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一种简化创伤性出血性凝血病、炎症及生存率定量评估的小鼠肝裂伤模型

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DOI：

10.3791/72215

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2026年9月25日

 ,  ,  , 
1Division of Hematology and Cellular Therapy, Department of Medicine, University of California San Diego

本文内容

摘要

我们提出一种可重复的小鼠肝脏裂伤大出血模型，该模型整合了失血、创伤诱发的凝血功能障碍以及生存结局。该模型可用于评估止血干预措施（包括重组Ⅶa因子和氨甲环酸）的效果，同时进行凝血功能、纤溶状态及死亡率的评价，为机制性和转化性出血研究提供一种经济高效、可扩展的实验平台。

摘要

无法控制的出血仍是创伤患者可预防性死亡的主要原因，而创伤诱发的凝血功能障碍（TIC）是早期死亡率的重要决定因素。能够可靠地重现出血及其相关凝血功能障碍反应的实验模型，对于机制研究和靶向干预措施的评估至关重要。本文介绍了一种标准化的小鼠重度出血模型，通过可重复的肝裂伤（LL）引发出血，该模型可精确量化出血量，同时可同步监测全身性凝血功能障碍、炎症标志物及死亡率。

小鼠接受标准化的正中腹切开术，随后进行肝脏裂伤（LL），并通过测量被血液浸透的纱布来量化失血量。在手术前以及术后预设的连续时间点，通过眼球后采血收集凝血、纤溶和炎症标志物的全身性指标。伴有失血的肝脏裂伤可稳定地诱导创伤性凝血病（TIC），其特征为活化部分凝血活酶时间（aPTT）延长、凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物水平升高、凝血因子（F）V 和 VIII 的选择性耗竭以及纤溶系统的激活。同时，白细胞介素-6（IL-6）水平升高表明存在炎症反应的激活。此外，该模型还支持在正中切口修复后进行生存分析。

作为一种转化应用，重组活化因子VII（rhFVIIa）和氨甲环酸（TXA）被用于证明该模型对通过药物调节凝血和纤溶参数实现止血具有敏感性。与大型动物模型相比，这种小鼠系统为研究创伤性出血的创新性、靶向性干预措施提供了经济、多功能且易于扩增的实验平台。

引言

创伤是青壮年（年龄 < 45 岁）死亡和残疾的主要原因1,2，其中无法控制的出血是早期死亡的重要原因3。严重创伤患者预后不良的关键因素之一是创伤诱发性凝血病（TIC）的发生4,5。TIC 是一种复杂的、多因素参与的止血功能紊乱，其特征包括凝血因子 V 和 VIII 的耗竭6,7、纤溶系统的失调7,8,9以及全身性炎症激活10。TIC 会导致持续出血，并与输血需求增加11、器官功能衰竭5以及死亡率升高相关，即使在损伤控制性复苏和治疗干预手段不断进步的背景下依然如此5。

因此，能够可靠地再现伴有凝血功能障碍改变的失血性休克的实验模型，对于机制研究和靶向止血干预措施的评估至关重要。控制性失血模型采用标准化的放血方法，可能不会造成组织损伤，而组织损伤是临床创伤中观察到的全身性凝血功能障碍反应的重要诱因12。因此，若能对持续性出血和全身反应进行定量评估，则包含实质性器官损伤的失血模型应具有更高的临床相关性13,14,15,16。更为复杂的创伤性凝血病（TIC）模型结合了创伤性脑损伤、长骨或肢体骨折、软组织损伤、剖腹手术以及控制性失血性休克等多种因素，以模拟严重创伤的多个组成部分17,18。尽管这些方法能更全面地反映多发伤情况，但其多种损伤操作和生理干预可能增加技术复杂性和实验变异性。

