓冲液中进行微波介导的抗原修复（工作体积为 600–800 mL）
2.5% 正常马血清或正常山羊血清由 Vector Laboratories 提供的预混制剂。根据二抗（抗兔或抗大鼠 IgG）的宿主物种，用于特异性封闭和抗体稀释，以最大程度减少非特异性结合和背景染色
30% 过氧化氢（H2O2）赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）BP2633500
500 mL 玻璃瓶VWR InternationalVWRU10754-818用于制备和储存单色免疫组化中的易燃试剂以及双色免疫组化中的无二甲苯试剂
吸水实验台纸（Kimwipes）在染色过程中用于在后续孵育前去除组织切片上多余的抗体或洗涤液，以最大程度减少试剂残留和交叉污染
Anti-CD3eAbcamab5690
Anti-CD4 eBioscience14-9766-80
Anti-CD68Abcamab125212
Anti-CD8a eBioscience14-0808-80
Anti-Cleaved caspase-3CST9661
Anti-F4/80Abcamab111101
Anti-FoxP3Abcamab54501
Anti-GFPAbcamab183734
Anti-Granzyme BAbcamab4059
Anti-Ki67Abcamab16667
Anti-NeuNCST24307
Anti-PD-L1Abcamab205921
Anti-pSTAT1CST9167
Anti-T-betAbcamab91109
AP 抗兔 IgGVector LaboratoriesMP-5401
AP 抗大鼠 IgGVector LaboratoriesMP-5404-15
BLOXALL 封闭液Vector LaboratoriesSP-6000-100主要用于双色免疫组化，以抑制内源性过氧化物酶和碱性磷酸酶活性
牛血清白蛋白（BSA）Bioworld22070007-2用于配制 5% 通用封闭缓冲液，以减少非特异性结合
Cytoseal 60 永久封片剂 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）18006适用于单色免疫组化的二甲苯兼容型封片剂
DAB 底物和显色剂DAKOK346811-2用于基于 HRP 的单色显色检测。根据制造商’s 说明，在使用前立即向 1 mL DAB 底物中加入 1 滴显色剂。配制后的使用液应废弃。DAB 为潜在致癌物，应按照机构的生物安全和化学品安全指南进行操作
蒸馏水用于试剂配制、洗涤和缓冲液配制。也可使用超纯水或 Milli-Q 水
DPBS（Dulbecco’s 磷酸盐缓冲盐水） Corning55-031-PC
乙醇，200 证明 Decon Labs2701
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）12-550-15带正电荷的显微镜玻璃载片，适用于组织切片
玻璃盖玻片Corning 或 Millipore Sigma应根据每张载玻片上的组织切片数量选择合适的尺寸。常见尺寸包括：24 mm × 24 mm（单个组织切片）、24 mm × 40 mm（两个组织切片）、24 mm × 50 mm（三个组织切片）
苏木精赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）220-102
Histo-Clear（1 L）电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）64111-01用于双色免疫组化的无二甲苯透明剂。准备两个 500 mL 瓶子，分别标记为 Histo-Clear I 和 Histo-Clear II
HRP 抗小鼠 IgGVector LaboratoriesMP-7402-15
HRP 抗兔 IgGVector LaboratoriesMP-7401
HRP 抗大鼠 IgGVector LaboratoriesMP-7444-15
湿化孵育盒 Stellar ScientificHS-120879用于组织切片与一抗和二抗的孵育
疏水屏障笔（PAP 笔）Vector LaboratoriesH-4000用于在组织切片周围创建疏水屏障，以在孵育过程中保留抗体和试剂，并防止同一载玻片上多个组织切片之间的交叉污染
KimwipesKimtech Science34155用于轻柔去除组织切片上残留的试剂和洗涤缓冲液
磁力搅拌器 IKAI-10001529用于配制柠檬酸钠和 DPBS 储存液
微波炉松下（型号：NN-L931BF）SN: 6H61050036容量为 2.2 立方英尺。用于使用 2 L 玻璃烧杯进行热介导的抗原修复
尼康光学显微镜 尼康（Nikon）SN: 707798尼康 Eclipse Ci-L sn: 707798，Sola 光源引擎 5M5-LCR-VA sn: 11787，软件：NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00，相机：尼康 DS-Fi3 sn: 110865（彩色）& Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015（黑白）
pH 计 VWR International77619-152用于调节抗原修复缓冲液的 pH 值
塑料保鲜膜赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）01810用于在微波加热过程中松散覆盖抗原修复缓冲液，以最大程度减少蒸发并防止组织干燥
聚甲醛（POM）载玻片架 MopecSP234与上述染色容器兼容；每个架子最多可容纳 24 张显微镜载玻片
精密天平 梅特勒-托利多（Mettler Toledo）30697420用于称量柠檬酸钠和 DPBS 粉末
冰箱赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）TSG3005CA用于储存对温度敏感的试剂和抗体
载玻片储存盒赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）22-267294
染色容器/染色缸 MopecSP233每个容器可容纳一个 24 片染色架
搅拌子 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）14-512-128用于配制柠檬酸钠和 DPBS 储存液
三水合柠檬酸钠二水合物 赛默飞世尔科技化学品（Thermo Scientific Chemicals）AA3643936
Tween 20 赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）AAJ20605AP
VectaMount PT 永久封片剂 Vector LaboratoriesH-5600-60用于双色免疫组化的无二甲苯永久封片剂
Vector Blue 碱性磷酸酶底物试剂盒 Vector LaboratoriesSK-5300用于双色碱性磷酸酶免疫组化中的蓝色显色信号生成。由于 Vector Blue 部分溶于二甲苯，因此双色染色流程中必须使用无二甲苯的透明剂和封片剂
Vector Red 碱性磷酸酶底物试剂盒Vector LaboratoriesSK-5100用于双色碱性磷酸酶免疫组化中的红色显色信号生成
二甲苯（1 L） StatLab8400-1用于单色免疫组化的脱蜡和透明步骤。准备两个 500 mL 瓶子，分别标记为二甲苯 I 和二甲苯 II

参考文献

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