氧化还原响应型表面增强拉曼散射微针用于监测糖耐量受损大鼠的针灸反应

摘要

这项探索性大鼠模型研究提出了一种氧化还原敏感的表面增强拉曼散射（SERS）活性微针，可用于对糖耐量受损大鼠进行针灸干预，同时比率式追踪与局部氧化能力及氧化还原电位相关的SERS指标。

摘要

糖耐量受损（IGT）与氧化还原稳态失衡及氧化应激增强相关，但在针灸干预过程中对氧化还原相关变化进行动态体内追踪仍面临技术挑战。本研究开发了一种氧化还原敏感的表面增强拉曼散射（SERS）活性微针系统，用于在IGT大鼠模型中同步实施针灸干预，并相对比率式追踪与氧化能力（OC）和氧化还原电位（RP）相关的SERS指标。通过将金纳米壳（GNS）分别修饰对苯二胺（p-PDA）以响应OC、蒽醌以响应RP，制备了对氧化和氧化还原敏感的SERS探针。将探针加载至针灸针上的两条蚀刻沟槽中，构建出SERS活性微针。本探索性研究采用雄性SPF级Sprague–Dawley大鼠。3只大鼠作为正常对照组，20只大鼠通过高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）注射诱导IGT。经筛选后，18只符合标准的IGT大鼠被分为高脂饮食组和正常饮食组，每组9只。每组进一步分为针刺穴位捻转、非穴位捻转和针刺穴位直刺三个亚组，每亚组3只。每日施针两次，连续7天，记录空腹血糖（FPG）、餐后2小时血糖（2hPG）以及与OC和RP相关的SERS指标。结果显示，在该IGT大鼠模型中，于穴位进行捻转针刺可降低FPG和2hPG水平，并改变与OC和RP相关的SERS指标。由于未包含外部校准曲线、独立的生化氧化应激检测、探针溶出测试及生物相容性检测，SERS比率应被解读为相对的氧化还原相关光学指标，而非绝对的生化浓度或绝对的氧化还原电位值。这些结果支持SERS活性微针作为将针灸干预与局部比率式SERS追踪相结合的一种可行的探索性临床前研究平台，适用于IGT大鼠模型。

引言

糖耐量受损（IGT）是指机体对葡萄糖的耐受能力下降，代表了正常血糖与糖尿病血糖之间的一个过渡阶段¹。因此，IGT 是2型糖尿病发展过程中一个关键的早期预警信号，并且是可逆的阶段²。临床数据显示，约30%的糖耐量受损人群将在5至10年内进展为2型糖尿病³；然而，通过及时干预，这一比例可降低至10%以下⁴。

糖耐量减低（IGT）是一个动态且复杂的过程，持续的高血糖环境是导致氧化代谢紊乱的关键诱因⁵。当机体长期处于高血糖状态时，线粒体呼吸链功能异常，活性氧（ROS）的生成速率增加30–50%，直接增强机体的氧化能力⁶；同时，高糖水平抑制谷胱甘肽还原酶等关键酶的活性，使抗氧化系统无法及时清除过量的活性氧，进一步破坏氧化还原平衡。此外，IGT常伴随胰岛素抵抗和β细胞功能轻度受损等病理变化，引发一系列生物和生化反应^7,8。随着氧化还原状态的演变，这些变化进一步加剧葡萄糖代谢紊乱，并提高糖尿病并发症的发生风险，包括视网膜病变、肾病和心血管疾病^9,10。因此，对IGT个体或动物模型中的氧化能力（OC）和氧化还原电位（RP）进行监测，有助于深入理解IGT发生发展的机制，并为制定靶向治疗策略提供指导。

针灸已有3000多年的历史，在多种疾病的治疗中显示出良好的临床疗效¹¹。此外，大量动物实验研究表明，针灸可通过增强抗氧化酶系统并减少脂质过氧化，对动物模型中的氧化应激状态发挥有益调节作用¹²。作为一种传统中医疗法，针灸在糖尿病和糖耐量异常（IGT）的治疗中也显示出显著益处。有研究报道，关元（CV4）和三阴交（SP6）穴位可激活骨骼肌中的SIRT1/PGC-1α通路，从而改善肥胖型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗¹³。此外，天枢（ST25）穴位可调节位于下丘脑外侧区的葡萄糖抑制性神经元活性，参与糖脂代谢的调控¹⁴。然而，目前关于血管内针灸作用机制的研究主要集中在神经调节、免疫调节和胃肠道系统，针灸可能通过调节自主神经功能影响葡萄糖代谢，或通过改善肠道菌群平衡间接调节血糖水平^15,16。针灸在治疗糖耐量异常中的具体作用机制及其对氧化应激的影响，尚缺乏深入的研究和实验数据支持。

表面增强拉曼散射（SERS）具有高灵敏度和高特异性，可实现多种分析物的检测。基于纳米光纤的SERS纳米探针¹⁷，壳聚糖膜¹⁸，并且先前的研究已证明针灸针¹⁹ 可用于生物标志物、神经递质及其他细胞生化方面的检测 体内针灸针尤其可作为深部组织检测的有前景工具，能够实现微创检测 原位 监测，随后进行 离体 分析。针灸作为一种成熟的治疗方法，具有极其广泛的临床应用。近期研究表明，表面增强拉曼散射（SERS）技术赋能的光纤、伤口敷料和微针装置能够提供支持 原位 或在生物学相关环境中对氧化还原相关信号进行微创或最小侵入式追踪^20,21与此同时，具有表面增强拉曼散射活性的针灸针及相关微针系统已作为将传感功能与组织干预相结合的有前景载体而出现¹⁹，从而制备出具有表面增强拉曼散射活性的微针 体内 反应和 体外 SERS 检测能力