尽管经过数十年的研究，目前仍缺乏具有临床相关性和可重复性的创伤性凝血病（TIC）实验模型，且现有模型存在异质性。综述文献强调，亟需建立能够更准确模拟组织损伤与失血性休克临床过程，并支持治疗干预评估的稳健模型17,19。一些复杂的模型需要大量仪器操作，包括心脏插管和持续血流动力学监测，虽可提供详细的生理信息，但也依赖特殊设备并增加操作复杂性。为了降低创伤研究的门槛，在保留TIC关键特征的同时简化实验方法显得尤为关键。本文介绍了一种标准化的小鼠模型，通过可重复的肝脏裂伤（LL）诱导失控性失血性休克14，造成严重出血并再现TIC的关键特征。该模型可用于评估凝血与炎症反应，包括常规凝血指标（如活化部分凝血活酶时间aPTT和凝血酶生成）、作为TIC标志性特征的特定凝血因子（FV和FVIII）的选择性消耗、纤溶活性标志物以及细胞因子谱分析。为验证该模型对人类创伤的敏感性与相关性，我们评估了在创伤复苏中常用的重组活化因子VII（rhFVIIa，促止血剂）和氨甲环酸（TXA，抗纤溶剂）对出血严重程度、凝血功能障碍进展及生存结局的影响。

该模型还可支持连续性和终末性采血，从而能够根据损伤严重程度和治疗干预措施，对凝血和炎症反应的动态变化进行纵向评估。综上所述，该模型提供了一个可重复且可扩展的小鼠系统，可用于在严重出血背景下研究创伤性凝血病（TIC），并利用临床相关终点指标（包括失血量、凝血功能障碍、纤溶活性、炎症反应和生存率）评估止血治疗及靶向药物干预的效果。

与先前发表的小鼠肝脏裂伤模型（包括 Dyer 等人13描述的方案）相比，本方法在实验设计上实现了多项关键技术改进。这些改进包括通过重量法对失血量进行定量测定、通过将裂伤肝脏质量标准化为体重来统一损伤严重程度、以及对创伤性凝血病（TIC）、纤溶和炎症反应进行全面表征。此外，该模型支持多次连续采样、药物干预和生存分析，并详细描述了腹腔关闭技术，从而实现动物的生理恢复而非处死。所有操作均可在单一实验流程中完成，为研究出血及靶向止血干预提供了一个可扩展且具有转化价值的实验平台。

方案

加州大学圣地亚哥分校（UCSD）机构动物护理和使用委员会批准了所有动物实验方案。C57BL/6J小鼠在UCSD内部繁育设施中进行繁育和饲养。实验中使用了8至10周龄的雄性和雌性小鼠。补充图1提供了实验工作流程和时间线的示意图概览。

注意：样本量是根据预实验结果、各检测指标预期的变异性以及既往小鼠肝损伤模型的研究经验确定的。各实验终点和实验分组的最终样本量均在相应图注中提供。对于肝脏重量的测量，将多次独立实验的数据合并分析，以评估不同实验批次间的一致性。对于在不同实验批次中进行的凝血功能检测，每次运行均包含先前已分析的样本，以监测批次间的重复性和一致性。

1. 实验前准备

  1. 基线样本采集（第 -1 天）
    1. 在实验前 24 小时，从小鼠（8–10 周龄）经眶后静脉丛采集约 200 µL 血液，以建立基线参数。
    2. 采血后，皮下注射约 200 µL 无菌注射级生理盐水。
    3. 将小鼠饲养于清洁笼具中，置于标准实验室条件下，环境温度控制在 20–24 °C，相对湿度为 30%–70%，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗，并可自由摄食和饮水，直至实验当天。
  2. 笼具准备（第 0 天）
    1. 在实验当天，将小鼠转移至铺有新鲜纸巾的清洁笼具中。
    2. 实验开始前 15 分钟移除食物和饮水，并在术后吸收海绵移除前持续禁食禁水。

2. 仪器和手术区域准备

  1. 仪器灭菌
    1. 通过高压灭菌对手术器械、棉球、涂药棒和滤纸进行灭菌。
    2. 使用70%乙醇对手术台面进行消毒。
  2. 手术台设置
    1. 将无菌器械放置在无菌布巾上。
    2. 准备一个不锈钢容器，内装70%乙醇和无菌棉球，用于手术过程中器械的临时清洁。
    3. 启动微珠灭菌器，并使其升温至150 °C，用于动物间器械的快速灭菌。

