本研究采用三乘三因子设计，评估左归丸对去卵巢大鼠绝经后骨质疏松的影响。结果支持滋阴与助阳组分在骨代谢及其相关EphB4/ephrinB2通路标志物方面具有协同作用，但其作用机制的证据仍为关联性，尚未确立因果关系。
研究文章
左归丸调节去卵巢大鼠成骨细胞-破骨细胞偶联：一项三因素三水平析因研究
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2026年9月11日
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摘要
摘要
绝经后骨质疏松症由雌激素缺乏引起的骨形成与骨吸收失耦联所致。本研究在去卵巢大鼠模型中量化了左归丸滋阴类子方制剂的独立作用及交互作用，并探讨其与EphB4/ephrinB2/RhoA/碱性磷酸酶通路的关联。根据ARRIVE 2.0指南，将130只无特定病原体级雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为13组（每组n=10），其中包括采用3×3析因设计的9个实验组。研究终点包括P1NP、CTX-1、通过双能X线吸收测定法（DXA）测量的股骨骨密度、骨小梁组织学以及通过逆转录定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法测定的信使核糖核酸和蛋白质表达水平。与模型组相比，全方组（I2A2）表现出更高的P1NP水平、更低的CTX-1水平以及更高的骨密度。析因分析发现P1NP与骨密度之间存在阴阳交互作用，提示药理学协同效应。分子水平变化表现为EphB4/ephrinB2/ALP表达上调及RhoA表达下调。这些结果支持左归丸治疗与改善骨表型及调控通路标志物之间的关联；但通路的因果依赖性尚需通过抑制剂实验、基因敲低和共培养实验进一步验证。
引言
绝经后骨质疏松症（PMOP）影响大量女性，其特征是雌激素缺乏导致骨形成与骨吸收之间的平衡被破坏1,2。EphB4/ephrinB2受体-配体系统介导成骨细胞与破骨细胞之间的通讯；EphB4信号通路可促进成骨细胞分化及碱性磷酸酶（ALP）活性，而ephrinB2逆向信号可通过RhoA相关机制抑制破骨细胞生成3,4。在雌激素缺乏的骨组织中，偶联作用减弱，这为评估同时影响骨重建过程中两类细胞活动的干预措施提供了机制依据。
目前的骨质疏松症治疗手段，包括抗骨吸收药物和促骨形成药物，虽可降低骨折风险，但在长期使用过程中可能受到依从性、成本、禁忌证、反弹效应或不良事件的限制5。因此，能够促进骨形成同时限制过度骨吸收的候选治疗方法仍具有重要的科学意义。
左归丸（ZGP；Zuo Gui Wan）是中医用于治疗肾精亏虚的经典复方制剂，肾精亏虚是一种与骨质薄弱相关的理论证型。滋阴成分包括Rehmannia glutinosa（熟地黄，24 g）、Dioscorea opposita（山药，12 g）、Cornus officinalis（山茱萸，12 g）、Lycium barbarum（枸杞子，12 g）、Chinemys reevesii龟甲胶（龟板胶，12 g）和Cyathula officinalis（川牛膝，9 g）。助阳成分包括Cuscuta australis（菟丝子，12 g）和Cervus elaphus鹿角胶（鹿角胶，12 g）。根据中医经典理论，“阴中求阳”原则认为，助阳药物可增强滋阴基础的疗效，而非仅作为简单的独立添加成分发挥作用。临床证据和临床前研究已报道左归丸或含左归丸干预措施具有抗骨质疏松活性，包括对骨密度（BMD）、成骨作用及药代动力学行为的影响6,7,8,9,10。
本研究的创新之处在于对去卵巢（OVX）大鼠采用正式的三乘三因子设计，分离滋阴与助阳组分，同时评估骨表型及EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP通路标志物的变化。该设计相较于仅使用完整处方或单一对照的研究，能更直接地验证方剂配伍理论，同时需认识到通路标志物的变化仍仅为关联性结果，除非通过机制性阻断或沉默实验加以验证11。
方案
本研究的所有实验程序均经内蒙古医科大学实验动物福利与使用委员会批准（批准号：YKD202404105），并遵循ARRIVE 2.0指南12进行。
研究设计
研究在内蒙古医科大学动物实验平台进行。采用3×3全因子设计，包含两个因素：滋阴基础方（I；三个剂量水平：0、27、54 g生药当量）和助阳方（A；三个剂量水平：0、8、16 g生药当量），共形成九个因子组，另设四个对照组。因子设计见表1。I2A2代表临床等效剂量下的完整滋甘平调方。剂量换算采用体表面积法（大鼠：人换算系数 = 6.25）13。
动物、随机化与盲法
