本方案描述了在脑卒中后痉挛大鼠模型中进行运动式头针治疗的方法，并通过行为学、磁共振成像、组织学和电生理学评估来研究外囊微结构及脊髓反射兴奋性的变化。
研究文章
运动风格头针对外囊微结构及脑卒中后痉挛大鼠脊髓反射兴奋性的影响
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
脑卒中后痉挛（PSS）严重影响脑卒中后的运动功能和生活质量。皮质-网状脊髓通路的破坏以及上位脊髓下行性抑制功能受损被认为是重要的病理机制；然而，运动式头皮针刺疗法（MSSA）治疗效应背后的神经与微结构机制仍不完全明确。本研究旨在通过整合神经影像学、电生理学和组织学的多模态评估方法，在大脑中动脉阻塞的大鼠模型中探讨MSSA对PSS的影响。采用T2加权磁共振成像定量脑梗死体积，利用扩散张量成像评估外囊白质的微结构完整性。Luxol 快速蓝（LFB）染色用于评估外囊区域的髓鞘完整性，H反射记录用于评价脊髓反射兴奋性。通过相关性分析考察梗死体积、白质微结构、脊髓反射兴奋性与痉挛严重程度之间的关系。结果显示，MSSA可减小脑梗死体积，减轻外囊微结构损伤，并缓解脱髓鞘改变。此外，MSSA改善了异常的H反射参数，使脊髓反射兴奋性恢复正常，并减轻痉挛症状。相关性分析表明，较大的梗死体积与更严重的外囊损伤相关，而白质完整性保存较好则与脊髓反射调控改善及较轻的痉挛程度相关。这些发现提示，MSSA可能通过减轻缺血性脑损伤、保护外囊微结构完整性以及改善与皮质-网状脊髓通路相关的下行性抑制功能来缓解PSS，为该疗法的临床应用提供了前期实验依据。
引言
卒中后痉挛（PSS）是缺血性卒中常见且致残的后遗症，临床定义为肌肉张力随牵伸速度和肌肉长度增加而升高。该病症常导致肢体异常姿势和运动模式紊乱，严重损害患者的运动独立性和生活质量，同时在全球范围内带来巨大的经济负担和照护压力1,2。作为上运动神经元综合征的典型表现，PSS的发病机制主要归因于脊髓牵张反射的过度亢进。越来越多的神经解剖学和神经生理学研究表明，锥体外系统对脊髓反射回路的下行抑制性调节功能丧失，是PSS发生和进展的关键病理机制，其中皮质-网状脊髓通路是介导这种下行调控作用的主要神经通路3,4,5。
针刺技术是决定针灸疗效的关键因素，在临床针灸实践中具有核心地位。运动-动态头针疗法（MSSA）是一种专为卒中后痉挛状态（PSS）干预而设计的独特针刺技术，它将头针疗法与肢体主动或被动运动训练相结合3。大量临床试验表明，与单独使用头针疗法或单独进行运动康复相比，MSSA在减轻痉挛严重程度、恢复运动功能以及改善卒中患者日常生活活动能力方面具有更优的疗效6,7,8,9。我们先前的动物研究进一步证实，在PSS大鼠模型中，MSSA比传统头针疗法具有更显著的抗痉挛作用。其作用机制与改善缺血半暗带的脑灌注、降低脊髓牵张反射兴奋性以及上调脊髓前角运动神经元中钾-氯共转运体2（KCC2）的表达有关。这种分子调控可能进一步增强脊髓γ-氨基丁酸（GABA）能抑制性传导，从而有助于缓解痉挛状态10,11。
目前关于MSSA的机制研究仍然有限，尚无先前研究专门探讨锥体外系下行通路中大脑深部白质如何参与PSS的发生。外囊是皮质-网状脊髓通路中的关键白质区段，包含将皮质信号传递至脑干网状结构的皮质-被盖纤维，从而参与对脊髓反射回路的上位抑制性调控12,13。与此解剖功能一致，多项基于体素的病灶-症状映射研究显示，外囊损伤与卒中后上肢和下肢痉挛相关12,13,14。这些解剖学和临床观察结果支持将外囊选为主要感兴趣区域（ROI）。迄今为止，尚无in vivo证据表明MSSA是否能够维持外囊微结构的完整性，或此类结构改变是否与脊髓反射兴奋性的变化相关。基于行为评估、常规磁共振成像（MRI）和电生理检测的临床评估仅能进行相关性分析，且可能受到患者异质性、病程长短及其他临床混杂因素的影响。相比之下，标准化的PSS大鼠模型可严格控制实验变量并实施统一的干预方案，从而为机制研究提供一个互补的研究平台。
本研究聚焦于脑白质微结构与神经生理功能，整合了多种模态方法，包括T2加权成像（T2WI）、扩散张量成像（DTI）、H反射电生理记录、外囊特异性Luxol快蓝（LFB）染色以及行为学评估。通过建立结构-功能-行为相关性分析框架，旨在探讨在PSS大鼠模型中经MSSA治疗后，脑梗死、外囊微结构、脊髓反射兴奋性与肌张力增高之间的相互关系。研究结果旨在为MSSA干预后外囊结构完整性保留与脊髓反射过度兴奋性降低之间的关联提供临床前证据，同时为MSSA在PSS康复中的转化应用提供理论依据。
方案