3. 温度维持准备

  1. 恒温垫准备
    1. 根据制造商说明，在手术前立即启动恒温加热垫。
    2. 将恒温加热垫设置为在麻醉和手术期间维持小鼠体温在36–37 °C的目标范围内。
    3. 确认加热垫表面的热量分布均匀。
    4. 将加热垫放置在手术平台上，并覆盖无菌手术单。
    5. 将手术板连接至异氟烷麻醉系统。

4. 麻醉与术前操作

  1. 麻醉诱导
    1. 将小鼠置于诱导室中，使用2%异氟烷（溶于2 L/min氧气）进行麻醉诱导。
    2. 通过脚趾夹捏反射确认麻醉深度是否充分。
    3. 手术前记录小鼠体重。
  2. 镇痛与治疗给药
    1. 皮下注射布托啡诺（3.25 mg/kg）以提供镇痛。
    2. 根据需要准备止血剂。
    3. 对于治疗组，在损伤前5分钟通过眶后静脉注射给予重组人活化因子VII（rhFVIIa；3 mg/kg）或氨甲环酸（10 mg/kg）。
    4. 对照组动物给予等体积（约100 µL）无菌注射用生理盐水。

5. 手术准备

  1. 手术部位准备
    1. 将麻醉后的小鼠转移至位于恒温垫上的手术板。
    2. 在整个手术过程中，通过鼻罩以每分钟2升氧气中含1.5%–2%异氟烷维持麻醉。
    3. 将小鼠仰卧位固定，并用胶带固定四肢。
    4. 剃除腹部区域的毛发。
    5. 使用聚维酮碘和70%乙醇交替进行无菌准备（重复三个循环）。

6. 肝脏裂伤手术操作

  1. 材料预称重
    1. 预先称量两个1.5 mL离心管，其中一个含有0.5 mL生理盐水，另一个为空管。
    2. 为每只动物预先称量三个主吸收三角垫和两个次吸收三角垫，并记录其总质量。
    3. 为每只动物预先称量一个称量舟，用于后续切除肝脏组织的称重。
  2. 诱导肝损伤
    1. 进行长约0.5英寸（12.7 mm）的正中腹切口，以暴露肝脏。
    2. 将两个吸收三角垫分别置于右侧和左侧腹壁，避免与肝脏接触。
    3. 外置左肝叶，识别叶缘以标准化切除组织范围，避免意外组织损伤。
    4. 使用锋利剪刀，以单次可控动作撕裂约75%的肝叶，确保各动物间操作一致。
    5. 将切除的撕裂组织转移至已预称重的空管中，用于后续评估损伤严重程度。
    6. 在腹腔内插入第三个吸收三角垫，以便在出血阶段实现均匀血液收集。
  3. 快速关闭腹腔以维持内出血（关键步骤）
    1. 立即使用两个外科自动夹在约10–15秒内关闭腹壁。
    2. 确保切口边缘精确对齐，实现完全闭合而无间隙；闭合不全可能导致外部血液泄漏，从而低估失血量。
    3. 闭合过程中施加均匀但轻柔的张力，避免压迫腹腔内容物，以防改变出血动力学。
    4. 使用组织粘合剂（2–3滴）加固闭合部位，确保腹腔完全密封。
  4. 损伤后监测
    1. 称量切除的肝组织，并将其数值归一化至体重，以量化并确认肝损伤程度。
    2. 将小鼠放回置于等温垫上的笼子中。
    3. 对于终点和存活队列，允许出血持续60分钟。