采用计算机生成的随机数字表将130只无特定病原体的雌性Sprague-Dawley大鼠（6月龄，220–250 g）进行分组。分组编码由未参与结局评估的研究人员放入顺序密封的信封中。大鼠每3–4只饲养于通风笼具中，环境条件为12小时光照/12小时黑暗循环，温度22 ± 2 oC，相对湿度50–60%，自由饮水，饲喂经确认钙和磷含量的标准啮齿类动物饲料，并提供笼内活动和环境丰富化措施。分子检测、组织学评分、图像定量和密度测定均由对分组情况设盲的研究人员完成。样本量通过预先的效能分析确定，每组n = 10。
OVX 模型建立与药物处理
在精密蒸发器输送的吸入式异氟烷麻醉下进行双侧卵巢切除术（OVX）。麻醉诱导采用3–4%异氟烷氧气混合气体，维持麻醉浓度为1.5–2.5%，通过鼻罩给药。通过足底回缩反射和眼睑反射消失且呼吸稳定来确认麻醉深度充分。通过术后第5天无阴道动情周期以及术后12周骨密度（BMD）降低来评估OVX手术成功。模型验证后，进行为期8周的灌胃治疗（1 mL/100 g/天）。汤剂制备采用连续水提法：以10倍体积水在沸腾条件下（100 °C，回流）提取2小时，随后以8倍体积水提取1.5小时，经四层医用纱布过滤后，在减压条件下浓缩至每毫升含0.968 g生药。浓缩提取物于4 °C保存，并在制备后7天内使用。阳性对照组给予骨素康颗粒（1.8 g/kg/天）和己烯雌酚（0.04 mg/kg/天）。实验终点时，大鼠以5%异氟烷深度麻醉至足底反射和角膜反射消失，随后放血处死并实施颈椎脱臼。通过心跳和呼吸停止确认死亡。尸体及组织作为生物废弃物丢弃；化学残留物作为危险废物处理；针头或刀片放入经批准的锐器容器中。
结局指标
采用双抗体夹心 ELISA 法（Jiyinmei）检测血清 P1NP 和 CTX-1 水平14。股骨骨密度（BMD）通过双能 X 线吸收测定法（DXA）进行定量。骨小梁组织学通过苏木精-伊红染色（200 倍放大）进行评估。基因表达水平采用 RT-qPCR 检测，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，使用 2-ΔΔCt 法进行归一化分析。蛋白表达水平通过 Western 印迹结合 ImageJ 软件定量分析（见材料表）。分子量观测值及抗体目录信息详见补充表 1。引物序列如下：EphB4 上游/下游，5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'；ephrinB2，5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'；RhoA，5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'；ALP，5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'；GAPDH，5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。
统计学分析
在进行参数分析之前，使用Shapiro-Wilk检验评估正态性，使用Levene检验评估方差齐性。数据以均值±标准差（SD）表示，所有定量图中的误差线均代表标准差。对九个因子单元采用双因素方差分析（ANOVA），以估计主效应及I与A的交互作用，效应量采用偏η²（ηp2）。在全部13个组之间进行成对比较时，采用单因素方差分析（ANOVA）并进行Bonferroni校正。统计分析在GraphPad Prism中完成。显著性符号统一定义如下：*、**、***、**** 分别表示与模型组相比 p <0.05、p <0.01、p <0.001、p <0.0001；#、##、###、#### 表示与完整配方ZGP相比的相同显著性阈值。
结果
通过阴道细胞学进行模型验证
所有卵巢切除动物的手术成功均得到确认，表现为术后5天内动情周期消失（图1A），而假手术动物则维持4天的动情周期（图1B）。12周时，DXA显示OVX模型组股骨骨密度显著低于假手术对照组（0.214 ± 0.020 vs. 0.281 ± 0.019 mg/cm3；Bonferroni校正后 p < 0.001），表明在治疗前已成功建立OVX诱导的骨丢失模型。
骨密度
在所有析因子配方中，完整的ZGP配方（I2A2）显示出最高的骨矿物质密度（BMD）恢复水平，且在统计学上与两个阳性对照组相当（表2，图2）。所有析因子配方均较模型组提高了BMD。单独高滋阴（I3A1：0.253 mg/cm3）或单独高助阳（I1A3：0.243 mg/cm3）的BMD仍低于完整的ZGP配方（I2A2：0.307 mg/cm3），提示二者存在相互作用，而非单纯的剂量效应。
血清骨转换标志物
与模型组相比，全方ZGP可使P1NP升高（+51%；95% CI：210.3–327.5 pg/mL；p < 0.05），CTX-1降低（-36%；95% CI：12.4–28.7 pg/mL；p < 0.05），且能显著改善骨密度和骨小梁结构。 <0.0001）和CTX-1降低（-16%；p <0.01），表明骨形成-骨吸收平衡得到改善（图3A，B）。高剂量单药治疗组在某些比较中产生了更高的绝对P1NP值，但因子设计模式支持优化的联合活性，而非单一治疗组的最大剂量反应。完整的组水平数据见于 表3.
