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研究文章

人Wings Apart样蛋白作为宫颈癌血清诊断生物标志物的研究:整合生物信息学分析与血清验证

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DOI:

10.3791/72194

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2026年8月21日

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本文内容

摘要

本研究通过整合生物信息学分析和血清验证,评估人类翅膀脱落样(hWAPL)蛋白作为宫颈癌血清诊断生物标志物的价值,并证明联合血清hWAPL与鳞状细胞癌抗原可提高诊断效能。

摘要

宫颈癌仍然是全球女性健康的主要威胁,目前可用于早期检测和治疗分层的可靠血清生物标志物仍然有限。人类 wings-apart-like(hWAPL)蛋白已被发现参与宫颈癌的发生,但其诊断和临床价值尚未完全阐明。为填补这一空白,本研究整合了包括癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas)、GEPIA2、人类蛋白质图谱(The Human Protein Atlas)以及单细胞转录组数据在内的公共多组学数据集,系统分析了hWAPL的表达特征、临床病理关联、免疫细胞浸润、共表达网络、翻译后修饰以及药物敏感性预测。这些发现随后在一个独立的单中心血清队列中进行了验证,该队列包括89例经组织学确诊的宫颈鳞状细胞癌患者和89名健康女性对照。检测了血清中hWAPL和鳞状细胞癌抗原(SCC)的水平,并通过受试者工作特征曲线分析评估其诊断效能。in silico分析显示,hWAPL在多种恶性肿瘤中广泛上调,尤其在宫颈癌中显著,主要富集于恶性上皮细胞和单核细胞/巨噬细胞中,且与较短的无进展间隔期相关,预测对顺铂、紫杉醇和5-氟尿嘧啶的敏感性降低,同时预测对MCL-1和Wee1抑制剂具有敏感性。在血清队列中,患者组的hWAPL水平显著高于对照组,其曲线下面积达0.961,优于单独使用SCC。将hWAPL与SCC联合使用进一步提升了诊断效能(曲线下面积0.974,敏感性93.3%,特异性95.5%)。这些结果表明,血清hWAPL可能是宫颈鳞状细胞癌的一种潜在新型诊断生物标志物,与SCC联合可增强其诊断性能;而其在化疗耐药性和肿瘤免疫微环境重塑方面的相关性尚属假设性发现,需进一步实验验证。

引言

宫颈癌在全球女性中是第四大常见恶性肿瘤,也是女性癌症相关死亡的第四大原因,2022年约有66万例新发病例和35万例死亡病例1。这种疾病负担在低收入和中等收入国家尤为严重,这些地区的系统性筛查项目仍显不足2。尽管人乳头瘤病毒(HPV)疫苗接种和巴氏涂片筛查已在许多高收入国家显著降低了发病率,但现有的诊断方法仍存在明显局限性。HPV DNA检测的特异性欠佳,而细胞学判读本身具有主观性和变异性。这些不足凸显了迫切需要开发新型、客观且微创的血清生物标志物,以补充现有的诊断体系。

鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)是宫颈鳞状细胞癌的主要血清学生物标志物,而宫颈鳞状细胞癌是一种组织学亚型,约占所有宫颈癌病例的85–90%3。一项系统综述和荟萃分析表明,鳞状细胞癌患者治疗前SCC-Ag水平升高与显著较差的总生存率和无进展生存率相关4。在复发监测方面,SCC-Ag对鳞状细胞癌的敏感性为78.9%,特异性为91.2%4。然而,SCC-Ag在早期检测中的应用价值有限,因为在确诊为宫颈鳞状细胞癌的个体中,仅有28–88%的人出现SCC-Ag水平升高5。此外,许多早期肿瘤并不表现为SCC-Ag浓度升高,且该生物标志物对非鳞状组织学亚型无临床意义3。因此,发现新的血清生物标志物以提高诊断敏感性,特别是针对早期宫颈癌,是一项重要且尚未解决的临床需求。