7. 血液采集与失血量量化

  1. 血液样本采集与处理
    1. 对于终点队列，在肝脏撕裂后60分钟，使用异氟烷重新麻醉小鼠。
    2. 对于生存队列，在肝脏撕裂后6小时和7天时，使用异氟烷重新麻醉小鼠以采集血液。
    3. 通过眼后静脉窦穿刺采集血液至含有枸橼酸钠溶液的采血管中（血液与抗凝剂比例为9:1），用于血浆制备。
    4. 将样本在2,000 × g 离心10分钟，随后在12,000 × g 离心5分钟，以获得乏血小板血浆，用于后续凝血和纤溶功能检测。
  2. 失血量测定
    1. 在肝脏撕裂后60分钟，对终点队列和生存队列均重新打开腹腔，并取出含有血液的吸收海绵。
    2. 将所有沾血的海绵转移至预先称重并含有无菌生理盐水的试管中。
    3. 使用额外的预先称重的吸收海绵收集腹腔内的残留血液。
    4. 血液采集完成后称量收集管，获得最终管重。
    5. 使用以下重量法公式计算失血量：
      失血量 (µL/g) = [(最终管重 − 初始管重 – 吸收海绵重量) / 小鼠体重] × 1000。
      注：所有重量均以克为单位。乘以1,000是将血液重量（克）换算为微升，假设血液密度约为1 g/mL。
  3. 生存与纵向结局队列
    1. 在肝脏撕裂后60分钟完成失血量测定后，立即使用外科缝钉和组织粘合剂关闭切口，确保腹腔完全封闭。
    2. 在恢复前皮下注射400 µL无菌生理盐水。
    3. 将小鼠放回标准饲养环境，在麻醉恢复期间持续监测，并于术后2小时、6小时和24小时进行评估，之后每日监测至第7天。

8. 术后护理

  1. 术后监测
    1. 在麻醉早期恢复期间持续监测动物，观察是否有痛苦或发病迹象。
    2. 在每次计划的评估时间点记录动物存活状态和临床观察结果。
  2. 支持性护理
    1. 每天皮下注射 400 µL 无菌生理盐水，持续 3 天。
    2. 根据批准的动物护理方案，每 72 小时给予镇痛剂（丁丙诺啡，3.25 mg/kg，皮下注射）。
    3. 将小鼠饲养在标准环境中，自由获取食物和水。
  3. 人道终点
    1. 监测动物是否出现预定义的人道终点指标，包括严重或持续的嗜睡、无法自主活动或获取食物和水、严重呼吸困难、无反应性，或其他经批准的机构动物护理方案中规定的严重痛苦迹象。
    2. 对达到预定义人道终点的动物，依照机构指南实施安乐死。
    3. 持续进行存活监测至第 7 天，或直至达到人道终点。

9. 终点操作步骤与组织采集

  1. 在预设的实验终点，对小鼠进行麻醉，并通过眶后穿刺采集血液。
  2. 根据机构指南，采用 CO₂ 吸入法实施安乐死。
  3. 采集器官，并根据指定的下游步骤处理组织以进行组织学分析。

10. 凝血、纤溶和细胞因子检测

注意：这些实验步骤所用的试剂、检测试剂盒和设备均列于材料表中。

  1. 测定活化部分凝血活酶时间（aPTT）
    1. 使用材料表中列出的凝血仪记录所有凝血时间。
    2. 将25 µL小鼠血浆与25 µL aPTT试剂混合，在37 °C孵育3分钟。加入25 µL以HBS缓冲液（20 mM HEPES、147 mM NaCl、3 mM KCl，pH 7.4）配制的25 mM CaCl₂启动凝血反应，并记录凝血时间。
  2. 测定FV、FII和FX活性
    1. 将5 µL小鼠血浆与20 µL相应的因子缺乏血浆以及25 µL含0.5%牛血清白蛋白的HBS缓冲液混合。
    2. 在37 °C孵育1分钟，然后加入材料表中列出的Innovin试剂启动凝血反应。
    3. 根据相应的校准/参考系统确定因子活性。
  3. 测定FVIII
    1. 按照制造商说明书，使用发色底物法FVIII检测试剂盒测定FVIII活性。
  4. 测定纤维蛋白原
    1. 采用Clauss法测定纤维蛋白原浓度。将10 µL小鼠血浆加入40 µL含0.01%牛血清白蛋白的HEPES缓冲盐水中，在37 °C孵育3分钟。
    2. 加入25 µL凝血酶（25 U/mL）启动纤维蛋白凝块形成，并利用检测试剂盒的校准曲线确定纤维蛋白原浓度。
  5. 测定血浆生物标志物
    1. 使用材料表中列出的市售检测试剂盒测定血浆中TAT复合物、PAP复合物和D-二聚体水平。每项检测均按照制造商说明书进行。
    2. 使用制造商指定的特异性标准品、校准品和质控品，并根据相应的标准曲线计算待测物浓度。
  6. 测定血浆IL-6
    1. 使用材料表中列出的多重细胞因子检测试剂盒，在肝脏损伤前（基线）、损伤后60分钟和6小时测定血浆IL-6浓度。
    2. 按照制造商说明书进行检测，并使用制造商提供的Q-View软件分析数据。