本研究在先前报道的用于检测葡萄糖诱导应激模型中氧化能力与氧化还原电位相关信号的表面增强拉曼散射（SERS）活性微针策略基础上进一步展开。然而，本研究在生物学背景与实验目的上均与先前研究有所不同。具体而言，本研究将SERS活性微针平台应用于糖耐量受损的大鼠模型，并将局部比率型SERS追踪与针灸干预相结合。本研究进一步比较了针灸穴位与邻近非穴位区域，评估了不同的针刺操作手法，并在为期7天的干预期间监测了与氧化还原相关的SERS指标。与此前报道的基于SERS的光纤、创面敷料以及主要用于单一位点或单一功能生化检测的SERS活性微针相比，本平台实现了两项进展：第一，将对氧化能力（OC）和氧化还原电位（RP）响应的探针分别集成于单根针灸针上的两个独立刻蚀沟槽中，从而实现对互补性氧化还原参数的同步监测；第二，针灸针不仅作为SERS探针的载体，同时兼具治疗功能，使得氧化还原状态的监测可在针灸干预过程中进行，而非仅在治疗后实施。如图所示 图1微针插入组织后，会产生微小伤口，两个凹槽中的探针与组织发生反应，从而能够检测OC和RP的水平 体内 本研究旨在利用这些具有表面增强拉曼散射活性的微针，检测糖耐量受损大鼠氧化型细胞色素c（OC）和还原型吡啶核苷酸（RP）的变化，并评估针刺干预在相应穴位对这些动物的影响，从而深入理解针刺治疗糖耐量受损的作用机制以及氧化还原状态与异常高血糖状态之间的关系。

方案

糖耐量受损的动物与模型

所有动物实验均经东南大学苏州研究院动物伦理委员会批准（批准号：SEU-IACUC-20250318007），并依照实验室动物护理与使用机构指南执行。大鼠在25 °C的特定病原体阴性（SPF）环境中饲养，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。对于需要麻醉的操作，使用异氟烷通过诱导室在氧气中进行麻醉诱导，并通过鼻罩维持麻醉。异氟烷诱导浓度为3%，维持浓度为1%，根据呼吸频率和操作反应调整浓度。

在针刺或注射前，通过观察翻正反射消失以及对足趾夹捏无反应来确认麻醉深度是否充分。麻醉期间监测动物的呼吸模式、体位及恢复情况，并将动物置于加热垫上以维持体温。每笼饲养2只动物，自由进食和饮水，除非进行葡萄糖检测时需要禁食。动物到达后，适应环境1周后再进行模型制备。每日监测动物福利状况，包括一般活动情况、理毛行为、摄食量、体重、注射部位状况以及麻醉后的恢复情况。研究结束时，根据批准的动物实验方案对大鼠实施安乐死。安乐死采用逐步充入CO₂吸入法，随后通过颈椎脱位法确认死亡。若动物达到人道终点标准，包括严重体重下降、持续不动、呼吸异常、无法进食或饮水，或出现严重痛苦表现，则立即实施安乐死，而不继续维持至预定实验终点。本研究使用雄性SPF级Sprague–Dawley大鼠，体重为200 ± 20 g。经过1周的适应期后，将大鼠随机分为两组：正常组3只，饲喂普通饲料；模型组20只，饲喂高脂饲料（50%基础饲料 + 10%猪油 + 25%蔗糖 + 15%蛋黄粉），持续3周。模型组动物在禁食12小时（不禁水）后，接受腹腔注射2% STZ溶液（溶于0.1 mol/L、pH 4.4的柠檬酸盐缓冲液），剂量为20 mg/kg，注射前禁食12小时。正常组动物在正常进食后，接受相应体积的柠檬酸盐缓冲液腹腔注射。1周后进行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）。本研究使用的试剂和设备列于材料表中。

禁食12小时（不禁水）后，通过采集各组大鼠尾尖血样测定空腹血糖（FPG）；腹腔注射20%葡萄糖（2 g/kg）后2小时记录餐后2小时血糖（2hPG）。正常组FPG范围为5.1–6.6 mmol/L，2hPG范围为7.3–9.4 mmol/L；模型组FPG ≤7.0 mmol/L，2hPG范围为10–16 mmol/L。在20只被分配用于糖耐量受损（IGT）模型构建的大鼠中，经腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）后，有18只符合预设的IGT标准，被纳入后续干预实验；2只大鼠因FPG或2hPG数值超出预设IGT范围而被剔除。18只符合标准的大鼠被随机分为高脂饮食组和正常饮食组，每组9只。每种饮食组进一步分为三个亚组：穴位捻转、非穴位捻转和穴位直刺，每个亚组3只大鼠。本研究为探索性方法开发研究，旨在评估在前临床IGT大鼠模型中结合针灸干预与基于表面增强拉曼散射（SERS）的比率追踪技术的可行性。未进行正式的统计功效计算。每个亚组3只大鼠的样本量基于可行性、前期SERS微针研究以及动物使用减量原则确定。大鼠由实验人员进行随机分配，未实施正式的分组隐藏和盲法处理。