除 SCC-Ag 外,已有多种其他循环标志物在宫颈癌中得到评估,包括癌胚抗原、肿瘤抗原 CA-125、细胞角蛋白-19 片段(CYFRA 21-1),以及近期受到关注的循环肿瘤 DNA 和人乳头瘤病毒游离 DNA。然而在实际应用中,这些标志物受限于对早期疾病敏感性不足、对在宫颈癌中占主导地位的鳞状组织学类型特异性较差,或需要尚未广泛普及的专用分子检测平台。这一现状为一种既在机制上与宫颈癌发生密切相关、又可通过常规免疫分析方法检测的蛋白质标志物留下了重要的发展空间。

人类 hWAPL 基因(也称为 WAPL)编码一种黏连蛋白释放因子,该因子在有丝分裂过程中姐妹染色单体的正确分离中起关键作用6。Oikawa 等人首次鉴定出 hWAPL,并将其描述为一种新型人类基因,其表达可被人乳头瘤病毒(HPV)的癌蛋白 E6 和 E7 诱导。该基因在子宫颈癌组织中呈现高表达,而在其他正常及肿瘤组织中仅检测到极低水平的表达7。进一步研究表明,与良性宫颈上皮相比,宫颈癌组织中 hWAPL mRNA 水平显著升高,且其表达水平与宫颈上皮内瘤变(CIN)的分级呈正相关8,9。从机制上看,WAPL 的异常过表达会破坏有丝分裂和胞质分裂过程,从而导致染色体不稳定性,并促进肿瘤进展10。此外,WAPL 在肿瘤发生及细胞周期进程调控中亦发挥重要作用。在多种宫颈上皮样本中已鉴定出多个 WAPL 的可变剪接异构体,表明其具有丰富的分子多样性11。除在宫颈癌发生中的明确作用外,越来越多的证据表明 hWAPL 在宫颈病变中具有潜在的诊断价值。此外,通过 TAT 介导的 hWAPL 沉默可降低 HPV E6 的表达,抑制宫颈癌干细胞的侵袭能力与克隆形成能力,并在裸鼠模型中显著抑制肿瘤生长12。这些研究结果提示,hWAPL 可作为宫颈癌干细胞增殖的标志物,并可能成为一个具有潜力的治疗靶点12。

尽管这些结果令人鼓舞,但仍有一些重要问题尚未解答。首先,血清 hWAPL 区分宫颈癌患者与健康个体的能力,以及其相对于已确立的生物标志物 SCC 的表现,或与 SCC 联用时的诊断效能,尚未在严格控制的研究人群中得到评估。其次,血清 hWAPL 水平与 HPV 感染状态之间,以及与临床分期、组织学分级和淋巴结转移等关键临床病理特征之间的关系仍不明确。第三,hWAPL 与 SCC 是否在诊断中具有互补价值,尚未被研究。

尽管hWAPL已在组织和细胞水平上被研究,但此前尚无研究证实该蛋白是否可在循环系统中检测到,或基于血清的检测方法能否将宫颈癌患者与对照人群区分开来;本研究正是针对这一特定的知识空白而开展。在既往基于组织的研究基础上而非重复其工作,我们整合了来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas)及其他公开数据库的hWAPL生物信息学分析结果,并首次在独立的单中心队列中开展基于血清的蛋白检测,该队列包括89例宫颈鳞状细胞癌患者和89例健康女性对照。主要研究目标是评估血清hWAPL的诊断效能,即通过受试者工作特征曲线下面积(AUC)来判断其单独或联合鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)区分宫颈鳞状细胞癌患者与健康对照的能力;因此,主要结局指标为曲线下面积(AUC),次要指标为约登指数最佳阈值下的敏感性和特异性。次要研究目标包括表征血清hWAPL水平与HPV状态及其他临床病理特征之间的关联,并通过生物信息学分析提出关于hWAPL生物学背景的机制性假说。

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方案

本研究经陕西省人民医院伦理审查委员会批准(批准文号:2024-R055),并依照《赫尔辛基宣言》的原则进行。在采集任何血液样本之前,均已从每位参与者处获得书面知情同意。所有人血及血清标本的采集、处理和储存均遵循医院检验科的机构指南。