40只成年雄性无特定病原体（SPF）Sprague–Dawley（SD）大鼠，体重240–280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2021-0011］。所有大鼠均饲养于北京中医药大学实验动物中心，环境条件严格控制，室温为23°C ± 1°C，相对湿度为50% ± 5%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，自由摄食和饮水。大鼠适应环境5天，在此期间同时进行跑台运动适应性训练。动物每日进行一次跑台适应，速度为10 m/min，每次持续15分钟，不施加电刺激，以减少操作应激。
根据我们之前的研究，采用大脑中动脉闭塞（MCAO）方法诱导PSS的成功率约为60%15。通过随机数字表法，预先随机选取9只大鼠作为假手术组；其余31只大鼠用于模型制备。成功建模后，将这些大鼠随机分为模型组和MSSA组。最终，每组各纳入9只大鼠。本实验遵循实验动物福利的3R原则，并已获得北京中医药大学动物伦理委员会的批准（BUCM 20250915-008）。
模型建立
采用改良的血管内缝线法在大鼠中建立大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。大鼠以3%异氟烷进行麻醉诱导，并在手术全程通过1 L/min的恒定氧流量维持1.5%异氟烷麻醉。行颈部正中切口，钝性分离暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。将一根尼龙单丝缝线（直径为0.36 ± 0.02 mm）从ECA插入ICA，并向前推进约18–20 mm，直至大脑中动脉（MCA）起始处，以实现动脉闭塞。结扎血管后缝合切口。术后将大鼠置于加热垫上，直至从麻醉中恢复。假手术组大鼠接受相同的手术操作以暴露CCA、ICA和ECA，但不插入血管内缝线。
术后，所有MCAO大鼠均接受标准化的术后护理。动物在术后前12小时内置于37°C加热垫上，以防止低体温。手术切口连续三天每日清洁，腹腔注射氨苄西林（100 mg/kg）以预防感染，并提供软质食物以维持充足营养。术后第1至第10天每日监测大鼠的一般活动、进食量、伤口状况及肢体运动功能。
神经功能缺损由对分组情况不知情的研究人员采用Zea Longa神经功能缺损评分进行评估，肌张力则采用改良Ashworth量表（MAS）进行评估。评估时间点包括术前1天（第−1天）、手术当天MCAO前（第0天）以及术后第1、3、5、7和10天。若大鼠在术后第3天的Zea Longa评分和MAS评分均≥1，则认为其成功建立了PSS模型。
MSSA 治疗
干预措施从术后第3天开始。头针刺激部位为病灶同侧MS 6线（顶颞前斜线）。根据 头皮针标准化操作国家标准 （GB/T 21709.2-2021），MS 6线从GV 21（前顶）延伸至GB 6（悬厘）。
将一次性无菌针灸针（0.25 × 13 mm）以约15°的倾斜角度刺入头皮表面下方的帽状腱膜，在督脉21穴（GV 21）进针，并沿前顶颞斜线向前推进至胆经6穴（GB 6），进针深度约为10 mm。以每分钟200转的速度进行快速捻转操作，持续1分钟。留针15分钟后，重复相同捻转操作一次，总留针时间为30分钟。在整个留针期间，大鼠同时以10 m/min的恒定速度在跑台上进行运动。
假手术组和模型组的大鼠均未接受针灸或跑台运动干预。为控制非特异性操作和束缚应激的影响，这些大鼠每日接受轻柔操作，并使用非压迫性袜套固定装置束缚30分钟，以匹配MSSA组的每日总干预时长。
行为学评估
神经功能缺损的 Zea Longa 评分：
采用Zea Longa评分系统评估大鼠的神经功能缺损16。评分标准如下：0分表示无神经功能缺损，活动自如；1分表示对侧前肢或后肢伸展不完全；2分表示行走时向对侧转圈；3分表示行走时向对侧倾倒；4分表示意识丧失且无法自主行走。
肌肉张力的 MAS 评估：
肌张力采用MAS17进行评估。其标准定义如下：0级，无肌张力增高；1级，肌张力轻度增高，在被动屈伸运动终末出现短暂性卡顿或轻微阻力；1+级，肌张力明显增高，在关节活动范围中段出现短暂性卡顿，且在运动后半程持续存在阻力；2级，肌张力显著增高，在大部分关节活动范围内均可察觉阻力，但肢体仍较易移动；3级，肌张力大幅增高，导致被动屈伸运动困难；4级，由于关节僵直，被动活动范围受限。本研究中，1+级记为2分，因此MAS最高得分为5分10。
基于T2加权成像的脑梗死体积定量神经影像学