参考循证中医临床实践指南及动物实验的可行性，筛选出针灸治疗方案²²。所选穴位包括中脘（RN12/CV12）、水分（RN9/CV9）、阴交（RN7/CV7）、 bilateral 天枢（ST25）、bilateral 水道（ST28）和 bilateral 足三里（ST36）。RN12、RN9 和 RN7 位于前正中线上，作为单一中线穴位处理，而 ST25、ST28 和 ST36 则双侧取穴。所选穴位配对方案基于临床治疗糖耐量异常（IGT）所用的配穴方法²³。动物模型的穴位定位方法依据文献^24,25，采用二分法进行适应性调整。对于大鼠，穴位根据解剖标志并参照标准人体穴位位置按比例换算确定。腹部任脉（RN/CV）穴位以前正中线为基准，利用剑突、脐部和耻骨联合作为解剖标志进行定位。ST25 在脐部水平双侧标记，ST28 在下腹部区域双侧标记，距前正中线的横向距离与 ST25 相同。ST36 定位于后肢前外侧胫前肌区域，位于胫骨结节外侧。对照非穴位点设于相应穴位旁开 5 mm 处，位于公认经络线之外，并避开可见血管、瘢痕及既往穿刺部位。进针前，根据批准的动物实验方案，使用异氟烷对大鼠实施麻醉，并将其仰卧固定于加热垫上。各目标部位的腹部及后肢皮肤均剃毛并用 75% 乙醇消毒。将具有表面增强拉曼散射（SERS）活性的微针大致垂直插入皮肤，深度约为 10 mm。对于针刺穴位捻转组，将 SERS 活性微针插入选定穴位，并在留针 20 分钟期间轻柔地双向捻转。对于非穴位对照组，在旁开 5 mm 的非穴位对照点执行相同操作。对于直接插入组，将 SERS 活性微针插入穴位后留针 20 分钟，不进行捻转。所有针刺操作均由同一位经过培训的操作者完成，以尽量减少操作者间差异。

每天进行两次针刺，时间分别为10:00和15:00，连续7天。每次每日操作前，禁食8小时（不禁水）后测量空腹血糖（FPG）。每次针刺操作后，记录口服葡萄糖耐量（OC）和胰岛素反应（RP）情况。第7天针灸治疗结束后，进行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT），并记录2小时血糖（2hPG）值。

注意事项

链脲佐菌素具有危害性，应作为有毒化学品进行操作。配制链脲佐菌素溶液时，必须在化学通风橱或经认证的生物安全柜内进行，并穿戴实验服、腈类手套、护目镜和口罩。受链脲佐菌素污染的注射器、针头、擦拭物、垫料、笼具及与动物相关的废弃物，应按照机构规定的危险生物与化学废弃物处理程序进行处置。使用过的针头和注射器应立即丢弃至防刺穿的锐器容器中，禁止重新盖帽。

用于检测辛酰氯和利培酮的表面增强拉曼散射活性微针的制备

针灸针的制备方法如先前报道所述²⁶。在整个研究过程中，表面增强拉曼散射（SERS）活性微针均采用同一种市售不锈钢针灸针（0.25 mm × 26 mm）制备。将针以近似垂直于皮肤的方向刺入，深度约为10 mm。对于捻转组，在留针期间由同一名经过培训的操作人员轻柔且持续地进行20分钟的手动双向捻转。该操作未通过仪器控制，因此未对捻转频率和幅度进行精确量化。此局限性已在讨论部分予以说明。

首先，将针头浸入含20%（w/v）PMMA的MMA溶液中，随后在室温（25 °C）下干燥1天。接着，使用经乙醇清洁的小型美工刀片，在PMMA保护层上制作两个平行的、尺寸均匀且形状和深度相似的压痕（间距为5 mm）；然后将针头浸入0.5 M硫酸溶液（作为电解液）中10秒，在12 V电压下进行电化学蚀刻，从而在刻痕位置形成两个近似圆形的凹槽。第三步，经三次冲洗后，将针头在室温下浸入含有0.1 mol L⁻¹ MPTES和0.3 mol L⁻¹ APTES的乙醇溶液中24小时，从而使凹槽表面具备巯基功能。第四步，通过将针头浸入MMA中去除涂层。氧化还原电位响应型SERS活性微针根据先前报道的方法²⁷制备。将SERS基底吸附至每根针灸针的一个蚀刻凹槽上，随后将所得的SERS活性微针浸入浓度为1 × 10^-4 mol/L的对苯二胺（p-PDA）水溶液中，在37 °C下反应60分钟，得到氧化响应型SERS活性微针。基于金纳米壳的SERS基底按先前所述方法合成²⁸。在本研究中，将该微针滴加至每根针灸针的另一凹槽中，随后自然干燥。最终获得具有氧化胆固醇（OC）和氧化还原电位（RP）响应特性的SERS活性微针。

