左归丸调节去卵巢大鼠成骨细胞-破骨细胞偶联：一项三因素三水平析因研究

摘要

本研究采用三乘三因子设计，评估左归丸对去卵巢大鼠绝经后骨质疏松的影响。结果支持滋阴与助阳组分在骨代谢及其相关EphB4/ephrinB2通路标志物方面具有协同作用，但其作用机制的证据仍为关联性，尚未确立因果关系。

摘要

绝经后骨质疏松症由雌激素缺乏引起的骨形成与骨吸收失耦联所致。本研究在去卵巢大鼠模型中量化了左归丸滋阴类子方制剂的独立作用及交互作用，并探讨其与EphB4/ephrinB2/RhoA/碱性磷酸酶通路的关联。根据ARRIVE 2.0指南，将130只无特定病原体级雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为13组（每组n=10），其中包括采用3×3析因设计的9个实验组。研究终点包括P1NP、CTX-1、通过双能X线吸收测定法（DXA）测量的股骨骨密度、骨小梁组织学以及通过逆转录定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法测定的信使核糖核酸和蛋白质表达水平。与模型组相比，全方组（I2A2）表现出更高的P1NP水平、更低的CTX-1水平以及更高的骨密度。析因分析发现P1NP与骨密度之间存在阴阳交互作用，提示药理学协同效应。分子水平变化表现为EphB4/ephrinB2/ALP表达上调及RhoA表达下调。这些结果支持左归丸治疗与改善骨表型及调控通路标志物之间的关联；但通路的因果依赖性尚需通过抑制剂实验、基因敲低和共培养实验进一步验证。

引言

绝经后骨质疏松症（PMOP）影响大量女性，其特征是雌激素缺乏导致骨形成与骨吸收之间的平衡被破坏^1,2。EphB4/ephrinB2受体-配体系统介导成骨细胞与破骨细胞之间的通讯；EphB4信号通路可促进成骨细胞分化及碱性磷酸酶（ALP）活性，而ephrinB2逆向信号可通过RhoA相关机制抑制破骨细胞生成^3,4。在雌激素缺乏的骨组织中，偶联作用减弱，这为评估同时影响骨重建过程中两类细胞活动的干预措施提供了机制依据。

目前的骨质疏松症治疗手段，包括抗骨吸收药物和促骨形成药物，虽可降低骨折风险，但在长期使用过程中可能受到依从性、成本、禁忌证、反弹效应或不良事件的限制⁵。因此，能够促进骨形成同时限制过度骨吸收的候选治疗方法仍具有重要的科学意义。

左归丸（ZGP；Zuo Gui Wan）是中医用于治疗肾精亏虚的经典复方制剂，肾精亏虚是一种与骨质薄弱相关的理论证型。滋阴成分包括Rehmannia glutinosa（熟地黄，24 g）、Dioscorea opposita（山药，12 g）、Cornus officinalis（山茱萸，12 g）、Lycium barbarum（枸杞子，12 g）、Chinemys reevesii龟甲胶（龟板胶，12 g）和Cyathula officinalis（川牛膝，9 g）。助阳成分包括Cuscuta australis（菟丝子，12 g）和Cervus elaphus鹿角胶（鹿角胶，12 g）。根据中医经典理论，“阴中求阳”原则认为，助阳药物可增强滋阴基础的疗效，而非仅作为简单的独立添加成分发挥作用。临床证据和临床前研究已报道左归丸或含左归丸干预措施具有抗骨质疏松活性，包括对骨密度（BMD）、成骨作用及药代动力学行为的影响^6,7,8,9,10。

本研究的创新之处在于对去卵巢（OVX）大鼠采用正式的三乘三因子设计，分离滋阴与助阳组分，同时评估骨表型及EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP通路标志物的变化。该设计相较于仅使用完整处方或单一对照的研究，能更直接地验证方剂配伍理论，同时需认识到通路标志物的变化仍仅为关联性结果，除非通过机制性阻断或沉默实验加以验证¹¹。

方案

本研究的所有实验程序均经内蒙古医科大学实验动物福利与使用委员会批准（批准号：YKD202404105），并遵循ARRIVE 2.0指南¹²进行。

研究设计

研究在内蒙古医科大学动物实验平台进行。采用3×3全因子设计，包含两个因素：滋阴基础方（I；三个剂量水平：0、27、54 g生药当量）和助阳方（A；三个剂量水平：0、8、16 g生药当量），共形成九个因子组，另设四个对照组。因子设计见表1。I2A2代表临床等效剂量下的完整滋甘平调方。剂量换算采用体表面积法（大鼠：人换算系数 = 6.25）¹³。