所有静脉血和血清标本均被视为可能具有传染性的生物材料。样本处理由经过培训的人员在二级生物安全实验室中进行,并穿戴适当的个人防护装备。与生物材料接触过的一次性塑料器皿、移液器吸头及使用过的微孔板须经高压灭菌处理,或作为生物危害废弃物收集,并依照当地法规通过机构授权的医疗废物处理渠道进行处置。

研究设计概述:
本研究的工作流程总结于研究设计示意图(补充图 S1)中,并分为两个互补的分支。在in silico分支中,分析了公开的转录组、单细胞、蛋白质、翻译后修饰、免疫及药物敏感性数据集,以表征hWAPL的生物学背景并提出潜在的作用机制假设。在实验分支中,在一个独立的单中心队列中检测了血清hWAPL和SCC-Ag水平,并通过受试者工作特征分析和逻辑回归评估二者单独及联合使用的诊断效能。两个分支仅在结果解读层面进行整合,其中血清检测分支提供了唯一的实验验证。

泛癌种及宫颈鳞状细胞癌基因表达谱分析
通过 UCSC Xena 浏览器获取了来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)的 RNA 测序数据。本研究中使用的所有公共数据库和网络工具均于 2025 年 9 月至 10 月期间访问,具体版本及访问日期详见材料表。对以每百万比对读段中每千碱基转录本的片段数(FPKM)量化表示的WAPL基因表达水平,添加 1 作为假计数后进行 log₂ 转换。随后利用转换后的数值,在多种癌症类型的恶性组织与配对的相邻正常样本之间进行比较分析。针对宫颈恶性肿瘤的深入研究,提取了宫颈鳞状细胞癌和内宫颈腺癌(CESC)中特异的WAPL表达数据。进一步将这些肿瘤样本中的表达谱与正常宫颈上皮对照组织中的表达水平进行可视化展示和比较。

分析WAPL转录本异构体
使用GEPIA2数据库检测WAPL转录本异构体的表达谱。特定异构体通过其对应的Ensembl转录本标识符(ENST)进行界定。表达水平以每百万转录本的对数(底数为2)加1 [log₂(TPM+1)] 计算,并以小提琴图形式进行图形化展示。

单细胞RNA测序分析
单细胞RNA测序数据集GSE168652来自基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)。数据预处理、质量评估、标准化和聚类分析均通过scCancerExplorer平台完成。过滤掉表达基因数少于200个的细胞,以及在少于三个细胞中被检测到的基因。标准化采用Log-Normalize方法,缩放因子设为10,000。

使用方差稳定化转换鉴定出2,000个变异程度最高的基因,并将其用于主成分分析(PCA)。基于前30个主成分,采用均匀流形近似与投影(UMAP)进行降维。通过Louvain算法在分辨率为0.8的条件下实施基于图的聚类。根据已确立的标记基因对细胞簇进行注释。检测WAPL在不同细胞群体中的表达水平,并使用CellCycleScoring方法确定细胞周期阶段。

蛋白表达与翻译后修饰分析
利用人类蛋白图谱数据库(Human Protein Atlas database)评估了WAPL在宫颈鳞状细胞癌(CSCC)中的表达及亚细胞分布。使用PhosphoSitePlus鉴定翻译后修饰(PTM)位点。此外,采用仙桃学术工具(Xiantao Academic tool)探讨了CSCC中WAPL表达水平与参与蛋白修饰过程的相关基因(包括AKT1、AKT2、KAT2B、EP300、USP7和KAT5)之间的潜在关联13,14,15,16,17。

共表达网络与功能富集分析
通过STAR比对工具处理并标准化为每百万转录本(TPM)的TCGA-CSCC RNA测序数据,从基因组数据共享中心(GDC)门户网站获取。为鉴定与WAPL共表达的基因,筛选阈值设定为绝对Pearson相关系数大于0.6,且统计学显著性水平P < 0.05。

为了研究与WAPL相关的生物学功能,首先根据WAPL的中位表达值将患者分为高表达组和低表达组,进行差异表达分析。使用Xiantao学术平台鉴定差异表达基因,随后进行基因本体(Gene Ontology)富集分析,包括生物过程、细胞组分和分子功能类别,并结合京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析。此外,利用STRING数据库独立探索与WAPL相关的蛋白质相互作用关系,并在Cytoscape中重建和分析所得的相互作用网络。