析因方差分析与协同作用
对九个因子单元进行双因素方差分析，发现滋阴因子和补阳因子的主效应均具有显著性，并且在主要终点指标中存在显著的I与A交互作用项（表4）。P1NP的交互效应（ηp2 = 0.74）表明，在这些实验条件下，补阳成分增强了滋阴成分的作用活性。
骨密度（模型验证）
股骨骨密度在模型（OVX）组中低于空白组和假手术组，表明在治疗前已成功诱导出OVX骨丢失表型，如图4所示。
EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP 表达
RT-qPCR 分析采用每组生物学样本进行技术重复三次的反应，Western 印迹密度测定则在独立的生物学裂解物上进行（图5和图6）。与模型组相比，全方剂 ZGP 组 EphB4 水平更高（0.498 ± 0.009 vs. 0.048 ± 0.002；p < 0.0001），ephrinB2 水平更高（0.411 ± 0.036 vs. 0.048 ± 0.003；p < 0.0001），ALP 水平更高（0.842 ± 0.019 vs. 0.090 ± 0.003；p < 0.0001），而 RhoA 水平更低（1.658 ± 0.028 vs. 7.332 ± 0.430；p < 0.0001）。这些分子结果应解释为通路标志物的关联性，而非因果介导作用的证据。
数据可用性
用于生成本研究结果的原始数据文件已作为本文章的补充编码文件提供
图1．卵巢切除术后验证动情周期的代表性阴道细胞学图像（苏木精和伊红染色，200倍放大）。(A) 卵巢切除大鼠的代表性阴道涂片，显示持续的非周期性细胞学特征。 (B) 假手术大鼠的代表性阴道涂片，显示正常的动情周期变化。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。所有组别的股骨骨密度（BMD）。 误差线表示标准差（SD）。统计学符号表示与模型组或完整配方ZGP组的Bonferroni校正后比较，具体定义见“统计分析”部分。请点击此处查看该图的放大版本。
图3．血清骨转换标志物。（A）P1NP，一种骨形成标志物。（B）CTX-1，一种骨吸收标志物。误差线表示标准差（SD）。统计学符号表示相对于模型组或全配方ZGP组经Bonferroni校正后的比较结果。请点击此处查看该图的放大版本
图4. 治疗前确认OVX诱导骨丢失的股骨骨密度。 柱状图显示在治疗前模型验证时间点，空白组（未切除卵巢、未治疗）、假手术组和模型组（OVX）之间的股骨骨密度（mg/cm3）比较。柱形表示均值 ± 标准差（n = 10/组）。*** = 与空白组及假手术组相比，p < 0.001（采用Bonferroni校正的单因素方差分析）。请点击此处查看该图的放大版本。
图5．相对mRNA基因表达水平。采用2^-ΔΔCt法，以GAPDH为内参基因，检测以下基因的表达水平：（A）EphB4、（B）ephrinB2、（C）RhoA、（D）ALP。每个生物学样本均进行技术重复三次的qPCR检测。误差线表示标准差（SD）。统计学符号表示经Bonferroni校正的多重比较结果。请点击此处查看该图的放大版本。
图6．Western blot 蛋白表达分析。 各图显示来自独立生物学样本的 EphB4、ephrinB2、RhoA、ALP 及 GAPDH 上样对照的代表性免疫印迹结果。使用 ImageJ 对条带进行密度分析，并以 GAPDH 为参照进行归一化处理。检测到的分子量分别为：EphB4，110 kDa；ephrinB2，36 kDa；RhoA，22 kDa；ALP，39 kDa；GAPDH，37 kDa（见补充表1）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 滋阴因子（I） | ||||
| I₁ (0 g) | I₂ (27 g) | I₃ (54 g) | ||
| 补阳因子（A) | A₁ (0 g) | I₁A₁ （模型） | I₂A₁ (尹) | I₃A₁ （Hi-Yin） |
| A₂ (8 g) | I₁A₂ (杨) | I₂A₂ (ZGP†) | I₃A₂ （Hi-Yin+Yang） | |
| A₃ (16 g) | I₁A₃ （Hi-Yang） | I₂A₃ (Yin+Hi-Yang) | I₃A₃ （全高清） | |
表1： 三乘三因子设计及实验组 该表格列出了13个实验组，采用养阴（I）与助阳（A）剂量水平的3×3因子设计，并包含4个对照组。 †I₂A₂ = 临床等效剂量的完整左归丸配方。剂量换算采用体表面积法（大鼠 : 人 = 6.25）。
| 组别 | 析因单元 | 骨密度（mg/cm³，x̄ ± SD） | 与模型组比较 |