动物、随机化与盲法

采用计算机生成的随机数字表将130只无特定病原体的雌性Sprague-Dawley大鼠（6月龄，220–250 g）进行分组。分组编码由未参与结局评估的研究人员放入顺序密封的信封中。大鼠每3–4只饲养于通风笼具中，环境条件为12小时光照/12小时黑暗循环，温度22 ± 2 ^oC，相对湿度50–60%，自由饮水，饲喂经确认钙和磷含量的标准啮齿类动物饲料，并提供笼内活动和环境丰富化措施。分子检测、组织学评分、图像定量和密度测定均由对分组情况设盲的研究人员完成。样本量通过预先的效能分析确定，每组n = 10。

OVX 模型建立与药物处理

在精密蒸发器输送的吸入式异氟烷麻醉下进行双侧卵巢切除术（OVX）。麻醉诱导采用3–4%异氟烷氧气混合气体，维持麻醉浓度为1.5–2.5%，通过鼻罩给药。通过足底回缩反射和眼睑反射消失且呼吸稳定来确认麻醉深度充分。通过术后第5天无阴道动情周期以及术后12周骨密度（BMD）降低来评估OVX手术成功。模型验证后，进行为期8周的灌胃治疗（1 mL/100 g/天）。汤剂制备采用连续水提法：以10倍体积水在沸腾条件下（100 °C，回流）提取2小时，随后以8倍体积水提取1.5小时，经四层医用纱布过滤后，在减压条件下浓缩至每毫升含0.968 g生药。浓缩提取物于4 °C保存，并在制备后7天内使用。阳性对照组给予骨素康颗粒（1.8 g/kg/天）和己烯雌酚（0.04 mg/kg/天）。实验终点时，大鼠以5%异氟烷深度麻醉至足底反射和角膜反射消失，随后放血处死并实施颈椎脱臼。通过心跳和呼吸停止确认死亡。尸体及组织作为生物废弃物丢弃；化学残留物作为危险废物处理；针头或刀片放入经批准的锐器容器中。

结局指标

采用双抗体夹心 ELISA 法（Jiyinmei）检测血清 P1NP 和 CTX-1 水平¹⁴。股骨骨密度（BMD）通过双能 X 线吸收测定法（DXA）进行定量。骨小梁组织学通过苏木精-伊红染色（200 倍放大）进行评估。基因表达水平采用 RT-qPCR 检测，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，使用 2^-ΔΔCt 法进行归一化分析。蛋白表达水平通过 Western 印迹结合 ImageJ 软件定量分析（见材料表）。分子量观测值及抗体目录信息详见补充表 1。引物序列如下：EphB4 上游/下游，5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'；ephrinB2，5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'；RhoA，5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'；ALP，5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'；GAPDH，5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

统计学分析

在进行参数分析之前，使用Shapiro-Wilk检验评估正态性，使用Levene检验评估方差齐性。数据以均值±标准差（SD）表示，所有定量图中的误差线均代表标准差。对九个因子单元采用双因素方差分析（ANOVA），以估计主效应及I与A的交互作用，效应量采用偏η²（ηp²）。在全部13个组之间进行成对比较时，采用单因素方差分析（ANOVA）并进行Bonferroni校正。统计分析在GraphPad Prism中完成。显著性符号统一定义如下：*、**、***、**** 分别表示与模型组相比 p <0.05、p <0.01、p <0.001、p <0.0001；#、##、###、#### 表示与完整配方ZGP相比的相同显著性阈值。

结果

通过阴道细胞学进行模型验证

所有卵巢切除动物的手术成功均得到确认，表现为术后5天内动情周期消失（图1A），而假手术动物则维持4天的动情周期（图1B）。12周时，DXA显示OVX模型组股骨骨密度显著低于假手术对照组（0.214 ± 0.020 vs. 0.281 ± 0.019 mg/cm³；Bonferroni校正后 p < 0.001），表明在治疗前已成功建立OVX诱导的骨丢失模型。

骨密度

在所有析因子配方中，完整的ZGP配方（I2A2）显示出最高的骨矿物质密度（BMD）恢复水平，且在统计学上与两个阳性对照组相当（表2，图2）。所有析因子配方均...

讨论

析因交互项支持ZGP中滋阴与助阳组分之间存在非相加性关系。该结果与传统“阴中求阳”原则一致，即助阳组分可激活或增强滋阴基础方的作用¹⁵。此发现应被理解为制剂水平的药理学协同效应，但并未鉴定出产生该效应的单个活性成分。

EphB4 和 ephrinB2 是成骨细胞-破骨细胞偶联的生物学上合理的介导分子^3,4，但目前的证据仅为相关性。观察到 EphB4、ephrinB2 和 ALP 随 RhoA 下调而升高，这与偶联功能改善相一致，但尚不能证明该通路对 ZGP 的作用是必要或充分的。需要通过通路抑制剂、抗 EphB4 或阻断 ephrinB2 的方法、RhoA/ROCK 调控¹⁶、基因敲低以及成骨细胞-破骨细胞共培养实验来验证其因果依赖关系。