使用 Reactome、WikiPathways 和 KEGG 数据库进行基因集富集分析(GSEA),筛选标准设定为绝对标准化富集评分(|NES|)> 1 且错误发现率(FDR)< 0.25。

免疫浸润分析
采用 TIMER 2.0 和 xCell 计算工具分析 TCGA-CESC 队列的转录组数据,以定量评估 24 种不同免疫细胞群体的浸润状态。

药物敏感性预测
药物敏感性预测通过 GDSC2 数据库并使用 oncoPredict R 软件包获得。针对一组 86 种化疗化合物计算了半数抑制浓度(IC50)。

生存与诊断分析
使用仙桃分析平台构建总生存期(OS)和无进展间隔期(PFI)曲线,根据WAPL表达水平的中位数将患者队列分为两组。通过单变量和多变量Cox比例风险回归模型评估各变量的预后意义。为评价WAPL和SCC(SERPINB3)在区分皮肤鳞状细胞癌(CSCC)与邻近正常组织中的诊断效能,对来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas)的转录组数据进行受试者工作特征(ROC)曲线分析,数据以每百万转录本(TPM)表示。

血清样本采集与ELISA
本研究获得了陕西省人民医院机构审查委员会的批准(批准号:2024-R055),并按照《赫尔辛基宣言》的规定执行。共收集了89例经组织病理学确诊为宫颈鳞状细胞癌(CSCC)患者的血清样本,以及89例年龄匹配的健康女性对照样本。CSCC组患者的中位年龄为54岁,年龄范围为31–77岁,对照组的中位年龄为41岁,年龄范围为30–52岁。所有宫颈癌病例均为首次诊断且在采血时未接受过任何治疗;样本均在手术、化疗或放疗开始前采集。需要指出的是,尽管两组来自相似的临床环境,但中位年龄相差13岁。这一差异在结果部分进行了直接分析,并在专门的年龄校正敏感性分析中予以探讨,同时在讨论部分被明确列为研究的局限性之一。

静脉血采集至无抗凝剂的试管中,在室温下静置10–20分钟使其凝固,随后在2,000–3,000 × g条件下离心20分钟。血清在采集后1小时内分离,立即分装,并于−20 °C保存;所有样本从静脉穿刺到冷冻的间隔均未超过2小时。分装样本在分析前仅经历一次冻融循环,所有检测均在储存后三个月内完成。所得血清被分装后于−20 °C保存。任何溶血或脂血样本均被排除在分析之外。

采用市售的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒,基于双抗体夹心法对血清中hWAPL蛋白水平进行定量检测。简言之,将校准标准品和待测样本分别重复加样至预先包被有特异性识别hWAPL的捕获抗体的微孔板孔中,随后在37 °C孵育30分钟。经过一系列洗涤步骤以去除未结合物质后,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hWAPL检测抗体,并在相同条件下孵育。

进一步洗涤后,将显色底物溶液A和B各50 µL加入孔中,在37 °C避光孵育10分钟以显色。加入终止液(50 µL)以终止酶促反应。反应终止后15分钟内,在主波长450 nm处测定吸光度,参考波长为630 nm。使用浓度范围为10–450 pg/mL的系列稀释校准品建立标准曲线。每个未知样本的hWAPL浓度通过该标准曲线插值计算,并根据预分析阶段的稀释倍数进行校正。实验严格按照制造商说明书操作。根据制造商说明,试剂盒的工作检测范围为10–450 pg/mL。样本最终以5倍稀释后进行检测;对于吸光度超过最高浓度校准品的样本,进一步稀释后重新检测,并在反向计算时应用总稀释倍数。在检测研究样本前,已在血清基质中验证了方法的分析性能:高浓度血清混合样本的系列稀释显示在校准范围内具有可接受的线性,三种血清混合样本中加入重组校准品的回收率落在可接受范围内,符合试剂盒双抗体夹心设计的预期。定量下限对应于最低浓度校准品(10 pg/mL)。我们强调,该试剂盒被制造商明确标注为仅用于科研,不属于经过临床验证的体外诊断医疗器械;因此,所获得的绝对浓度值及由此推导的截断值应被视为平台特异性和临时性结果,如下文所述。