离体评估 OC 和 RP 对 SERS 活性微针的响应

通过将具有表面增强拉曼散射活性的微针插入 离体 组织。为了验证OC探针对氧化变化的响应性，记录了p-PDA在氧化前后的表面增强拉曼散射（SERS）光谱。还在强还原性NaBH₄环境中采集了氧化还原SERS探针的光谱。₄ 溶液和强氧化性的 HAuCl₄ 溶液。使用还原剂（包括1 × 10⁻⁶ M 的半胱氨酸、谷胱甘肽和抗坏血酸）评估了OC探针的选择性。^-4 M FeSO₄, 1 × 10^-4 M Na₂SO₄，以及 1 × 10^-4 M 抗坏血酸，以及包括 1 × 10^-4 M CuSO₄₄, 1 × 10^-4 M H₂O₂, 1 × 10^-4 M FeCl₃，以及 1 × 10^-4 M HAuCl₄所有溶液均用20 mM PBS（pH 7.4）配制，探针在37 °C下与各溶液孵育20分钟。通过记录SERS活性微针在与1 × 10^-4 mol/L FeCl₃ 在室温下。这些 离体 并且采用基于溶液的检测方法在受控条件下验证了探针的响应性。然而，这些方法无法完全重现复杂的真实环境 体内 组织微环境，其中局部的pH变化、蛋白质吸附、细胞外基质成分及其他生物物质可能影响SERS信号。因此， 体内 OC 和 RP 读数被解释为与氧化还原相关的相对 SERS 指数，而非与基质无关的生化测量值。

在针灸穴位和非针灸穴位处检测OC和RP

为了评估OC和RP探针在穴位和非穴位处的性能，将具有表面增强拉曼散射活性的微针插入健康大鼠的ST36和RN12穴位，以及这两个穴位旁侧5 mm处，插入深度约为10 mm，留置时间相同。

捻针对OC和RP检测的影响

为了评估OC和RP探针在不同针刺手法下的响应性，将具有SERS活性的微针插入健康大鼠的ST36和RN12穴位以及这些穴位旁5 mm处，插入深度约为10 mm。在每个穴位处，一根针进行捻转操作，而相应位于穴位旁的针则不进行捻转；反之亦然（即对穴位旁的针进行捻转，而对应位于穴位上的针则不捻转）。在每根针插入相同时间后，采集探针的SERS信号。

糖耐量受损大鼠在不同 acupuncture 点、针刺捻转及饮食条件下 OC 和 RP 的变化

为评估针刺穴位、捻针操作及饮食条件对糖耐量受损（IGT）大鼠口服葡萄糖耐量（OC）和呼吸商（RP）的影响，将高脂饮食组大鼠随机分为三组（A1、A2 和 A3，每组三只），正常饮食组大鼠也随机分为三组（B1、B2 和 B3，每组三只）。对 A1 和 B1 组大鼠，在麻醉后将表面增强拉曼散射（SERS）活性微针插入穴位并捻针 20 分钟；A2 和 B2 组大鼠进行相同操作，但微针插入位置位于穴位旁开 5 mm 处。A3 和 B3 组大鼠将 SERS 活性微针插入穴位但不进行捻针，留针 20 分钟。每日施针两次，分别在 10:00 和 15:00，持续 7 天。每次操作前，使用血糖仪记录各组大鼠空腹 8 小时（不禁水）后的空腹血糖（FPG）值。每次针刺后，测量并记录 OC 和 RP 反应。第 7 天针刺结束后，对各组大鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT），并记录 2 小时血糖（2hPG）值。

表征与测量

采用扫描电子显微镜（SEM）观察具有表面增强拉曼散射（SERS）活性的微针形态。拉曼光谱在25 °C下采集，使用配置有50×长工作距离物镜（NA：0.5）和785 nm激光器的拉曼光谱仪。所有测量的采集时间均为10 s，在相同的光学配置下，拉曼系统以标称激光功率600 µW运行。本研究未直接测量照射在组织表面的实际激光功率。因此，SERS光谱仅用于在相同采集条件下各组之间的相对比较，未对组织绝对光热安全性得出结论。两种SERS探针的强度比值按以下方法计算：在1450 cm⁻¹处与1500 cm⁻¹处的强度比值被指定为骨钙素（OC）的指标（I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹），分别从两个峰中减去1700 cm⁻¹处的强度（作为背景），方法如先前报道¹⁷；以I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹作为类风湿性关节炎相关蛋白（RP）的指标时，同样分别从两个峰中减去1700 cm⁻¹处的强度（作为背景）。计算得到的I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹和I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹值被分别分析为SERS衍生的OC和RP相关反应的相对指数。这些比值用于在相同采集条件下比较不同组别及不同时间点之间的变化。

本研究未建立外部校准曲线，以将这些比值转换为氧化物质的绝对浓度或绝对电化学氧化还原电位值。每个光谱在三个重复样本上，于SERS探针的五个不同位置各记录两次。使用Origin软件处理数据并生成图表。为尽量减少采集过程带来的变异性，所有组别均采用相同的激光波长、物镜、采集时间、激光功率设置以及光谱处理流程。激光辐照可能引起的光热或光化学效应未被独立量化，此局限性已被承认。统计结果以均值±均值标准误（SEM）表示。每个实验或图例中所用的样本量及统计学检验方法均在相应的图注中说明。对于离体（ex vivo）探针验证实验，以SERS探针或独立制备的微针作为分析单元。对于活体（in vivo）血糖及SERS指数分析，以大鼠作为生物学分析单元。来自同一探针多个位点采集的光谱被视为技术重复测量，在进行组间水平分析前进行平均处理。统计分析采用SPSS软件进行。组间比较使用相应图注中注明的统计学方法。由于亚组样本量较小，为期7天干预期间连续进行的空腹血糖和SERS指数测量被视为探索性纵向趋势，未采用正式的重复测量或混合效应模型。统计学显著性定义为 p < 0.05。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