结果

LL 模型可在小鼠中产生可重复且标准化的损伤程度。图 1A 展示了肝脏裂伤重量在归一化至体重（%BW）后的稳定性，各实验组的中位损伤程度为 1.4% BW。该一致性证实了手术诱导的可靠性，使得不同动物及不同实验条件下结果具有可重复性。能够标准化损伤程度对于评估独立于组织损伤变异性的下游生理反应至关重要。

模型中出血反应的验证及治疗干预的效果如图1B所示。小鼠预先接受生理盐水、止血剂rhFVIIa或抗纤溶剂TXA处理，随后定量测定失血量并按体重进行标准化（µL/g）。生理盐水处理的小鼠在肝脏损伤（LL）后出现显著出血，而rhFVIIa或TXA处理的小鼠失血量减少。这些结果表明，该模型能够检测药物对出血的调节作用，并可在非控制性出血条件下评估止血干预措施的效果。

该模型还能再现创伤诱导凝血病的关键特征。如图1C所示，LL导致aPTT延长，表明损伤后凝血功能受损。给予rhFVIIa或TXA治疗可减轻这种延长，提示凝血功能得到恢复。类似地，通过TAT复合物评估的凝血酶生成在LL后升高，而TXA治疗可降低其水平；然而rhFVIIa不能降低TAT水平（图1D），提示其对凝血激活的调节作用不同。

凝血功能障碍的进一步表征见图2。肝脏损伤（LL）导致凝血因子V和VIII的选择性减少，符合创伤性凝血病（TIC）的表现，而给予重组活化因子VII（rhFVIIa）或氨甲环酸（TXA）治疗后，这些变化得到恢复（图2A、B）。相比之下，凝血因子II和X的水平未发生显著改变（图2C、D），表明这些变化发生在因子II和X保持相对完好的背景下，支持以TIC为主导而非类似弥散性血管内凝血（DIC）的表型。

LL 后纤溶反应的发展过程如图3所示。损伤后纤维蛋白原水平下降，提示其被消耗，且 rhFVIIa 或 TXA 均未能使其完全恢复（图3A）。相反，纤溶标志物，包括纤溶酶-抗纤溶酶（PAP）复合物和 D-二聚体，在 LL 后升高。rhFVIIa 可降低 PAP 复合物水平，但对 D-二聚体水平无显著影响。TXA 则可在 LL 后降低 PAP 复合物和 D-二聚体水平（图3B、C）。

最后，在图4中评估全身炎症反应和生存结局。在所有治疗组中，分别于下肢缺血（LL）后60分钟和6小时测定血浆白细胞介素-6（IL-6）水平。各组在早期时间点IL-6水平均升高（图4A）。通过Kaplan-Meier分析评估7天内的生存情况。生理盐水组的7天生存率为75%，rhFVIIa组为55%，TXA治疗组为80%。生理盐水组与TXA组之间无显著差异，而rhFVIIa组的生存率显著低于生理盐水组和TXA组（图4B）。

