本方案描述了在脑卒中后痉挛大鼠模型中进行运动式头针治疗的方法，并通过行为学、磁共振成像、组织学和电生理学评估来研究外囊微结构及脊髓反射兴奋性的变化。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
研究文章
* These authors contributed equally
本方案描述了在脑卒中后痉挛大鼠模型中进行运动式头针治疗的方法，并通过行为学、磁共振成像、组织学和电生理学评估来研究外囊微结构及脊髓反射兴奋性的变化。
脑卒中后痉挛（PSS）严重影响脑卒中后的运动功能和生活质量。皮质-网状脊髓通路的破坏以及上位脊髓下行性抑制功能受损被认为是重要的病理机制；然而，运动式头皮针刺疗法（MSSA）治疗效应背后的神经与微结构机制仍不完全明确。本研究旨在通过整合神经影像学、电生理学和组织学的多模态评估方法，在大脑中动脉阻塞的大鼠模型中探讨MSSA对PSS的影响。采用T2加权磁共振成像定量脑梗死体积，利用扩散张量成像评估外囊白质的微结构完整性。Luxol 快速蓝（LFB）染色用于评估外囊区域的髓鞘完整性，H反射记录用于评价脊髓反射兴奋性。通过相关性分析考察梗死体积、白质微结构、脊髓反射兴奋性与痉挛严重程度之间的关系。结果显示，MSSA可减小脑梗死体积，减轻外囊微结构损伤，并缓解脱髓鞘改变。此外，MSSA改善了异常的H反射参数，使脊髓反射兴奋性恢复正常，并减轻痉挛症状。相关性分析表明，较大的梗死体积与更严重的外囊损伤相关，而白质完整性保存较好则与脊髓反射调控改善及较轻的痉挛程度相关。这些发现提示，MSSA可能通过减轻缺血性脑损伤、保护外囊微结构完整性以及改善与皮质-网状脊髓通路相关的下行性抑制功能来缓解PSS，为该疗法的临床应用提供了前期实验依据。
卒中后痉挛（PSS）是缺血性卒中常见且致残的后遗症，临床定义为肌肉张力随牵伸速度和肌肉长度增加而升高。该病症常导致肢体异常姿势和运动模式紊乱，严重损害患者的运动独立性和生活质量，同时在全球范围内带来巨大的经济负担和照护压力1,2。作为上运动神经元综合征的典型表现，PSS的发病机制主要归因于脊髓牵张反射的过度亢进。越来越多的神经解剖学和神经生理学研究表明，锥体外系统对脊髓反射回路的下行抑制性调节功能丧失，是PSS发生和进展的关键病理机制，其中皮质-网状脊髓通路是介导这种下行调控作用的主要神经通路3,4,5。
针刺技术是决定针灸疗效的关键因素，在临床针灸实践中具有核心地位。运动-动态头针疗法（MSSA）是一种专为卒中后痉挛状态（PSS）干预而设计的独特针刺技术，它将头针疗法与肢体主动或被动运动训练相结合3。大量临床试验表明，与单独使用头针疗法或单独进行运动康复相比，MSSA在减轻痉挛严重程度、恢复运动功能以及改善卒中患者日常生活活动能力方面具有更优的疗效6,7,8,9。我们先前的动物研究进一步证实，在PSS大鼠模型中，MSSA比传统头针疗法具有更显著的抗痉挛作用。其作用机制与改善缺血半暗带的脑灌注、降低脊髓牵张反射兴奋性以及上调脊髓前角运动神经元中钾-氯共转运体2（KCC2）的表达有关。这种分子调控可能进一步增强脊髓γ-氨基丁酸（GABA）能抑制性传导，从而有助于缓解痉挛状态10,11。
目前关于MSSA的机制研究仍然有限，尚无先前研究专门探讨锥体外系下行通路中大脑深部白质如何参与PSS的发生。外囊是皮质-网状脊髓通路中的关键白质区段，包含将皮质信号传递至脑干网状结构的皮质-被盖纤维，从而参与对脊髓反射回路的上位抑制性调控12,13。与此解剖功能一致，多项基于体素的病灶-症状映射研究显示，外囊损伤与卒中后上肢和下肢痉挛相关12,13,14。这些解剖学和临床观察结果支持将外囊选为主要感兴趣区域（ROI）。迄今为止，尚无in vivo证据表明MSSA是否能够维持外囊微结构的完整性，或此类结构改变是否与脊髓反射兴奋性的变化相关。基于行为评估、常规磁共振成像（MRI）和电生理检测的临床评估仅能进行相关性分析，且可能受到患者异质性、病程长短及其他临床混杂因素的影响。相比之下，标准化的PSS大鼠模型可严格控制实验变量并实施统一的干预方案，从而为机制研究提供一个互补的研究平台。
本研究聚焦于脑白质微结构与神经生理功能，整合了多种模态方法，包括T2加权成像（T2WI）、扩散张量成像（DTI）、H反射电生理记录、外囊特异性Luxol快蓝（LFB）染色以及行为学评估。通过建立结构-功能-行为相关性分析框架，旨在探讨在PSS大鼠模型中经MSSA治疗后，脑梗死、外囊微结构、脊髓反射兴奋性与肌张力增高之间的相互关系。研究结果旨在为MSSA干预后外囊结构完整性保留与脊髓反射过度兴奋性降低之间的关联提供临床前证据，同时为MSSA在PSS康复中的转化应用提供理论依据。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