结果

用于检测奥司他韦和利巴韦林的表面增强拉曼散射活性微针的制备

为检测OC和RP的变化，制备了含有相应探针的SERS活性微针。代表性SEM图像证实了SERS活性微针的双沟槽结构。 图2A 显示带有两个刻蚀凹槽的针体， 图2B 显示一条载有GNS的凹槽，以及 图2C 显示了沟槽内分布的GNS的放大视图。这些图像证实，刻蚀的沟槽可作为对OC和RP响应的SERS探针的局部负载位点。峰强度比I₁₄₅₀ 厘米⁻¹/I₁₅₀₀ 厘米⁻¹ 用于表示 p-PDA 被氧化的程度。 图3A 显示 p-PDA 在与 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃而 图3B 呈现了1 × 10⁻³ M 红ox探针在1 × 10⁻³ M NaBH4 和 1 × 10^-4 M HAuCl₄ 水溶液。RP探针的响应以峰强度比（I₁₆₀₆ 厘米^-1/I₁₆₆₆ 厘米^-1），随着RP的增加而减少。

为评估氧化能力响应探针的选择性，测量了探针暴露于不同还原剂和氧化剂后 I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ 的比值。每组独立进行 n = 3 的探针测量，以 SERS 探针或独立制备的微针作为分析单元（图 3C）。与对照组（CK 组）相比（经 Kruskal–Wallis 检验后进行 Dunn 多重比较检验），还原剂 FeSO₄ 和 Na₂SO₄ 对 I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ 比值无显著影响（p > 0.05）。抗坏血酸（AA，p < 0.001）在本实验条件下也导致比值升高，尽管其被归类为还原剂。因此，AA 的响应被谨慎地解释为该溶液体系中探针特有的光谱响应，而非其具有氧化行为的证据。相反，氧化剂或与氧化相关的试剂则不同程度地提高了该比值。暴露于 CuSO₄（p < 0.0001）、H₂O₂（p < 0.0001）、FeCl₃（p < 0.0001）和 HAuCl₄（p < 0.0001）后，比值均显著升高。为评估 OC 探针在室温下的稳定性，在探针与 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃ 反应前，每隔 1 小时采集一次 SERS 谱图（图 3D），并计算相应的 I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ 比值。探针吸附后，初始值在 6 小时内保持稳定，约为 0.20 ± 0.02；与 FeCl₃ 反应后的比值也保持稳定，约为 0.9 ± 0.10。这些结果表明，GNS 上的对苯二胺（p-PDA）在空气中具有良好的稳定性。

针刺点与非针刺点的OC和RP反应

先前的研究²⁹ 已表明，OC探针在插入后10分钟达到最大响应。 图4A和B 说明SERS活性微针在健康大鼠ST36和RN12穴位以及穴位旁5 mm位置放置10分钟后的响应情况。每组实验使用3只大鼠（n = 3），同一探针多个位点采集的光谱作为技术重复进行平均处理，再进行组间分析。SERS活性微针对OC和RP的变化表现出有效的响应 体内，针刺穴位组与非穴位组在OC和RP方面无显著差异（独立样本t检验， p > 0.05).

为进一步确定针刺捻转对局部OC和RP的影响 体内，将具有SERS活性的微针插入健康大鼠的ST36和RN12穴位，以及穴位下方5 mm处，深度均为10 mm。在对每个穴位进行捻转操作时，相邻的微针保持不捻转，反之亦然，并记录穿刺点处OC和RP值的变化（图4C–F）。无论是在健康大鼠的针刺穴位还是非穴位处进行捻转操作，OC和RP均未出现显著变化，且在邻近穴位处进行捻转也未产生任何影响。p > 0.05).

伴有针刺、捻针及饮食条件的糖耐量受损大鼠中骨钙素和抵抗素水平的变化

为确认糖耐量受损（IGT）大鼠模型的成功建立，分别采用腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）检测模型组和对照组大鼠的空腹血糖（FPG）和餐后2小时血糖（2hPG）值。对照组包括 n = 3 只大鼠，模型组包括 n = 18 只符合预设糖耐量受损标准的大鼠。模型组大鼠的空腹血糖高于对照组大鼠（6.92 mmol/L 对比 5.54 mmol/L；Mann–Whitney U 检验，p < 0.01），餐后2小时血糖也高于对照组大鼠（11.52 mmol/L 对比 7.92 mmol/L；Mann–Whitney U 检验，p < 0.001）（图5），表明模型动物的IGT状态已成功诱导。