同时,采用Abbott Alinity i平台通过化学发光微粒免疫分析法(CMIA)定量检测血清SCC-Ag水平,其上限参考值为1.5 ng/mL。所有分析步骤均由实验室人员在不知晓疾病状态及包括临床分期、组织学分级和HPV状态在内的所有临床变量的情况下,以双复孔方式进行。所用方法的批间和批内变异系数均保持在10%以下。

统计分析
由于血清 hWAPL 浓度根据 Shapiro–Wilk 检验未能满足正态性假设(所有 P < 0.05),后续分析采用非参数方法进行。因此,连续变量以中位数及四分位间距(IQR)表示。两组独立样本之间的差异采用 Mann–Whitney U 检验进行评估,而三组或更多组之间的比较则使用 Kruskal–Wallis H 检验。变量间的相关性分析中,连续型或有序数据采用 Spearman 秩相关分析,二分类变量(如 HPV 感染状态)则采用点二列相关系数。生存结果的比较采用对数秩检验,风险比及其 95% 置信区间通过 Cox 比例风险回归模型估算。

通过 ROC 曲线分析评估诊断效能,各生物标志物的最佳截断值通过最大化约登指数确定。采用 DeLong 方法检验曲线下面积(AUC)的差异。为探讨联合诊断价值,构建二元逻辑回归模型,以疾病状态(皮肤鳞状细胞癌 = 1;对照 = 0)为因变量,血清 hWAPL 和鳞状细胞癌抗原为自变量。将所得预测概率保存为综合评分,用于后续的 ROC 分析。

使用limma软件包评估WAPL高表达组与WAPL低表达组之间的药物敏感性差异,设定的筛选阈值为校正后P值<0.05且|log₂倍数变化|>0.3。统计学显著性定义为双尾P值<0.05。所有分析均使用SPSS、R或指定的在线工具完成。所使用的R软件包包括survival、survminer、pROC、ggplot2、oncoPredict和limma。对于所有同时检验多个假设的高维分析,即泛癌比较、共表达筛选、差异表达分析与功能富集分析以及药物敏感性分析,均采用Benjamini–Hochberg方法对P值进行多重比较校正,并在适用情况下报告校正后的P值;而人源WAPL(hWAPL)与单个基因或免疫细胞比例之间的成对相关性则报告原始P值,此类相关性结果被视为假设生成性结果,而非确证性结果。由于公共队列中部分临床病理学变量存在数据缺失,针对缺失数据的样本在分析时采用成对剔除而非插补法处理,各变量的可评估病例数见表1。为校正血清队列间年龄差异的影响,进行了基于年龄校正的二元逻辑回归敏感性分析,并在各组内计算血清hWAPL水平与年龄之间的Spearman相关性。

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结果

在多种人类恶性肿瘤中,尤其是宫颈癌组织中,hWAPL 广泛上调
对 TCGA 数据集的泛癌分析显示,与相应正常组织相比,WAPL 在大多数实体瘤中表达显著升高(图 1A)。值得注意的是,在包括乳腺浸润性癌(BRCA)、结肠腺癌(COAD)、食管癌(ESCA)和子宫内膜癌(UCEC)在内的 21 种癌症类型中,宫颈鳞状细胞癌和子宫内膜腺癌(CESC)的 hWAPL 表达水平显著上调,提示其在上皮性恶性肿瘤中具有广泛的促癌作用。

特别针对宫颈癌,我们观察到hWAPL在肿瘤组织(n = 306)中的表达高于正常宫颈上皮组织(P = 0.024;图1B)。需要注意的是,TCGA宫颈癌数据集中仅包含3例组织学上正常的宫颈样本,因此该比较基于一个样本量小且存在变异性的正常对照组,应将其结果视为趋势性提示而非确定性结论。为增强结论的可靠性,我们利用GEPIA2工具,...