40只成年雄性无特定病原体（SPF）Sprague–Dawley（SD）大鼠，体重240–280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2021-0011］。所有大鼠均饲养于北京中医药大学实验动物中心，环境条件严格控制，室温为23°C ± 1°C，相对湿度为50% ± 5%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，自由摄食和饮水。大鼠适应环境5天，在此期间同时进行跑台运动适应性训练。动物每日进行一次跑台适应，速度为10 m/min，每次持续15分钟，不施加电刺激，以减少操作应激。
根据我们之前的研究，采用大脑中动脉闭塞（MCAO）方法诱导PSS的成功率约为60%15。通过随机数字表法，预先随机选取9只大鼠作为假手术组；其余31只大鼠用于模型制备。成功建模后，将这些大鼠随机分为模型组和MSSA组。最终，每组各纳入9只大鼠。本实验遵循实验动物福利的3R原则，并已获得北京中医药大学动物伦理委员会的批准（BUCM 20250915-008）。
模型建立
采用改良的血管内缝线法在大鼠中建立大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。大鼠以3%异氟烷进行麻醉诱导，并在手术全程通过1 L/min的恒定氧流量维持1.5%异氟烷麻醉。行颈部正中切口，钝性分离暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。将一根尼龙单丝缝线（直径为0.36 ± 0.02 mm）从ECA插入ICA，并向前推进约18–20 mm，直至大脑中动脉（MCA）起始处，以实现动脉闭塞。结扎血管后缝合切口。术后将大鼠置于加热垫上，直至从麻醉中恢复。假手术组大鼠接受相同的手术操作以暴露CCA、ICA和ECA，但不插入血管内缝线。
术后，所有MCAO大鼠均接受标准化的术后护理。动物在术后前12小时内置于37°C加热垫上，以防止低体温。手术切口连续三天每日清洁，腹腔注射氨苄西林（100 mg/kg）以预防感染，并提供软质食物以维持充足营养。术后第1至第10天每日监测大鼠的一般活动、进食量、伤口状况及肢体运动功能。
神经功能缺损由对分组情况不知情的研究人员采用Zea Longa神经功能缺损评分进行评估，肌张力则采用改良Ashworth量表（MAS）进行评估。评估时间点包括术前1天（第−1天）、手术当天MCAO前（第0天）以及术后第1、3、5、7和10天。若大鼠在术后第3天的Zea Longa评分和MAS评分均≥1，则认为其成功建立了PSS模型。
MSSA 治疗
干预措施从术后第3天开始。头针刺激部位为病灶同侧MS 6线（顶颞前斜线）。根据 头皮针标准化操作国家标准 （GB/T 21709.2-2021），MS 6线从GV 21（前顶）延伸至GB 6（悬厘）。
将一次性无菌针灸针（0.25 × 13 mm）以约15°的倾斜角度刺入头皮表面下方的帽状腱膜，在督脉21穴（GV 21）进针，并沿前顶颞斜线向前推进至胆经6穴（GB 6），进针深度约为10 mm。以每分钟200转的速度进行快速捻转操作，持续1分钟。留针15分钟后，重复相同捻转操作一次，总留针时间为30分钟。在整个留针期间，大鼠同时以10 m/min的恒定速度在跑台上进行运动。
假手术组和模型组的大鼠均未接受针灸或跑台运动干预。为控制非特异性操作和束缚应激的影响，这些大鼠每日接受轻柔操作，并使用非压迫性袜套固定装置束缚30分钟，以匹配MSSA组的每日总干预时长。
行为学评估
神经功能缺损的 Zea Longa 评分：
采用Zea Longa评分系统评估大鼠的神经功能缺损16。评分标准如下：0分表示无神经功能缺损，活动自如；1分表示对侧前肢或后肢伸展不完全；2分表示行走时向对侧转圈；3分表示行走时向对侧倾倒；4分表示意识丧失且无法自主行走。
肌肉张力的 MAS 评估：
肌张力采用MAS17进行评估。其标准定义如下：0级，无肌张力增高；1级，肌张力轻度增高，在被动屈伸运动终末出现短暂性卡顿或轻微阻力；1+级，肌张力明显增高，在关节活动范围中段出现短暂性卡顿，且在运动后半程持续存在阻力；2级，肌张力显著增高，在大部分关节活动范围内均可察觉阻力，但肢体仍较易移动；3级，肌张力大幅增高，导致被动屈伸运动困难；4级，由于关节僵直，被动活动范围受限。本研究中，1+级记为2分，因此MAS最高得分为5分10。