所有T2加权成像（T2WI）扫描均使用PharmaScan MRI扫描仪，并在ParaVision 360软件（版本3.5）控制下完成。对MCAO大鼠采用T2加权快速自旋回波增强序列（T2_TurboRARE，也称为RARE/快速自旋回波[FSE]）进行扫描，以量化脑梗死体积。成像参数设置如下：重复时间（TR）= 3000.0 ms，回波时间（TE）= 33.0 ms，视野（FOV）= 35.00 × 35.00 mm2，矩阵大小 = 250 × 250，层厚 = 0.80 mm，层数 = 35，激发次数（NEX）= 3.0，翻转角（FA）= 180.0°。由一名不了解分组情况的研究人员，在ITK-SNAP软件（版本4.4.0）中逐层手动勾画脑梗死区域，依据为符合缺血性梗死的信号强度变化和形态学特征。随后由软件自动计算脑梗死体积。
利用DTI神经影像学评估白质微结构完整性
使用7.0 T PharmaScan磁共振成像仪采集MRI数据。通过压缩空气（0.4–0.6 L/min）输送3%异氟烷诱导麻醉，并在DTI数据采集过程中以1%异氟烷维持麻醉。在整个成像过程中，使用恒温控制的水浴维持核心体温。
进行MRI扫描时，首先应用三平面定位序列以确定大鼠脑在磁体中的位置。采用轴向单次激发自旋回波平面成像序列进行DTI扫描，参数如下：TR/TE = 3000/27 ms，矩阵 = 90 × 75，视野（FOV）= 20 × 15 mm2，层厚 = 0.7 mm，扩散梯度方向数为30，b值分别为0和1000 s/mm2。在DTI分析中，于前囟后1.3 mm的脑切片上在外部囊区域绘制感兴趣区。使用ParaVision 360软件重建分数各向异性（FA）、平均扩散率（MD）、轴向扩散率（AD）和径向扩散率（RD）的参数图。数据表示为患侧半脑与对侧健康半脑的比值。
通过LFB染色评估髓鞘损伤与再髓鞘化
采用LFB染色法评估外囊中髓鞘轴突的结构损伤。通过测量感兴趣区域（ROI）内LFB染色髓鞘纤维的积分光密度（IOD），使用ImageJ软件（版本6.0；灰度阈值为35–225）对髓鞘损伤（以髓鞘稀疏和空泡形成为特征）进行定量分析。根据大鼠脑立体定位图谱18，每只动物选取前囟+1.0 mm、−1.3 mm和−1.6 mm处的三个冠状切面，分别对应外囊的前部、中部和中后部。计算每个动物三个切面的平均IOD值（每组n = 4）。将同侧IOD值相对于对侧进行标准化，并以百分比形式表示19。
评估脊髓反射兴奋性的电生理记录
使用生物机能实验系统记录脊髓单突触H反射。大鼠通过腹腔注射α-氯醛糖（50 mg/kg）进行轻度麻醉，以在电生理记录期间保持脊髓反射的兴奋性。通过钝性分离暴露左侧坐骨神经，并将其置于双极钩状电极上以进行电刺激。间歇性地向暴露的神经施加油性维生素溶液，以维持组织水合状态和神经活性。将一对不锈钢记录电极插入左后足的骨间肌中，参考电极置于尾部。使用单极-双极脉冲刺激器（脉冲持续时间为100 μs）诱发H反射。通过逐步增加电刺激强度（以0.05 mA为步长，最大强度为3.0 mA）确定H反射阈值和运动阈值（MT），以避免不可逆的外周神经损伤。
采用与引出最大H反射（Hmax）相同的刺激强度，施加不同频率（0.3、5 和 10 Hz）的脉冲刺激，以获取不同刺激频率下的H反射波幅。使用0.3 Hz的重复脉冲刺激，验证M波波幅是否保持在初始值的95%以内；否则，该数据集将被剔除。H反射的频率依赖性抑制（FDD）定义为5 Hz和10 Hz时H波与M波波幅比值（H/M比值）相对于0.3 Hz时的百分比，其中0.3 Hz的H/M比值作为基线参考值10。
数据分析
采用SPSS软件（版本20.0）进行统计分析。连续性数据以均值±标准差（SD）表示。使用Shapiro–Wilk检验评估数据的正态性。采用单因素方差分析（ANOVA）比较各组之间的常规影像学结果及其他定量变量。当方差齐性满足时，进行Bonferroni事后检验；否则，采用Dunnett’s T3检验。行为学数据采用双因素方差分析（ANOVA），以实验组别和术后时间点作为固定因子。采用Spearman相关性分析评估研究变量之间的关联性。以p < 0.05为差异具有统计学意义。
结果
MSSA 改善神经功能缺损
双因素重复测量方差分析显示，时间具有显著的主效应（F[2.613, 62.71] = 315.3， p < 0.001）和组别（F[2, 24] = 142.9， p < 0.001），以及显著的时间 × 组间交互作用（F[12, 144] = 99.94， p < 0.001）的Zea Longa神经功能评分。术前1天，假手术组、模型组和MSSA组大鼠的Zea Longa评分均为0分，表明各组大鼠基线神经功能完整，无神经功能缺损。术后第1天起，模型组和MSSA组大鼠的Zea Longa评分逐渐升高。在术后第1天至第5天期间，这两组之间的评分差异无统计学意义（p > 0.05）。随着干预的持续，术后第7天和第10天，MSSA组的Zea Longa评分显著低于模型组（p < 0.001），表明神经功能有所改善（图1A).