临床转化需要谨慎。大鼠与人等效剂量的换算可支持初步的剂量推算，但人体给药还需进...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% 氨水	N/A	N/A	苏木精染色分化后的蓝化溶液。
1% 盐酸酒精	N/A	N/A	苏木精染色的分化液。
2x qPCR Mix	N/A	N/A	定量 PCR 预混液。单次反应体系体积：12.5 uL。
4% 多聚甲醛溶液	N/A	N/A	用于左股骨和胫骨样本的组织学分析固定。
5x 上样缓冲液	N/A	N/A	电泳前样本变性。
ALP 一抗	Affinity Biosciences	N/A	Western blot 抗体。原始稀释比例：1:2000。JoVE 要求提供 RRID 和批号。
ALP 引物对	N/A	N/A	ALP mRNA 通过 qRT-PCR 检测，但原始引物表格未提供 ALP 引物序列。需作者确认。
生物素标记抗体试剂	随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei	试剂盒组分	ELISA 实验中加入样本孔。
马鹿角胶，鹿角胶	北京同仁堂	N/A	补阳成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。将胶烊化后加入煎剂。
中华鳖甲胶，龟板胶	北京同仁堂	N/A	滋阴成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。将胶烊化后加入煎剂。
氯仿	N/A	N/A	RNA 提取过程中的相分离。
冷却台	Leica	1150	切片流程中的冷冻或冷却支持装置。
山茱萸，山茱萸	北京同仁堂	N/A	滋阴成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。
南方菟丝子，菟丝子	北京同仁堂	N/A	补阳成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。
川牛膝，川牛膝	北京同仁堂	N/A	滋阴成分。原始完整处方剂量：9 g，比例 3。
DEPC 处理的 PBS	N/A	N/A	液氮速冻前对 L4 至 L5 腰椎进行冲洗。
己烯雌酚	N/A	N/A	西药阳性对照。原始剂量：0.04 mg/kg/天，1 mL/100 g/天。原始文献中存在中文命名不一致问题，应统一为“己烯雌酚”。
山药，怀山药	北京同仁堂	N/A	滋阴成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。
dNTP 混合物	N/A	N/A	逆转录反应中包含。
ECL 化学发光试剂	N/A	N/A	Western blot 检测试剂。
ELISA 显色试剂 A	随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei	试剂盒组分	ELISA 显色试剂。
ELISA 显色试剂 B	随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei	试剂盒组分	ELISA 显色试剂。
ELISA 终止液	随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei	试剂盒组分	用于终止 ELISA 显色反应。
酶标 ELISA 试剂	随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei	试剂盒组分	加入 ELISA 非空白孔中。
EphB4 一抗	Proteintech	N/A	Western blot 抗体。原始稀释比例：1:2000。JoVE 要求提供 RRID 和批号。
EphB4 引物对	N/A	PCR 产物 232 bp	上游引物 CTAGACTCTTTCCTGCGGCT；下游引物 GGGAACTTGTGTAGGTGGGA。原始表格中“Rat RphB4”应为“Rat EphB4”，属笔误。
ephrinB2 一抗	Affinity Biosciences	N/A	Western blot 抗体。原始稀释比例：1:2000。JoVE 要求提供 RRID 和批号。
ephrinB2 引物对	N/A	PCR 产物 172 bp	上游引物 CGGACAAGGCCTGGTACTAT；下游引物 ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT。
乙醇，无水及梯度浓度 95%、85%、75%	N/A	N/A	苏木精-伊红染色过程中的梯度脱水与复水。
雌性 Sprague-Dawley 大鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司	原始文献未提供动物合格证及许可证号	无特定病原体级，6 月龄，健康未孕雌性。中文原文体重为 230 至 270 g；早期英文草稿为 220 至 250 g。提交前需确认最终体重范围。
GAPDH 一抗	Servicebio	N/A	上样对照抗体。原始稀释比例：1:2000。JoVE 要求提供 RRID 和批号。
GAPDH 引物对	N/A	PCR 产物 253 bp	上游引物 ACAGCAACAGGGTGGTGGAC；下游引物 TTTGAGGGTGCAGCGAACTT。