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图1：肝脏裂伤（LL）模型的验证：损伤严重程度的可重复性、定量失血量及凝血功能障碍的诱导。 通过正中腹切开术继以标准化肝脏裂伤诱导严重内出血。在损伤前，小鼠预先接受生理盐水（约100 µL）、重组人活化因子VII（rhFVIIa；3 mg/kg）或氨甲环酸（TXA；10 mg/kg）处理，以评估药物对出血和凝血功能障碍的调节作用。(A) 损伤严重程度以裂伤肝脏重量与体重的比值（%BW）进行量化，显示在各动物间可重复地诱导出标准化损伤。(B) 采用重量法测定失血量，并按体重进行标准化（µL/g），显示存在可测量的出血，且经TXA治疗后出血减少。(C) 活化部分凝血活酶时间（aPTT）和(D) 凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物水平表明，肝脏裂伤后可重复地诱导出凝血功能障碍，且在给予rhFVIIa或TXA治疗后出现调节效应。数据以单个数值表示，含中位数和四分位距；组间比较采用非参数Mann–Whitney U检验（n = 5–21）。****P ≤ 0.0001。经Joseph等16许可改编。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 2：肝脏裂伤（LL）后创伤性凝血病（TIC）的验证：凝血因子的选择性耗竭。 通过正中开腹术联合标准化肝脏裂伤诱导严重内出血。在损伤前，小鼠预先接受生理盐水（约 100 µL）、重组人活化因子 VII（rhFVIIa；3 mg/kg）或氨甲环酸（TXA；10 mg/kg）处理，以评估药物对凝血病的调节作用。在肝脏裂伤后 60 分钟检测凝血参数。(A) 因子 V 和 (B) 因子 VIII 水平在肝脏裂伤后出现可重复的显著降低，符合创伤性凝血病特征。(C) 因子 II 和 (D) 因子 X 水平相对保留，表明为选择性凝血因子耗竭而非全局性消耗。数据以单个值及中位数与四分位距表示（n = 7–10）。统计学比较采用非参数 Mann-Whitney U 检验。***P ≤ 0.001；****P ≤ 0.0001。经 Joseph 等人许可改编。16 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：肝裂伤（LL）后纤溶激活的验证。 通过正中开腹术诱导严重内出血，随后进行标准化肝裂伤。在损伤前，小鼠预先接受生理盐水（~100 µL）、重组人活化因子VII（rhFVIIa；3 mg/kg）或氨甲环酸（TXA；10 mg/kg）处理，以评估药物对纤溶的调节作用。在肝裂伤后60分钟检测纤溶相关参数。(A) 纤维蛋白原水平在损伤后下降，表明纤溶激活及凝血因子消耗。(B) 纤溶酶-抗纤溶酶（PAP）复合物以及(C) D-二聚体水平在肝裂伤后升高，提示存在活跃的纤维蛋白降解和全身性纤溶激活。数据以单个值及中位数与四分位间距表示（n = 8–13）。统计学比较采用非参数Mann-Whitney U检验。**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001；****P ≤ 0.0001。改编自Joseph等人的研究，经许可使用16。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：肝裂伤（LL）后全身炎症反应的验证及生存评估。 通过正中开腹术并随后进行标准化肝裂伤诱导严重内出血。在损伤前，小鼠预先接受生理盐水（100 µL）、重组人活化因子VII（rhFVIIa；3 mg/kg）或氨甲环酸（TXA；10 mg/kg）处理。损伤后，使用伤口夹和组织粘合剂关闭腹部切口，并将动物放回其原饲养笼中。支持性护理包括在损伤后前三天每天皮下注射生理盐水（400 µL）。在肝裂伤后60分钟和6小时采集血浆样本，以评估全身炎症激活情况。（A）白细胞介素-6（IL-6）水平显示损伤后存在持续的全身炎症反应。数据以单个值及中位数和四分位间距表示。统计学比较采用非参数Mann–Whitney U检验进行（n = 9–13）。（B）采用Kaplan-Meier法评估7天生存率，表明该模型可用于支持基于长期结局的终点指标（n = 20）。****P ≤ 0.0001。经Joseph等16许可改编。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：肝脏裂伤模型及实验时间线的示意图。 本图总结了标准化小鼠肝脏裂伤（LL）非控制性出血模型的实验流程。小鼠接受腹正中切口开腹手术，随后造成约75%左肝叶的可重复性肝脏裂伤。在损伤前5分钟，通过眶后静脉注射给予小鼠生理盐水（~100 µL，溶剂对照组）、重组人活化因子VII（rhFVIIa；3 mg/kg）或氨甲环酸（TXA；10 mg/kg）。出血量的定量通过在损伤时置入腹腔内的预称重腹部纱布完成，纱布于LL后60分钟取出并再次称重，以确定总出血量。随后使用伤口夹和组织粘合剂关闭腹腔。在终点组中，于60分钟时通过眶后途径采集血液样本；在存活组中，则于6小时和7天时采集。血浆用于检测凝血参数，包括活化部分凝血活酶时间（aPTT）、凝血因子活性、凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物、纤溶酶-α2-抗纤溶酶（PAP）复合物以及D-二聚体（60分钟时）。细胞因子谱分析在60分钟和6小时进行。存活情况监测持续7天。经Joseph等16许可改编。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究介绍了一种可重复的小鼠严重出血模型，该模型采用标准化的肝脏损伤（LL）方法，将定量失血评估、创伤性凝血病（TIC）和炎症的表征以及生存分析整合于单次实验中。该模型产生的损伤程度一致，表现为归一化至体重的肝组织撕裂重量具有可比性，同时能够在不同实验组之间可重复地评估出血情况及全身性止血反应。通过使用具有标准化损伤和定量结局指标的小型啮齿类动物模型，可在单一实验框架内高效评估多个实验终点，从而支持对创伤性凝血病（TIC）进行可重复且可扩展的研究，且无需依赖技术上复杂的操作步骤。