图 1．运动式头针改善脑卒中后痉挛大鼠的神经功能缺损并降低肌张力。 （A）在大脑中动脉闭塞前（MCAO；第 -1 天）、MCAO 前即刻（第 0 天）以及术后第 1、3、5、7 和 10 天测得的 Zea Longa 神经功能缺损评分。（B）在相应时间点测得的改良 Ashworth 量表评分。虚线垂直线表示第 0 天的 MCAO。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。误差线代表 SD。***p < 0.001，由方括号指示的组间比较。请点击此处查看该图的放大版本。
MSSA 可减小脑梗死体积
假手术组大鼠的T2加权成像（T2WI）表现正常，全脑实质信号强度均匀，未见病理性高信号、脑梗死、形态学异常或脑室扩张（图2A）。相比之下，模型组大鼠同侧大脑半球出现明显的T2高信号，对应于缺血性梗死区域，并伴有显著的脑室扩大（图2A）。定量形态学分析显示，与模型组相比，MSSA组的脑梗死体积显著减小（p ＜ 0.001；图2B）。MSSA干预方案如图2C所示。
图2．运动式头针治疗可减少脑卒中后痉挛大鼠的脑梗死体积。 （A）假手术组、模型组和运动式头针治疗（MSSA）组在相对于前囟点1.00、0.20、−0.92和−1.88 mm处的代表性T2加权成像（T2WI）脑部图像。（B）基于T2WI的脑梗死体积定量分析。每个符号代表一只动物。（C）MSSA干预与跑台运动同步进行的照片。数据以均值±标准差（SD）表示。误差线代表标准差。***p < 0.001，与模型组比较。请点击此处查看本图的放大版本。
MSSA 减轻中风后肌肉痉挛
对于改良Ashworth量表（MAS）评分，双因素重复测量方差分析显示时间（F[2.158, 51.79] = 183.7，p < 0.001）和分组（F[2, 24] = 57.68，p < 0.001）均具有显著的主效应，且存在显著的时间×分组交互作用（F[10, 120] = 58.70，p < 0.001）。所有大鼠在术前1天及术后第1天的MAS评分均为0分，表明其肌肉张力基线正常，无痉挛表现。从术后第3天开始，模型组和MSSA组的MAS评分均逐渐升高，提示卒中后肢体痉挛状态的形成，且两组在该时间点无显著差异。从术后第5天至第10天，MSSA组的MAS评分显著低于模型组（p < 0.01 至 p < 0.001），表明MSSA可缓解卒中后痉挛状态（图1B）。
MSSA 可保护外囊白质微结构的完整性
典型的DTI参数图如图3A所示。术后第10天，与假手术组相比，模型组在外囊区域的分数各向异性比值（rFA）显著降低（p < 0.001；图3B），同时平均扩散率比值（rMD）和径向扩散率比值（rRD）显著升高（均 p < 0.001；图3C、D）。与模型组相比，MSSA处理显著提高了rFA（p < 0.001；图3B），并显著降低了rMD和rRD（均 p < 0.01；图3C、D）。各组间轴向扩散率比值（rAD）无显著差异（p > 0.05；图3E）。大鼠在DTI扫描过程中的体位以及外囊ROI的解剖位置见图3F、G。
图3．运动式头针治疗改变脑卒中后痉挛大鼠的弥散张量成像参数。 （A）假手术组、模型组和运动式头针治疗（MSSA）组在相对于前囟-1.30 mm处的代表性分数各向异性（FA）、平均扩散率（MD）、轴向扩散率（AD）和径向扩散率（RD）图谱。（B–E）分别对患侧与对侧FA（rFA）、MD（rMD）、RD（rRD）和AD（rAD）比值的定量分析。每个符号代表一只动物。（F）用于弥散张量成像（DTI）的大鼠体位照片。（G）示意图及对应的磁共振图像，显示对侧和患侧外囊感兴趣区域。数据以均值±标准差表示。误差线代表标准差。#p < 0.05，###p < 0.001，与假手术组比较；**p < 0.01，***p < 0.001，与模型组比较。请点击此处查看该图的放大版本。
MSSA 可改善外囊髓鞘的完整性
采用LFB染色法评估外囊中髓鞘的完整性。组织学结果显示，假手术组的髓鞘纤维形态完整且排列规则，而大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠的外囊区域则出现明显的髓鞘丢失和结构紊乱（图4A）。定量分析表明，模型组LFB染色的相对积分光密度（IOD）显著低于假手术组（p < 0.001；图4B）。与模型组相比，MSSA处理组的相对IOD值显著升高（p < 0.001；图4B），提示MSSA治疗可改善外囊区域的髓鞘完整性。