为了验证针灸穴位组合、捻针手法及饮食条件对糖耐量异常（IGT）大鼠的影响，选择了一组典型的针灸穴位配对。将18只符合条件的模型大鼠分为高脂饮食组和正常饮食组，每组各含9只大鼠。每种饮食组进一步分为三个干预亚组：穴位捻针组、非穴位捻针组和穴位直刺组，每亚组各含3只大鼠。在每天针刺前记录空腹血糖（FPG）值（图6A–C），并在连续针刺7天后通过腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）测定各组的餐后2小时血糖（2hPG）值（图6D）。在此探索性数据集中，针刺穴位后，高脂饮食组与正常饮食组之间的FPG或2hPG值未观察到明显差异。穴位针刺与非穴位针刺的比较结果提示，在当前实验条件下，穴位捻针与较低的血糖值相关（独立样本t检验，p < 0.05）。由于亚组样本量较小，且饮食、穴位位置和捻针操作在统计学上无法完全分离，这些结果被解释为初步的动物模型观察结果。

在糖耐量受损（IGT）大鼠接受为期1周的针灸干预期间，监测了与氧化能力相关及与氧化还原电位相关的表面增强拉曼散射（SERS）指标的变化。在这些分析中，每个亚组纳入3只大鼠，每只大鼠作为生物学分析单位。在高脂饮食大鼠中，针刺点捻转组和针刺点直刺组的氧化能力相关SERS指标随时间逐渐降低，而非穴位捻转组则保持相对较高水平（图7A）。在针刺点捻转组和针刺点直刺组中，氧化还原电位相关SERS指标随时间逐渐升高，而非穴位捻转组的升高幅度相对较弱（图7B）。在正常饮食的IGT大鼠中也观察到类似趋势：针刺点捻转组和针刺点直刺组的氧化能力相关SERS指标随时间下降，而非穴位捻转组的变化较小（图7C）；氧化还原电位相关SERS指标在针刺点捻转组和针刺点直刺组中随时间升高，而非穴位捻转组则保持相对较低水平（图7D）。

为了在相同的针刺操作条件下进一步比较不同饮食状态的影响，对高脂饮食组和正常饮食组中的针刺穴位捻转亚组进行了比较。在此比较中，两种饮食条件下的氧化能力相关SERS指数均随时间下降，且到第7天时，正常饮食针刺穴位捻转亚组的下降幅度更大（图7E）。两种饮食条件下，与氧化还原电位相关的SERS指数均随时间上升，且在第7天时，正常饮食针刺穴位捻转亚组的数值更高（图7F）。这些结果提示，在糖耐量受损大鼠中，针刺穴位捻转结合饮食正常化与局部氧化还原相关SERS指数的变化有关。由于每个亚组仅包含三只大鼠，且未进行独立的生化氧化应激检测，因此这些结果应被视为探索性的动物模型观察结果，而非氧化应激改善的确凿生化证据。

数据可用性：

用于生成图表和进行统计分析的所有数值原始数据，包括血糖测量值、SERS衍生的比值以及定量图表面板的源数据，均已整理并作为补充表1上传。对于由分析仪器直接生成的连续探针监测实验数据，导出的数值以及用于评估探针性能的代表性仪器输出结果包含在补充文件1中。

图1：利用双沟槽SERS活性微针进行针灸干预及局部比率型SERS检测的方法学流程图。 示意图展示了将双沟槽SERS活性微针插入针灸穴位或邻近非穴位区域，随后采集拉曼光谱的过程。作者使用WPS软件绘制该图，无需版权许可。缩写：SERS = 表面增强拉曼散射。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：SERS活性微针的代表性扫描电镜图像。（A）具有两个凹槽的针灸针体；比例尺 = 200 µm；放大倍数 = 77×。（B）集成金纳米壳（GNS）的凹槽；比例尺 = 20 µm；放大倍数 = 1,000×。（C）B图中凹槽的放大图像；比例尺 = 2 µm；放大倍数 = 30,000×。缩写：SEM = 扫描电子显微镜（scanning electron microscopy）；GNS = 金纳米壳（gold nanoshells）。请点击此处查看该图的高清版本。

图 3： OC 响应性和 RP 响应性 SERS 探针的表征。 （A）p-PDA 与 FeCl₃ 相互作用前后的归一化光谱。（B）RP 探针在 NaBH₄ 和 HAuCl₄ 溶液中的归一化 SERS 光谱。（C）OC 探针在不同氧化和还原溶液中的 I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ 比值。每组 n=3 次独立探针测量。采用 Kruskal–Wallis 检验，随后进行 Dunn 多重比较检验，与 CK 组对比。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。（D）OC 响应性探针在与 FeCl₃ 反应前后六小时的稳定性评估。缩写：SERS = 表面增强拉曼散射；CK = 对照检测；p-PDA = 对苯二胺；AA = 抗坏血酸。***p < 0.001，****p < 0.0001。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：在健康大鼠的穴位与非穴位部位，采用不同针刺方法测得的与OC和RP相关的表面增强拉曼散射（SERS）指数。（A）在穴位及邻近非穴位部位直接进针后测得的OC相关SERS指数。（B）在穴位及邻近非穴位部位直接进针后测得的RP相关SERS指数。（C）在非穴位部位直接进针、在穴位部位进行捻针后测得的OC相关SERS指数。（D）在非穴位部位直接进针、在穴位部位进行捻针后测得的RP相关SERS指数。（E）在穴位部位直接进针、在邻近非穴位部位进行捻针后测得的OC相关SERS指数。（F）在穴位部位直接进针、在邻近非穴位部位进行捻针后测得的RP相关SERS指数。OC的计算公式为I_{1450 cm}^-1/I_{1500 cm}^-1，RP的计算公式为I_{1606 cm}^-1/I_{1666 cm}^-1。每组n=3。数据以均值±标准误表示。成对比较之间未观察到显著差异。缩写：OC = 氧化能力；RP = 氧化还原电位。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：模型组与对照组（CK）大鼠IPGTT实验中的空腹血糖（FPG）和餐后2小时血糖（2hPG）数值。 检测FPG和2hPG以验证糖耐量受损大鼠模型的建立。对照组n = 3只大鼠，模型组n = 18只大鼠。采用Mann–Whitney U检验进行统计分析，结果以均值 ± 标准误（SEM）表示。**p < 0.01，***p < 0.001。 请点击此处查看该图的高清版本。