| 空白对照 | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| 假手术组 | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| 模型组（OVX） | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| 补阳组 | I₁A₂ | 0.258 ± 0.011 | ** |
| 高剂量补阳组 | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| 滋阴组 | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| 高剂量滋阴组 | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| 滋阴+高补阳 | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| 高滋阴+补阳 | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| 全高剂量组 | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| ZGP全方组 | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| 中药阳性对照组 | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| 西药对照组 | — | 0.307 ± 0.009 | **** |
表2： 各组股骨骨密度（n=10/组，均值 ± 标准差）。 * = p <0.05，** = p <0.01，*** = p<0.001，**** = p<0.0001，与模型组比较（经Bonferroni校正）。
| 组别 | 细胞 | P1NP (pg/mL, x̄ ± SD) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± SD) |
| 空白对照 | — | 1388.8 ± 29.7****#### | 33.4 ± 6.8****#### |
| 假手术组 | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| 模型组 (OVX) | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| 补阳组 | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| 高剂量补阳组 | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| 滋阴组 | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 88.2 ± 7.6** |
| 高剂量滋阴组 | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| 滋阴+高补阳 | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| 高滋阴+补阳 | I₃A₂ | 990.2 ± 116.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| 全高剂量组 | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| ZGP全方组 | I₂A₂ | 794.8 ± 66.0**** | 88.2 ± 6.0**** |
| 中药阳性对照组 | — | 967.7 ± 49.9****# | 66.3 ± 6.1****#### |
| 西药对照组 | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
表3： 各组血清P1NP和CTX-1水平（每组n=10，均值±标准差）。 ** = p <0.01，**** = p <0.0001，与模型组比较；# = p <0.05，## = p <0.01，### = p <0.001，#### = p <0.0001，与ZGP组比较（Bonferroni校正）。ZGP组P1NP与模型组相比的95%置信区间：210.3–327.5 pg/mL。
| 结果 | 因素 | df | F | p值 | 偏η² |
| P1NP (pg/mL) | 阴 (I) | 2, 81 | 17.84 | <0.001 | 0.31 |