重要的是，该模型重现了创伤性凝血病（TIC）的关键特征，包括普通凝血参数（aPTT）延长、凝血酶生成增加（表现为TAT复合物升高）、凝血因子V和VIII的选择性消耗，以及纤溶系统激活（表现为PAP复合物升高和D-二聚体形成）。这些变化发生在凝血因子II和X水平保持正常的背景下，支持以TIC为主导而非弥散性血管内凝血的表型。能够同时定量这些参数，为评估创伤后止血功能紊乱提供了一个具有转化意义的研究框架。

该模型的一个关键优势在于将生存率作为创伤性失血环境下的结局终点指标。为了验证具有临床相关性的抢救策略，我们评估了重组活化凝血因子VII（rhFVIIa）和氨甲环酸（TXA）两种药物，二者均已在人类创伤复苏中被使用或正处于研究阶段。结果显示，TXA在减少失血量、纠正凝血功能障碍及抑制纤溶系统过度激活方面具有稳定效果，并转化为显著的生存获益。相比之下，rhFVIIa则导致明显死亡率升高，其原因与止血参数的过度纠正以及对纤溶过程控制不完全有关。16.

这些发现凸显了该模型的一个重要方面：生存结果取决于出血严重程度、凝血功能障碍和全身反应之间的复杂相互作用，而非单独纠正个别止血通路。该出血模型似乎对生化止血参数与生存率的整合具有敏感性，而生存率是临床实践中关键的结局决定因素。尽管严重创伤性出血是该系统主要模拟的损伤，继发性器官损伤也可能影响最终结局。在我们先前使用该模型的研究中，接受rhFVIIa治疗的小鼠出现了肺部微血栓和纤维蛋白沉积，并与死亡率升高相关，提示血栓性炎症性器官损伤可能对结局具有一定影响16。

尽管本研究未设置同期假手术对照组，但我们先前已证实，仅进行剖腹手术而不进行失血处理不会导致创伤性凝血病（TIC），这表明需要额外的快速失血（休克）才能引发TIC中所观察到的特征性凝血异常14。

该模型的可重复性需考虑若干技术要点。肝叶切除（LL）的范围和位置应标准化，因为切除肝脏组织量的差异会显著影响出血严重程度及继发的凝血功能障碍反应。在本方案中，切除左侧肝叶约75%，并将损伤肝脏的重量标准化为体重，以提供损伤一致性的客观衡量指标。快速且牢固地关闭腹腔也至关重要，以防止外部失血，并在观察期间维持腹腔内出血的封闭环境。为准确测量失血量，应始终采用相同的收集程序和时间点，回收预先称重的纱布。这些步骤可最大限度减少操作者依赖性变异，尤为重要的是，初始失血量的差异可能影响后续凝血功能障碍及存活率。若在关闭腹腔前出现过度出血，或血液外泄丢失，该实验动物应予以剔除。