图6：IGT大鼠在针灸干预期间的空腹血糖（FPG）和餐后2小时血糖（2hPG）数值。（A）接受在穴位处进行捻针及直接进针治疗组的FPG值（每组n = 3）。（B）接受在穴位与非穴位处捻针治疗组的FPG值（每组n = 3）。（C）高脂饮食组与正常饮食组的FPG值（每组n = 3）。（D）高脂饮食与正常饮食大鼠在穴位捻针、非穴位捻针及穴位直接进针条件下的第7天2hPG值（每组n = 3）。结果以均值 ± 标准误（SEM）表示。图D中预设的成对终点比较采用非配对双尾Student’s t检验进行分析。*p < 0.05。请点击此处查看该图的高清版本。

图7：各组大鼠在为期1周针灸治疗期间OC和RP的变化。（A）高脂饮食IGT大鼠OC的变化。（B）高脂饮食IGT大鼠RP的变化。（C）正常饮食IGT大鼠OC的变化。（D）正常饮食IGT大鼠RP的变化。（E）针刺穴位捻转亚组中，高脂饮食与正常饮食条件下OC相关SERS指数的比较；（F）针刺穴位捻转亚组中，高脂饮食与正常饮食条件下RP相关SERS指数的比较。每亚组n = 3只大鼠。数据以均值±标准误表示。连续测量结果被解释为探索性纵向趋势。缩写：OC = 氧化能力；RP = 氧化还原电位。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1：探针响应评估的代表性仪器生成结果。 该文件包含由分析仪器直接生成的代表性连续监测结果，用于评估探针响应性能。请点击此处下载该文件。

补充表1：定量分析的原始数据表。 该文件包含用于图表生成和统计分析的数值源数据，包括血糖测量值、SERS衍生的比值以及定量图表面板数据。请点击此处下载该文件。

讨论

糖耐量受损是2型糖尿病发生前的一个可逆过渡阶段，与代谢失衡、胰岛素抵抗以及氧化应激相关调控紊乱密切相关。生活方式干预及其他早期治疗策略可降低糖耐量受损向糖尿病进展的风险，但目前仍缺乏用于动态监测干预过程中局部生化反应的工具³⁰。已有实验和临床研究报道，针灸可影响葡萄糖代谢及与氧化应激相关的通路。然而，大多数针灸机制研究依赖于终点时的血液或组织检测，能够实现微创、实时追踪针灸干预期间局部氧化还原相关反应的方法仍较少。既往针对糖耐量受损（IGT）治疗的临床试验已证实，通过生活方式干预（包括饮食调整、体重减轻和增加体力活动）可显著降低糖尿病的发生风险³¹。研究表明，针灸在改善葡萄糖代谢指标、降低空腹血糖和餐后2小时血糖（2hPG）方面具有疗效。因此，阐明针灸、氧化还原状态与糖耐量受损之间的关系，可能为逆转糖耐量受损或阻断其进展提供新途径，从而降低糖尿病的发病率，并有助于深入理解糖耐量受损的病理机制及其发展过程中的潜在机制。

本研究提出了一种双沟槽、氧化还原敏感的表面增强拉曼散射（SERS）活性微针平台，用于在糖耐量受损大鼠模型中将针灸干预与局部比率型SERS检测相结合。该系统利用单根针灸针上刻蚀的两个沟槽，分别负载响应氧化能力与响应氧化还原电位的探针。该设计使针灸针不仅可作为干预工具，还可作为相对局部氧化还原相关光学信号的传感载体。结果显示，在糖耐量受损大鼠中，于穴位进行捻转针刺与较低的空腹血糖（FPG）和2小时血糖（2hPG）水平相关，并伴随氧化能力相关和氧化还原电位相关的SERS指标的变化。这些发现支持了使用SERS活性微针探索针灸干预过程中局部氧化还原相关反应的可行性。总体而言，结果表明，在穴位进行捻转针刺与IGT大鼠较低的FPG和2hPG值以及氧化能力（OC）和氧化还原电位（RP）相关SERS指标的变化相关。这些发现证实了利用SERS活性微针追踪针灸干预期间局部氧化还原相关光学反应的可行性。然而，由于未进行标准的生化氧化应激检测、探针渗漏分析以及组织生物相容性测试，所观察到的SERS指标变化不应被解释为氧化应激改善的确凿生化证据。