| 阳 (A) | 2, 81 | 6.22 | 0.003 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 57.21 | <0.001 | 0.74 | |
| BMD (mg/cm³) | 阴 (I) | 2, 81 | 31.90 | <0.0001 | 0.44 |
| 阳 (A) | 2, 81 | 28.70 | <0.0001 | 0.41 | |
| I × A | 4, 81 | 24.60 | <0.0001 | 0.55 | |
| CTX-1 (ng/mL) | 阴 (I) | 2, 81 | 14.22 | <0.001 | 0.26 |
| 阳 (A) | 2, 81 | 5.88 | 0.004 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 19.43 | <0.001 | 0.49 |
表4： 三乘三因子方差分析的主效应与交互作用项，以及经Bonferroni校正的事后比较。 效应量以偏η²（partial eta-squared）表示。df 表示自由度。
补充表1. 蛋白质印迹抗体信息。 该表格列出了本研究中所用一抗和二抗的靶蛋白、观察到的分子量、供应商、目录号、宿主物种以及工作稀释倍数。请点击此处下载该文件。
补充代码文件1. 支持本研究的原始实验数据。 该压缩包包含用于生成本文所述结果的原始数据文件，包括个体骨密度（BMD）测量值、ELISA原始数据、RT-qPCR的Ct值及扩增曲线和熔解曲线输出结果、原始Western blot图像及密度分析文件、代表性组织学显微图像，以及与这些实验相关的仪器生成的输出文件。请点击此处下载该文件。
讨论
析因交互项支持ZGP中滋阴与助阳组分之间存在非相加性关系。该结果与传统“阴中求阳”原则一致，即助阳组分可激活或增强滋阴基础方的作用15。此发现应被理解为制剂水平的药理学协同效应，但并未鉴定出产生该效应的单个活性成分。
EphB4 和 ephrinB2 是成骨细胞-破骨细胞偶联的生物学上合理的介导分子3,4，但目前的证据仅为相关性。观察到 EphB4、ephrinB2 和 ALP 随 RhoA 下调而升高，这与偶联功能改善相一致，但尚不能证明该通路对 ZGP 的作用是必要或充分的。需要通过通路抑制剂、抗 EphB4 或阻断 ephrinB2 的方法、RhoA/ROCK 调控16、基因敲低以及成骨细胞-破骨细胞共培养实验来验证其因果依赖关系。
临床转化需要谨慎。大鼠与人等效剂量的换算可支持初步的剂量推算，但人体给药还需进行药代动力学、药效动力学以及长期安全性研究。一种标准化的ZGP产品需要进行HPLC或LC-MS化学图谱分析、标志化合物限量控制、批间一致性比较、污染物检测，并记录药材来源、提取、浓缩及生产工艺17。监管层面的转化还必须考虑其成分之间的相互作用、与现有抗骨质疏松药物的配伍兼容性，以及骨折减少等临床结局指标，而不仅仅是骨密度（BMD）的变化。
本研究存在若干局限性。卵巢切除大鼠模型会引起雌激素的急剧撤退，无法完全模拟人类的更年期、衰老、免疫调节、寿命、共病情况或长期的骨重建动态18,19。观察到的结果可能受到全身内分泌效应的影响，因此不应假设为骨细胞的直接信号传导。由于未进行通路抑制或基因敲低实验，无法提出因果性的机制结论。缺乏高效液相色谱（HPLC）或液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析，限制了实验的可重复性，也无法将效应归因于特定成分。未对松质骨显微结构进行定量评估。未来的研究应结合显微CT或定量组织形态学分析，包括骨体积/组织体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁间距（Tb.Sp），以更全面地评估骨结构变化20。草药批次间的变异性、提取工艺以及质量控制要求仍是重要的转化障碍。
在卵巢切除诱导的绝经后骨质疏松症大鼠模型中，全方左归丸与骨密度改善、有利的骨转换血清标志物以及EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP通路标志物的协调变化相关。三乘三析因分析支持滋阴与助阳组分之间存在协同作用，这与传统方剂配伍理论一致。这些数据支持进一步研究左归丸作为治疗绝经后骨质疏松症的多靶点候选药物，但在得出机制性或转化性结论之前，仍需开展抑制剂研究、基因沉默实验、成骨细胞-破骨细胞共培养、化学成分分析、定量骨微结构分析、药代动力学研究、长期安全性测试以及临床试验。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由内蒙古自然科学基金（项目编号：2025LHMS08047）、内蒙古医科大学一般项目（项目编号：YKD2025MS015）以及内蒙古医科大学博士启动基金（项目编号：YKD2023BSQD007）资助。资助方在研究设计、数据收集、分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥作用。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1% 氨水 | N/A | N/A | 苏木精染色分化后的蓝化溶液。 |