基于T2加权成像的脑梗死体积定量神经影像学
所有T2加权成像（T2WI）扫描均使用PharmaScan MRI扫描仪，并在ParaVision 360软件（版本3.5）控制下完成。对MCAO大鼠采用T2加权快速自旋回波增强序列（T2_TurboRARE，也称为RARE/快速自旋回波[FSE]）进行扫描，以量化脑梗死体积。成像参数设置如下：重复时间（TR）= 3000.0 ms，回波时间（TE）= 33.0 ms，视野（FOV）= 35.00 × 35.00 mm2，矩阵大小 = 250 × 250，层厚 = 0.80 mm，层数 = 35，激发次数（NEX）= 3.0，翻转角（FA）= 180.0°。由一名不了解分组情况的研究人员，在ITK-SNAP软件（版本4.4.0）中逐层手动勾画脑梗死区域，依据为符合缺血性梗死的信号强度变化和形态学特征。随后由软件自动计算脑梗死体积。
利用DTI神经影像学评估白质微结构完整性
使用7.0 T PharmaScan磁共振成像仪采集MRI数据。通过压缩空气（0.4–0.6 L/min）输送3%异氟烷诱导麻醉，并在DTI数据采集过程中以1%异氟烷维持麻醉。在整个成像过程中，使用恒温控制的水浴维持核心体温。
进行MRI扫描时，首先应用三平面定位序列以确定大鼠脑在磁体中的位置。采用轴向单次激发自旋回波平面成像序列进行DTI扫描，参数如下：TR/TE = 3000/27 ms，矩阵 = 90 × 75，视野（FOV）= 20 × 15 mm2，层厚 = 0.7 mm，扩散梯度方向数为30，b值分别为0和1000 s/mm2。在DTI分析中，于前囟后1.3 mm的脑切片上在外部囊区域绘制感兴趣区。使用ParaVision 360软件重建分数各向异性（FA）、平均扩散率（MD）、轴向扩散率（AD）和径向扩散率（RD）的参数图。数据表示为患侧半脑与对侧健康半脑的比值。
通过LFB染色评估髓鞘损伤与再髓鞘化
采用LFB染色法评估外囊中髓鞘轴突的结构损伤。通过测量感兴趣区域（ROI）内LFB染色髓鞘纤维的积分光密度（IOD），使用ImageJ软件（版本6.0；灰度阈值为35–225）对髓鞘损伤（以髓鞘稀疏和空泡形成为特征）进行定量分析。根据大鼠脑立体定位图谱18，每只动物选取前囟+1.0 mm、−1.3 mm和−1.6 mm处的三个冠状切面，分别对应外囊的前部、中部和中后部。计算每个动物三个切面的平均IOD值（每组n = 4）。将同侧IOD值相对于对侧进行标准化，并以百分比形式表示19。
评估脊髓反射兴奋性的电生理记录
使用生物机能实验系统记录脊髓单突触H反射。大鼠通过腹腔注射α-氯醛糖（50 mg/kg）进行轻度麻醉，以在电生理记录期间保持脊髓反射的兴奋性。通过钝性分离暴露左侧坐骨神经，并将其置于双极钩状电极上以进行电刺激。间歇性地向暴露的神经施加油性维生素溶液，以维持组织水合状态和神经活性。将一对不锈钢记录电极插入左后足的骨间肌中，参考电极置于尾部。使用单极-双极脉冲刺激器（脉冲持续时间为100 μs）诱发H反射。通过逐步增加电刺激强度（以0.05 mA为步长，最大强度为3.0 mA）确定H反射阈值和运动阈值（MT），以避免不可逆的外周神经损伤。
采用与引出最大H反射（Hmax）相同的刺激强度，施加不同频率（0.3、5 和 10 Hz）的脉冲刺激，以获取不同刺激频率下的H反射波幅。使用0.3 Hz的重复脉冲刺激，验证M波波幅是否保持在初始值的95%以内；否则，该数据集将被剔除。H反射的频率依赖性抑制（FDD）定义为5 Hz和10 Hz时H波与M波波幅比值（H/M比值）相对于0.3 Hz时的百分比，其中0.3 Hz的H/M比值作为基线参考值10。
数据分析
采用SPSS软件（版本20.0）进行统计分析。连续性数据以均值±标准差（SD）表示。使用Shapiro–Wilk检验评估数据的正态性。采用单因素方差分析（ANOVA）比较各组之间的常规影像学结果及其他定量变量。当方差齐性满足时，进行Bonferroni事后检验；否则，采用Dunnett’s T3检验。行为学数据采用双因素方差分析（ANOVA），以实验组别和术后时间点作为固定因子。采用Spearman相关性分析评估研究变量之间的关联性。以p < 0.05为差异具有统计学意义。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
MSSA 改善神经功能缺陷