图 4．运动式头针治疗减轻脑卒中后痉挛大鼠外囊髓鞘损伤。 （A）假手术组、模型组和运动式头针治疗（MSSA）组大鼠脑组织Luxol 快蓝（LFB）染色的代表性全景脑切片图像，以及对侧和同侧外囊感兴趣区域（ROIs）的放大图像。全景图中的蓝色和红色框分别表示对侧和同侧感兴趣区域。放大图中的比例尺 = 50 µm。（B）同侧外囊LFB染色相对积分光密度（IOD）的定量分析，数据经对侧标准化。每个符号代表一只动物；n = 4 每组。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。误差线代表标准差。###p < 0.001，与假手术组比较；***p < 0.001，与模型组比较；△p < 0.05，表示括号所示组间比较。 请点击此处查看该图的放大版本。
MSSA 抑制脊髓 H 反射高兴奋性
典型的M波和H波记录如图所示 图 5A，电生理记录装置如图所示 图5B术后第10天，电生理评估显示，与假手术组相比，模型组的运动阈值（MT）显著升高； p < 0.001）和最大H波/最大M波振幅（H最大/最大值）比率（p < 0.001），M波潜伏期轻度延长（p < 0.05），以及H反射潜伏期的相应缩短（p < 0.05; 图5C–H）。与模型组相比，MSSA组的MT显著降低（p < 0.001）和 H最大/最大 比率（p < 0.001），以及显著升高的H反射阈值（p < 0.001; 图 5C–H). 诱发H反射所需的刺激强度无显著差异最大 以MT的倍数表示，模型组与MSSA组之间观察到差异（图 5H）。此外，当以0.3 Hz时的H/M比值进行标准化后，所有三组的H反射频率依赖性下降（FDD）均随着刺激频率的增加而逐渐减弱图 5I）。在5 Hz和10 Hz两种刺激频率下，MSSA组的H/M比值均显著低于模型组（均 p < 0.001），表明H反射FDD向生理模式部分恢复（图 5J; 表1).
图5.运动型头针治疗可降低脑卒中后痉挛大鼠的脊髓反射亢进。 （A）假手术组、模型组和运动型头针治疗（MSSA）组的M波和H波叠加波形的代表性记录。（B）电生理记录装置的照片，显示坐骨神经刺激部位、记录电极和接地电极。（C–H）分别对运动阈值（MT）、最大H波与最大M波振幅比值（Hmax/Mmax）、H波潜伏期、H反射阈值、M波潜伏期以及引出Hmax所需的刺激强度（以MT的倍数表示）进行定量分析。每个符号代表一只动物。（I）各组在0.3 Hz、5 Hz和10 Hz刺激频率下获得的H反射波形的代表性记录。（J）频率依赖性H反射抑制，以5 Hz和10 Hz时的H/M比值相对于0.3 Hz时H/M比值的归一化值表示。阴影区域表示均值的标准差（SD）。数据以均值±SD表示。误差线代表SD。#p < 0.05，###p < 0.001，与假手术组比较；***p < 0.001，与模型组比较。请点击此处查看该图的放大版本。
| 组别 | MT (mA) | Mmax (mV) | Hmax (mV) | M潜伏期 (ms) | H潜伏期 (ms) | H反射阈值 (×MT) | Hmax (×MT) | H/M比值 (0.3 Hz) | H/M比值 (5 Hz) | H/M比值 (10 Hz) |
| 假刺激组 (n = 9) | 0.808 ± 0.218 | 11.119 ± 7.802 | 2.804 ± 2.896 | 4.567 ± 0.731 | 11.311 ± 0.849 | 1.296 ± 0.251 | 1.554 ± 0.264 | 0.452 ± 0.264 | 0.304 ± 0.155 | 0.176 ± 0.137 |
| 模型组 (n = 9) | 1.855 ± 0.203### | 3.282 ± 2.040## | 2.307 ± 1.296 | 5.333 ± 0.893 | 10.456 ± 1.056 | 0.729 ± 0.299 | 1.517 ± 0.303 | 0.826 ± 0.120## | 0.741 ± 0.129### | 0.684 ± 0.131### |
| MSSA组 (n = 9) | 0.663 ± 0.236*** | 5.908 ± 2.751 | 1.497 ± 0.688 | 4.744 ± 0.590 | 10.978 ± 0.602 | 1.939 ± 0.819*** | 1.832 ± 1.557 | 0.556 ± 0.238* | 0.390 ± 0.193** | 0.142 ± 0.134*** |
表1： 脑卒中后痉挛大鼠H反射的电生理参数。 来自假手术组、模型组和动式头皮针刺（MSSA）组的电生理测量结果，包括运动阈值（MT）、最大M波幅值（Mmax）、最大H波幅值（Hmax）、M波潜伏期、H波潜伏期、以MT倍数表示的H反射阈值（×MT）、引出Hmax所需的刺激强度（以MT倍数表示，×MT），以及在0.3 Hz、5 Hz和10 Hz刺激频率下测得的H/M比值。数据以均值±标准差表示。##p ＜ 0.01 和 ###p ＜ 0.001，与假手术组比较；*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001，与模型组比较。