可采用多种替代方法进一步探究同一假设。标准的生化氧化应激检测方法，包括活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值的测定，可用于验证基于表面增强拉曼散射（SERS）的指标变化是否与传统的氧化应激生物标志物相对应^32,33。电化学氧化还原探针、基于荧光的氧化还原传感器、化学发光检测、微透析联合生化分析，以及组织免疫组织化学或组织学验证，也可能提供补充信息。将SERS活性微针传感技术与这些独立方法相结合，有助于判断所观察到的光学变化是反映了特定的生化氧化还原改变，还是更广泛的局部组织对穿刺及代谢状态的响应³⁴。

该方法的潜在应用不仅限于当前的糖耐量受损模型。由于氧化还原失衡参与了代谢性疾病、组织损伤、炎症及伤口修复等过程，表面增强拉曼散射（SERS）活性微针可能成为一种有用的临床前工具，用于监测糖尿病相关模型、伤口愈合研究、炎症性疾病模型以及其他微创干预场景中的局部氧化还原相关反应³⁵。在针灸研究中，该平台可能有助于比较不同穴位、非穴位部位、不同的针刺手法以及不同的干预时间方案。然而，这些应用仍处于探索阶段，需要进一步的技术和生物学验证。

应当指出若干局限性。首先，氧化还原电位（OC）和还原潜能（RP）读数是作为基于表面增强拉曼散射（SERS）的比率指数计算得出的，未针对氧化物质的标准浓度或绝对电化学氧化还原电位值进行校准。因此，当前结果应被理解为在相同采集条件下相对的、与氧化还原相关的光学响应，而非绝对的生化测量值。其次，生物组织微环境可能引入额外的信号变异来源，包括局部pH变化、蛋白质吸附、细胞外基质成分及其他基质效应。这些因素在含血清或模拟组织的介质中尚未得到充分评估。第三，未直接测量到达组织表面的实际激光功率以及拉曼信号采集过程中的局部温度变化；因此，潜在的光热或光化学效应尚不能完全排除。第四，未通过多针扫描电子显微镜（SEM）成像或负载效率分析对沟槽几何结构及探针负载的批次间可重复性进行定量评估。最后，未开展独立的生化验证、探针溶出分析以及局部生物相容性测试。未来的研究应建立在生物学相关基质中的校准曲线，将SERS指数与标准的氧化应激和氧化还原检测方法进行关联，量化探针溶出情况，评估反复插入后的局部组织相容性，并在更大规模的动物群体中验证该装置。具有SERS活性的微针可能为在临床前糖耐量受损（IGT）大鼠模型中结合针灸干预与局部氧化还原相关指数的相对比率SERS追踪提供一个有用的平台。但在声称实现绝对定量监测或转化应用之前，仍需进一步开展校准、生化验证、探针溶出评估及生物相容性研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，98%）	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷（MPTES，95%）	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
抗坏血酸	国药集团化学试剂有限公司	CFAD310554
血糖仪	科福医疗科技有限公司	Cofoe A03
血糖试纸	科福医疗科技有限公司	Cofoe-A03-C
硫酸铜（CuSO4）	国药集团化学试剂有限公司	PHR1477
乙醇（≥99.7%）	国药集团化学试剂有限公司	XW00641752
硫酸亚铁（FeSO4）	国药集团化学试剂有限公司	XW01772078701
葡萄糖（Glu）	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
过氧化氢（H2O2）	国药集团化学试剂有限公司	P-17-0500
三氯化铁（FeCl3）	国药集团化学试剂有限公司	CP81015228
甲基丙烯酸甲酯（MMA）	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	M109626
显微拉曼光谱仪	Renishaw	InVia Raman Microscope
对苯二胺（p-PDA）	上海TCI化学工业发展有限公司	P128784
聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
扫描电子显微镜	Zeiss	ULTRA Plus
硼氢化钠（NaBH4）	上海阿达玛斯-beta试剂有限公司	S432207
亚硫酸钠（Na2SO4）	国药集团化学试剂有限公司	S572396
不锈钢针灸针	苏州天协针灸器械有限公司	X-20-03
统计分析软件	国际商业机器公司	Version 2021
链脲佐菌素（STZ）	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	S408311
四氯金酸（HAuCl4）	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
SPSS软件	国际商业机器公司，美国纽约州阿蒙克	version 26.0
大鼠	江苏青龙山生物技术有限公司	无特定病原体级雄性Sprague-Dawley
基础饲料	安诺康生物	SY10001
猪油	MCE	HY-W127601
蔗糖	MCE	HY-B1779
蛋黄粉	MCE	HY-B2235B
一水柠檬酸	Sigma-Aldrich	C1909
二水合柠檬酸三钠	Sigma-Aldrich	S4641
柠檬酸盐缓冲液	beyotime	P0086
磷酸盐缓冲液	beyotime	ST448-1L
异氟烷	Bioss	D54468
小动物异氟烷麻醉系统	RWD生命科学	R500
诱导室和鼻罩	RWD生命科学	R500兼容配件
加热垫	上海玉研生命科学	Y69020
75%乙醇	博宇生物	YB60401
CO2安乐死舱	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	北京金山办公软件股份有限公司	WPS365