双因素重复测量方差分析显示，Zea Longa 神经功能评分在时间（F[2.613, 62.71] = 315.3，p < 0.001）和分组（F[2, 24] = 142.9，p < 0.001）上均存在显著的主效应，且时间与分组之间存在显著的交互作用（F[12, 144] = 99.94，p < 0.001）。术前1天，假手术组、模型组和MSSA组所有大鼠的Zea Longa评分为0分，表明各组大鼠术前神经功能正常，无神经功能缺损。术后第1天起，模型组和MSSA组大鼠的Zea Longa评分逐渐升高。在术后第1天至第5天期间，这两组之间的评分差异无统计学意义（p > 0.05）。随着干预持续进行，MSSA组在术后第7天和第10天的Zea Longa评分显著低于模型组（p < 0.001），表明神经功能得到改善（图1A）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
从中医角度来看，卒中后痉挛（PSS）属于筋病范畴，其核心病机可概括为“本在脑损，标在肢挛”20。因此，治疗策略应兼顾原发性脑损伤与继发性外周表现21。MSSA的治疗理念强调从缺血脑组织到痉挛肢体的整体调控，治疗目标包括活血化瘀、疏通经络、舒筋解痉、缓解肌张力增高。针刺技术是针灸疗效的关键，根据疾病证候选择适宜的技术对获得良好临床疗效至关重要。MSSA是一种针对PSS的特色头针疗法，其特点是在留针期间结合患肢的主动或被动运动3。近期一项系统综述与荟萃分析表明，与传统头针或单纯康复训练相比，MSSA在减轻肌肉痉挛、改善运动功能及提升日常生活活动能力方面具有更优疗效9。值得注意的是，头针与康复训练同步实施（如MSSA所采用）的疗效优于非同步干预，这一结论已得到中等质量临床证据的支持9。MS 6是依据GB/T 21709.2-2021标准定义的一条额顶颞斜前线头针刺激线，因其解剖相关性及明确的临床效用而被选用...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
利益冲突：
作者声明无利益冲突。
本研究由国家自然科学基金（项目编号：82405579）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α水合氯醛 | GoldBio | C-118-250 | H反射记录用麻醉剂 |
| 无水乙醇 | 北京同光精细化工有限公司 | VS104021-500 mL | 组织学试剂 |
| 针灸针（0.25 × 13 mm | 北京中研太和针灸针有限公司 | NA | 一次性无菌头皮针 |
| 氨苄青霉素 | 北京瑞达恒慧科技发展有限公司 | HD-3018-500g | 术后感染预防用抗生素 |
| 生物机能实验系统（BL420N） | 成都泰盟科技有限公司 | NA | 电生理记录系统 |
| 扩散张量成像分析软件（ParaVision 360） | Bruker | NA | MRI数据采集与DTI重建 |
| 环保型脱蜡与透明化溶液 | Servicebio | G1128-500ML | 组织学试剂 |
| 全自动轮转式切片机 | Leica Microsystems | RM2255 | 组织切片 |
| 加热垫 | 苏州彩阳电加热技术有限公司 | TT180×150-1XD | 术后体温维持 |
| ImageJ 6.0 | 美国国立卫生研究院 | NA | 定量图像分析 |
| 异氟烷 | 北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司 | I8000-25g | 吸入麻醉剂 |
| ITK-SNAP 4.4.0 | 宾夕法尼亚大学 | NA | 脑梗死分割 |
| 焦油蓝快速染液 | Servicebio | G1030-100ML | 髓鞘染色 |
| 单丝尼龙缝合线（0.36 ± 0.02 mm | 北京辛诺科技有限公司 | NA | MCAO 诱导 |
| 多聚甲醛（PBS 中 4%） | Servicebio | TBAB0102 | 组织固定 |
| PharmaScan 7.0 T 磁共振成像仪 | 布鲁克 | NA | MRI数据采集 |
| SPSS Statistics 20.0 | IBM | NA | 统计分析 |
| 斯普拉格–Dawley大鼠（SPF级，雄性） | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | NA | 实验动物 |
| 温控水浴系统 | 上海智信实验仪器技术有限公司 | ZX-5A | 磁共振成像过程中的温度维持 |
| 啮齿类动物跑步机 | 聪明 | TreadScan | 习服期间的运动训练与MSSA |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本文已发表
视频即将推出