T2加权成像梗死体积、外囊扩散张量成像指标、电生理指数与改良Ashworth评分之间的相关性
首先分析了T2WI测量的脑梗死体积与外囊DTI参数之间的相关性。在汇总分析中，梗死体积与rFA呈显著负相关（ρ = −0.902，p < 0.001），与rMD和rRD呈正相关（ρ = 0.511，p = 0.03；ρ = 0.661，p = 0.003；图6A–D）。在亚组分析中，未观察到梗死体积与DTI参数之间存在显著相关性。随后评估了外囊DTI参数、脊髓反射兴奋性的电生理指标以及MAS评估的肌张力之间的关系。在汇总分析中，较低的rFA与较高的Hmax/Mmax比值相关（ρ = −0.895，p < 0.001），而较高的rRD与较低的H反射阈值相关（ρ = −0.504，p = 0.03；图6E,F）。此外，较高的Hmax/Mmax比值和较低的H反射阈值与较高的MAS评分相关（ρ = 0.760，p < 0.001；ρ = −0.479，p = 0.01；图6G,H）。亚组分析显示，仅在模型组中H反射阈值与MAS评分之间存在显著负相关（ρ = −0.736，p = 0.03），而在假手术组和MSSA组中未观察到显著相关性。
图6．脑梗死体积、弥散张量成像参数、H反射指标与脑卒中后痉挛大鼠肌张力之间的关联。 （A–D）基于T2加权成像（T2WI）测得的脑梗死体积与同侧相对于对侧的各向异性分数比值（rFA）、平均弥散率比值（rMD）、径向弥散率比值（rRD）和轴向弥散率比值（rAD）之间的关联。（E）rFA与最大H波/最大M波振幅比值（Hmax/Mmax）之间的关联。（F）rRD与H反射阈值之间的关联。（G）Hmax/Mmax与改良Ashworth量表（MAS）评分之间的关联。（H）H反射阈值与MAS评分之间的关联。圆圈、方形和三角形分别代表假手术组、模型组和动式头皮针刺（MSSA）组。虚线表示根据实测数据生成的线性回归拟合曲线。每个子图中均显示总体及各组特异性的Spearman相关系数（ρ）及其对应的p值。请点击此处查看该图的放大版本。
数据可用性：
本研究中生成或分析的所有数据均包含在本文及补充材料中。支持本研究结果的原始数据集见于补充表1。
补充表1：支持本研究中定量分析的原始数据集。 该工作簿包含用于所有实验组的行为学评估、T2加权成像（T2WI）梗死体积分析、扩散张量成像（DTI）指标、Luxol快蓝（LFB）染色定量分析以及H反射电生理测量的原始实验数据。请点击此处下载该文件。
讨论
从中医角度来看，卒中后痉挛（PSS）属于筋病范畴，其核心病机可概括为“本在脑损，标在肢挛”20。因此，治疗策略应兼顾原发性脑损伤与继发性外周表现21。MSSA的治疗理念强调从缺血脑组织到痉挛肢体的整体调控，治疗目标包括活血化瘀、疏通经络、舒筋解痉、缓解肌张力增高。针刺技术是针灸疗效的关键，根据疾病证候选择适宜的技术对获得良好临床疗效至关重要。MSSA是一种针对PSS的特色头针疗法，其特点是在留针期间结合患肢的主动或被动运动3。近期一项系统综述与荟萃分析表明，与传统头针或单纯康复训练相比，MSSA在减轻肌肉痉挛、改善运动功能及提升日常生活活动能力方面具有更优疗效9。值得注意的是，头针与康复训练同步实施（如MSSA所采用）的疗效优于非同步干预，这一结论已得到中等质量临床证据的支持9。MS 6是依据GB/T 21709.2-2021标准定义的一条额顶颞斜前线头针刺激线，因其解剖相关性及明确的临床效用而被选用9。该刺激线覆盖大脑初级和次级运动皮层，这些区域是下行皮质传出纤维的主要来源，可调控脑干网状结构输出并调节脊髓反射兴奋性。临床上，MS 6是PSS最常用的头针刺激线，前述荟萃分析已证实其应用频率最高，因此本研究将其作为调控运动通路的理想靶点。上述发现凸显了MSSA在PSS管理中的独特操作特征及潜在临床优势。前期基础研究进一步表明，MSSA可改善缺血半暗带的脑灌注，并调节脊髓前角运动神经元的兴奋性，为其临床应用提供了初步的机制支持10,11。
根据现代神经科学理论，卒中后痉挛（PSS）的发病机制主要归因于三个相互关联的病理过程：上脊髓下行抑制功能受损、脊髓内信号处理异常以及肌肉内在特性的改变。其中，上脊髓下行通路调控脊髓反射兴奋性的具体机制尚未完全阐明2。网状脊髓束（RST）在维持牵张反射弧平衡中起关键作用。外侧RST通过皮质-网状通路接受来自对侧前运动皮层和辅助运动区的兴奋性输入，沿脊髓背外侧索下行，对脊髓牵张反射活动发挥抑制性调控作用。相比之下，内侧RST不受对侧皮层调控，沿脊髓腹内侧索下行，促进牵张反射活动。皮质卒中会破坏皮质-网状通路，减少对延髓网状结构的兴奋性输入，导致内侧RST活动占优势。这种失衡状态导致脊髓牵张反射过度兴奋，从而表现为肢体痉挛的临床症状3。