该模型的一个局限性在于其专注于器官损伤，无法反映多发伤的异质性，而多发伤可能包括长骨骨折、软组织挤压伤以及其他复杂的休克状态。然而，这种特定的损伤设计也是该模型的有意特征，可在避免多种损伤模式带来的额外操作复杂性和变异性的情况下，研究严重出血和创伤性凝血病（TIC）的影响。总之，这种小鼠LL模型为研究创伤相关性出血、创伤性凝血病及死亡率提供了一种经济高效（相较于大型动物研究）、稳健且可扩展的方法。该模型结合了简单的小型啮齿类实验平台、标准化损伤、定量失血量测量、全面的止血功能分析以及生存评估，为需要更复杂仪器设备的创伤模型提供了一种实用的替代方案。它能够在临床相关的背景下，对失血量、凝血功能（aPTT、FII、FV、FVIII、FX、TAT）、纤溶活性（纤维蛋白原、PAP、D-二聚体）以及生存终点进行综合评估，非常适合用于评价抗纤溶治疗和靶向止血干预措施。

披露

A.v.D. 因参加BioMarin、Regeneron、Pfizer、Bioverativ/Sanofi、CSL Behring、Novo Nordisk、Spark Therapeutics、Genentech和uniQure的科学顾问委员会、咨询及演讲活动而获得酬金。A.v.D. 是生物技术公司Hematherix LLC的联合创始人，该公司正在开发用于治疗出血并发症的superFVa疗法。B.C.J.、M.L.C.和R.M.无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Laurent Mosnier 博士提供的技术建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
25 G 针头BD Diagnostics305124
30 G 针头BD Diagnostics305106
麻醉系统Patterson Scientific78915712
aPTT 试剂 - STA-C.K. Prest. 5Stago597
自动夹闭器Fine Science Tools12022-19
自动夹闭器施加器Fine Science Tools12020-09
自动夹闭器移除器Fine Science Tools12023-00
牛血清白蛋白Sigma Aldrich10735078001
氯化钙Fisher scientificC79-500
毛细管 – 普通型Fisher Scientific22-260943
棉签Medique19-090-701
棉球Fisher Scientific22-456-103
D-二聚体 ELISA 试剂盒InvitrogenEEL094
Delta Phase 恒温垫Braintree Scientific50-195-4663
乙醇Fisher scientificBP28184
EthiqaFidelisSKU 072117
因子 II 缺陷型血浆Affinity BiologicalsFII-DP
因子 V 缺陷型血浆Affinity BiologicalsFV-DP
因子 VIII 缺陷型血浆Affinity BiologicalsFVIII-DP
因子 X 缺陷型血浆Affinity BiologicalsFX-DP
滤纸，超厚，7 cm × 8.4 cmFisher ScientificPI88605
Graefe 镊子Fine Science Tools11049-10
诱导室Patterson Scientific78933385
注射级生理盐水Hospira0409-4888-02
InnovinSiemens Healthineers23-044-778
异氟烷Med Vet International50-304-2993
K824086 Chromogenix Coatest SP 因子 VIIIDiapharma K822585
Liqui Vet 快速组织粘合剂World Precision Instrument50-253-9340
微珠灭菌器Fisher scientific14-955-342
微量离心管 – 1.5 mLFisher ScientificAM12400
小鼠细胞因子多重检测试剂盒Quansys Biosciences 111049MS-13P
PAP 复合物检测试剂盒BiotechneNBP3-06903
聚维酮碘Med Vet International50-283-2277
重组人活化因子 VIINovo Nordisk0169-7001
柠檬酸钠Fisher ScientificS279-500
手术单Stoelting10-000-695
Equaflow 小鼠 5 通道麻醉手术平台Patterson Scientific78919268
手术剪Fine Science Tools91405-11
胶带Fisher scientific15-901-5R
TAT 复合物检测试剂盒Siemens Healthineers23-044-704
凝血酶InvitrogenPIRP43100
氨甲环酸Auromedics55150-0188-10
毛发修剪器Stoelting10-000-792
WAG 活性炭过滤系统Patterson Scientific78909457
称量舟Fisher Scientific01-549-752

参考文献

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创伤诱导性凝血功能障碍出血量化炎症标志物生存分析失血量测量凝血因子纤溶激活炎症激活药物调控

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