GraphPad Prism 软件	GraphPad Software	版本 9.4.1；RRID:SCR_002798	统计分析与作图。输出文件中应保留正态性检验、方差齐性、ANOVA、Bonferroni 校正及效应量。
骨疏康颗粒	辽宁沃华康辰药业有限公司	N/A	中药阳性对照。原始剂量：1.8 g/kg/天 或 0.5 mL/100 g/天。
苏木精染色液	珠海贝索生物技术有限公司	N/A	组织学染色。原始操作使用 5 分钟苏木精染色。
高速微量离心机	N/A	TG16W	用于血清和核酸实验的离心。
Hologic 双能 X 射线吸收仪	Hologic	N/A	骨密度分析。原始文献报告了股骨的体内和体外扫描。
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	RRID:SCR_003070	Western blot 条带的密度定量分析。原始文献未提供版本号。
电磁炉	美的	N/A	列于中文原始仪器表中。
异氟烷	N/A	N/A	双侧卵巢切除术和 DXA 定位的麻醉剂。修订后的方案应明确诱导、维持、给药途径及麻醉深度标准。
异丙醇	N/A	N/A	RNA 提取过程中的沉淀剂。
液氮	N/A	N/A	腰椎样本的速冻处理。
枸杞子，枸杞子	北京同仁堂	N/A	滋阴成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。
酶标仪	N/A	AMR-100	ELISA 在 450 nm 处检测吸光度。
洗板机	N/A	APW-200	ELISA 板的洗涤步骤。
MMLV 逆转录酶	N/A	N/A	逆转录酶。
中性封片胶	国药集团	N/A	苏木精-伊红染色切片的封片介质。
生理盐水	N/A	N/A	空白对照组、假手术组和模型组的灌胃溶媒。
Oligo(dT)18 引物	N/A	N/A	用于逆转录。
青霉素	N/A	N/A	术后感染预防。原始剂量：20,000 U/kg 肌内注射，连续 3 天。
高压锅	新飞	N/A	列于中文原始仪器表中。
蛋白酶抑制剂	N/A	N/A	蛋白提取过程中添加。
蛋白裂解缓冲液	N/A	N/A	用于骨组织蛋白提取以进行 Western blot。
PVDF 膜	N/A	N/A	经甲醇活化的 Western blot 转膜膜。
qRT-PCR 仪	N/A	N/A	用于 EphB4、ephrinB2、RhoA、ALP 和 GAPDH 的定量逆转录 PCR。
大鼠 CTX-1 ELISA 试剂盒	Jiyinmei	JYM0026Ra	用于血清 I 型胶原 C 端肽的夹心 ELISA。检测波长 450 nm。
大鼠 P1NP ELISA 试剂盒	Jiyinmei	JYM0030Ra	用于血清 I 型前胶原 N 端前肽的夹心 ELISA。检测波长 450 nm。
熟地黄，熟地黄	北京同仁堂	N/A	滋阴成分。原始完整处方剂量：24 g，比例 8。
RhoA 一抗	Proteintech	N/A	Western blot 抗体。原始稀释比例：1:2000。JoVE 要求提供 RRID 和批号。
RhoA 引物对	N/A	PCR 产物 177 bp	上游引物 GTTTATGTGCCCACGGTGTT；下游引物 ACTATCAGGGCTGTCGATGG。术语已从 RHoA 统一为 RhoA。
RNase 抑制剂	N/A	N/A	包含在逆转录反应中。
无 RNase 水	N/A	N/A	RNA 干燥后溶解用。
旋转式切片机	Leica	2245	组织学切片。
Western blot 二抗	N/A	N/A	原始稀释比例：1:15000。JoVE 要求提供宿主反应性和 RRID。
5% 脱脂奶粉	N/A	N/A	Western blot 封闭试剂，室温封闭 2 小时。
载玻片展片与烘片机	金华亿迪	N/A	组织学载玻片制备。
3% 戊巴比妥钠	N/A	N/A	中文原始文献中用于腹主动脉采血前的终末麻醉。最终安乐死程序及确认方法需核实。
标准品稀释液	随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei	试剂盒组分	ELISA 实验中用于标准品的系列稀释。
TBST 缓冲液	N/A	N/A	Western blot 洗涤缓冲液。
恒温振荡培养箱	上海一恒科学仪器有限公司	N/A	实验室培养与振荡。
TRIzol 试剂	N/A	N/A	从 100 mg 骨组织中提取 RNA。
正置显微镜	Leica	DM1000	苏木精-伊红组织学图像采集，放大倍数 200x。
水套式恒温培养箱	N/A	GNP-9080	实验步骤中的恒温培养。
水溶性伊红染色液	珠海贝索生物技术有限公司	N/A	组织学复染剂。原始操作使用 3 分钟伊红染色。
Western blot 电泳系统	N/A	N/A	蛋白分离。原始电泳条件：初始 80 V，随后 120 V。
Western blot 成像系统	N/A	N/A	化学发光膜成像。提交时需提供未裁剪的完整膜图像。
Western blot 转膜系统	N/A	N/A	蛋白转移至 PVDF 膜。原始转膜条件：400 mA，90 分钟，冰浴。
二甲苯	N/A	N/A	组织学中的脱蜡与透明处理。
左归丸组方药材	北京同仁堂	N/A	八味药材配方：熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、中华鳖甲胶、川牛膝、南方菟丝子和马鹿角胶。