临床神经影像学研究已将PSS与前运动皮层、壳核、内囊后肢及外囊的病灶联系起来12,14,22。其中，外囊是皮质-网状-脊髓通路中的关键白质通路，作为主要的锥体外系通路，整合皮层输入，在脑干网状核团突触连接后投射至脊髓，对α运动神经元和中间神经元施加下行抑制性控制23。神经示踪和弥散张量成像（DTI）研究一致证实，外囊是大脑皮层、基底节与脑干之间的重要连接结构23,24。值得注意的是，痉挛正逐渐被认识为一种网络层面的障碍，其根源在于包括皮质脊髓束和锥体外系通路在内的多种下行运动系统之间的平衡被破坏，而非单一通路功能障碍所致。在此背景下，外囊可作为研究锥体外系在PSS中作用的代表性结构，因其受累始终与脊髓反射活动增强相关，而单纯的皮质脊髓束损伤更常表现为无力，而非显著的痉挛。因此，我们选择外囊作为主要感兴趣区（ROI），用于研究与痉挛严重程度相关的白质微结构改变。与该理论框架一致，T2加权成像（T2WI）显示假手术组未见明显脑梗死病灶，而模型组则出现显著的梗死病灶。MSSA治疗显著改善了神经功能，Zea Longa评分结果表明其对缺血性脑损伤具有神经保护作用。MSSA的梗死保护效应可能涉及多种协同机制。首先，已有研究表明MSSA可增强缺血半暗带区域的局部脑灌注10，从而为神经元存活创造更有利的微环境。此外，尽管目前关于MSSA的直接证据尚有限，但头皮针刺的机制研究提示了其他可能参与的通路，包括通过激活MATN2/WNT3a/β-catenin信号通路促进血管生成25，以及通过抑制RORγt介导的Th17细胞分化并恢复Th17/Treg平衡来减轻缺血后神经炎症26。这些发现提示，MSSA可能在血流动力学效应之外还激活了类似的神经保护机制。然而，各通路的相对贡献仍有待明确，需进一步研究加以验证。
DTI 能够实现对白质微结构的敏感定量评估，其中 FA 反映纤维完整性，RD 作为脱髓鞘的标志物，AD 反映轴突完整性23。在本研究中，选择外囊作为感兴趣区域（ROI），以评估与皮质-网状脊髓通路相关的微结构改变在卒中后痉挛（PSS）中的表现。与假手术组相比，模型大鼠表现出相对 FA 显著降低，同时相对 MD 和 RD 明显升高，提示外囊区域白质完整性受损、脑水肿及脱髓鞘。LFB 染色进一步显示明显的髓鞘丢失及白质纤维束排列紊乱，为 DTI 结果提供了组织学支持。综合神经影像学与组织学结果表明，缺血性损伤与外囊显著的微结构损害相关，而 MSSA 治疗可减轻该损害。H 反射是一种成熟的电生理指标，用于评估脊髓 α 运动神经元池的兴奋性及脑干以上下行调控功能27。Hmax/Mmax 比值反映脊髓运动神经元的整体兴奋性，而 H 反射阈值则反映由脊髓中间神经元介导的突触前抑制以及整合的脑干以上下行输入27。卒中引起的皮质-网状脊髓通路破坏会削弱下行抑制性调控，导致脊髓运动神经元兴奋性增高，表现为 Hmax/Mmax 比值升高和 H 反射阈值降低27。我们前期实验探讨了 MSSA 抗痉挛作用的分子机制，表明该疗法可能上调脊髓 KCC2 表达并恢复 GABA 能抑制功能10。基于这些脊髓分子层面的发现，本研究进一步阐明了导致脊髓反射亢进的上游脑干以上机制，即皮质-网状脊髓通路中外囊的微结构损伤与脊髓兴奋性显著升高相关。综上所述，这些结果提示 MSSA 可能促进脑干以上下行抑制通路的重建，并逆转 PSS 大鼠的脊髓反射亢进状态。
鉴于当前数据为横断面性质，所有相关性分析均应视为探索性与假设生成性，而非因果关系的证据。相关性分析用于探讨梗死负荷、外囊微观结构完整性、脊髓反射兴奋性与痉挛严重程度之间的关系。在所有动物中，较大的梗死体积与外囊内更严重的基于弥散张量成像（DTI）的微观结构破坏相关，提示原发性缺血性损伤与皮质-网状脊髓通路中的继发性白质改变之间存在关联。值得注意的是，这些总体相关性主要由组间差异驱动，而非组内个体变异所致，因为在任一单独组内均未观察到显著相关性。较高的相对各向异性分数（rFA）与较低的 Hmax/Mmax 比值相关，而较高的相对径向扩散系数（rRD）与较低的 H 反射阈值相关，这与外囊结构完整性得以保留时，下行抑制性调控更有效的观点一致。此外，较高的 Hmax/Mmax 比值和较低的 H 反射阈值均与较高的改良 Ashworth 量表（MAS）评分相关，支持电生理改变与痉挛严重程度之间的关联。亚组分析进一步揭示，总体相关性模式主要归因于组间差异。值得注意的是，H 反射阈值与 MAS 评分之间的显著负相关仅在模型组中观察到，提示在未经治疗的病理状态下，突触前抑制功能受损可能与更严重的痉挛相关。