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讨论

我们对TCGA数据的泛癌分析显示,与正常组织相比,WAPL 在大多数实体瘤中的表达显著升高,其中在宫颈鳞状细胞癌(CESC)中上调最为显著。这一发现与先前的研究结果一致,即hWAPL mRNA主要在宫颈癌中表达,而在其他正常及恶性组织中表达极低7。Oikawa等人首次将hWAPL鉴定为参与宫颈癌发生发展的新基因,证实其具有致癌特性,并与子宫颈癌相关9。我们的研究通过提供全面的泛癌视角,拓展了这些早期发现,提示hWAPL可能在多种上皮性恶性肿瘤(包括BRCA、COAD和ESCA)中发挥致癌作用。

人类WAPL在宫颈癌中过表达的生物学意义,因其在调控姐妹染色单体黏连中的明确作用而进一步凸显19。WAPL 作为一种黏连蛋白释放因子,通过解析姐妹染色单体,促进有丝分裂过程中染色体的准确分离10。正如 Sekhar...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢所有参与本研究的受试者和临床工作人员。本研究由陕西省自然科学基础研究计划(项目编号:2021JM-552)资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Abbott GmbH,德国威斯巴登未提供用于 SCC-Ag 检测
Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.,中国深圳型号 RT-3100用于板洗
上海安亭科学仪器厂,中国上海型号 TLXY-IIC 低速离心机用于血清样本离心
Cytoscape Consortium版本 3.9.1用于网络可视化;网络可视化
美国国家癌症研究所https://portal.gdc.cancer.gov;访问时间:2025年10月用于获取 TCGA-CSCC STAR比对后的 TPM 数据;RRID:SCR_014514
在线平台/数据库不适用用于药物敏感性预测;药物敏感性参考数据
美国国家生物技术信息中心GPL24676 Illumina NovaSeq 6000 (Homo sapiens)用于单细胞 RNA 测序数据集的获取;单细胞 RNA-seq 数据集
在线平台不适用用于转录本异构体和基因表达分析;转录本异构体与表达分析
R 软件包版本 3.4.4用于数据可视化
在线平台/数据库不适用用于蛋白质表达与亚细胞定位分析;蛋白质表达与定位分析
上海复生生物科技有限公司A977261-96TA977261-96T;双抗体夹心 ELISA;检测范围 10–450 pg/mL;仅供研究使用 (www.affandi-e.com)
R 软件包版本 3.54.0用于差异分析
Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.,中国深圳型号 RT-6100用于光密度测定
R 软件包版本 0.2用于药物敏感性(IC50)预测;RRID:SCR_023220
在线平台/数据库不适用用于翻译后修饰分析;翻译后修饰位点分析
R 软件包版本 1.18.0用于 ROC 曲线分析
统计计算基金会(R Foundation for Statistical Computing)版本 4.2.1用于统计分析和生物信息学分析;统计与生物信息学分析
Abbott GmbH,德国威斯巴登货号 09P3374用于血清 SCC-Ag 定量
在线平台不适用用于单细胞 RNA 测序分析
三力医疗科技发展有限公司,中国湖南浏阳未提供用于静脉采血
IBM Corp.版本 26.0用于统计分析;统计分析
STRING Consortium版本 11.5用于蛋白质-蛋白质相互作用网络分析;蛋白质-蛋白质相互作用网络
R 软件包版本 3.4用于生存分析
R 软件包版本 0.4.9用于生存曲线可视化
美国国家癌症研究所https://www.cancer.gov/tcga;访问时间:2025年10月RRID:SCR_003193;癌症转录组数据
在线平台http://timer.cistrome.org;访问时间:2025年10月RRID:SCR_018737;免疫浸润分析
UCSC Xena 浏览器https://xenabrowser.net;访问时间:2025年10月用于 TCGA 数据获取;TCGA 数据获取
在线平台/工具版本 1.0用于免疫细胞浸润估算
在线平台https://www.xiantaoxueshu.com;访问时间:2025年10月用于差异表达、相关性、生存和诊断分析

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