应承认本研究存在若干局限性。首先，由于缺乏仅针刺和仅运动的对照组，无法区分这两种干预措施各自的独立作用及协同效应。未来的研究若纳入这些对照组，将有助于阐明联合干预的作用机制。第二，观察期仅限于急性期（术后第0–10天），该时间窗的选择依据是永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中肌张力增高出现的高峰期。目前尚不清楚MSSA在急性期之后是否仍具有持续的治疗效果，在慢性PSS模型中进行验证对于评估其长期转化潜力至关重要。第三，尽管改良Ashworth量表（MAS）被广泛用于评估肌张力，但其本质上具有主观性和半定量特点。为弥补这一局限性，本研究同时检测了H反射，作为评估脊髓反射兴奋性的客观电生理指标。第四，由于多模态评估技术操作复杂，样本量相对较小，未来若开展包含更多实验动物的研究，将有助于提高统计效能和结果的稳健性。最后，所有终点指标均仅在术后第10天进行评估。未来若在多个时间点开展纵向评估，将有助于更全面地理解MSSA诱导的神经可塑性变化的时间动态过程。
未来的研究可进一步探讨MSSA干预后神经发生和再髓鞘化的机制。由于DTI无法直接可视化神经元再生，因此可采用神经示踪和免疫组织化学等互补方法，以更深入地表征神经可塑性及再髓鞘化过程。从转化医学的角度来看，外囊的DTI指标（特别是FA和RD）可能有助于根据皮质-网状脊髓通路损伤的严重程度对脑卒中患者进行分层，并识别最有可能从MSSA治疗中获益的患者。这种基于生物标志物的方法可能有助于在未来临床试验中优化患者筛选和治疗分层，但其临床实用性仍需在前瞻性脑卒中队列中进一步验证。综上所述，本研究采用整合研究框架，结合基于T2WI的梗死评估、白质微结构的DTI分析、H反射电生理检测以及LFB组织学分析，系统探讨了MSSA治疗卒中后痉挛（PSS）相关的神经机制。研究结果表明，MSSA与脑梗死体积减小、外囊微结构完整性的保留以及皮质-网状脊髓通路下行抑制功能的改善相关。这些神经结构与功能的改变伴随着脊髓反射兴奋性的正常化以及肌张力的降低。总体而言，本研究为MSSA在卒中后痉挛管理中的潜在转化应用提供了机制性见解和临床前证据。
披露
利益冲突：
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金（项目编号：82405579）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α水合氯醛 | GoldBio | C-118-250 | H反射记录用麻醉剂 |
| 无水乙醇 | 北京同光精细化工有限公司 | VS104021-500 mL | 组织学试剂 |
| 针灸针（0.25 × 13 mm | 北京中研太和针灸针有限公司 | NA | 一次性无菌头皮针 |
| 氨苄青霉素 | 北京瑞达恒慧科技发展有限公司 | HD-3018-500g | 术后感染预防用抗生素 |
| 生物机能实验系统（BL420N） | 成都泰盟科技有限公司 | NA | 电生理记录系统 |
| 扩散张量成像分析软件（ParaVision 360） | Bruker | NA | MRI数据采集与DTI重建 |
| 环保型脱蜡与透明化溶液 | Servicebio | G1128-500ML | 组织学试剂 |
| 全自动轮转式切片机 | Leica Microsystems | RM2255 | 组织切片 |
| 加热垫 | 苏州彩阳电加热技术有限公司 | TT180×150-1XD | 术后体温维持 |
| ImageJ 6.0 | 美国国立卫生研究院 | NA | 定量图像分析 |
| 异氟烷 | 北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司 | I8000-25g | 吸入麻醉剂 |
| ITK-SNAP 4.4.0 | 宾夕法尼亚大学 | NA | 脑梗死分割 |
| 焦油蓝快速染液 | Servicebio | G1030-100ML | 髓鞘染色 |
| 单丝尼龙缝合线（0.36 ± 0.02 mm | 北京辛诺科技有限公司 | NA | MCAO 诱导 |
| 多聚甲醛（PBS 中 4%） | Servicebio | TBAB0102 | 组织固定 |
| PharmaScan 7.0 T 磁共振成像仪 | 布鲁克 | NA | MRI数据采集 |
| SPSS Statistics 20.0 | IBM | NA | 统计分析 |
| 斯普拉格–Dawley大鼠（SPF级，雄性） | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | NA | 实验动物 |
| 温控水浴系统 | 上海智信实验仪器技术有限公司 | ZX-5A | 磁共振成像过程中的温度维持 |
| 啮齿类动物跑步机 | 聪明 | TreadScan | 习服期间的运动训练与MSSA |
参考文献
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