| 1% 盐酸酒精 | N/A | N/A | 苏木精染色的分化液。 |
| 2x qPCR Mix | N/A | N/A | 定量 PCR 预混液。单次反应体系体积：12.5 uL。 |
| 4% 多聚甲醛溶液 | N/A | N/A | 用于左股骨和胫骨样本的组织学分析固定。 |
| 5x 上样缓冲液 | N/A | N/A | 电泳前样本变性。 |
| ALP 一抗 | Affinity Biosciences | N/A | Western blot 抗体。原始稀释比例：1:2000。JoVE 要求提供 RRID 和批号。 |
| ALP 引物对 | N/A | N/A | ALP mRNA 通过 qRT-PCR 检测，但原始引物表格未提供 ALP 引物序列。需作者确认。 |
| 生物素标记抗体试剂 | 随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei | 试剂盒组分 | ELISA 实验中加入样本孔。 |
| 马鹿角胶，鹿角胶 | 北京同仁堂 | N/A | 补阳成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。将胶烊化后加入煎剂。 |
| 中华鳖甲胶，龟板胶 | 北京同仁堂 | N/A | 滋阴成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。将胶烊化后加入煎剂。 |
| 氯仿 | N/A | N/A | RNA 提取过程中的相分离。 |
| 冷却台 | Leica | 1150 | 切片流程中的冷冻或冷却支持装置。 |
| 山茱萸，山茱萸 | 北京同仁堂 | N/A | 滋阴成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。 |
| 南方菟丝子，菟丝子 | 北京同仁堂 | N/A | 补阳成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。 |
| 川牛膝，川牛膝 | 北京同仁堂 | N/A | 滋阴成分。原始完整处方剂量：9 g，比例 3。 |
| DEPC 处理的 PBS | N/A | N/A | 液氮速冻前对 L4 至 L5 腰椎进行冲洗。 |
| 己烯雌酚 | N/A | N/A | 西药阳性对照。原始剂量：0.04 mg/kg/天，1 mL/100 g/天。原始文献中存在中文命名不一致问题，应统一为“己烯雌酚”。 |
| 山药，怀山药 | 北京同仁堂 | N/A | 滋阴成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。 |
| dNTP 混合物 | N/A | N/A | 逆转录反应中包含。 |
| ECL 化学发光试剂 | N/A | N/A | Western blot 检测试剂。 |
| ELISA 显色试剂 A | 随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei | 试剂盒组分 | ELISA 显色试剂。 |
| ELISA 显色试剂 B | 随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei | 试剂盒组分 | ELISA 显色试剂。 |
| ELISA 终止液 | 随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei | 试剂盒组分 | 用于终止 ELISA 显色反应。 |
| 酶标 ELISA 试剂 | 随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei | 试剂盒组分 | 加入 ELISA 非空白孔中。 |
| EphB4 一抗 | Proteintech | N/A | Western blot 抗体。原始稀释比例：1:2000。JoVE 要求提供 RRID 和批号。 |
| EphB4 引物对 | N/A | PCR 产物 232 bp | 上游引物 CTAGACTCTTTCCTGCGGCT；下游引物 GGGAACTTGTGTAGGTGGGA。原始表格中“Rat RphB4”应为“Rat EphB4”，属笔误。 |
| ephrinB2 一抗 | Affinity Biosciences | N/A | Western blot 抗体。原始稀释比例：1:2000。JoVE 要求提供 RRID 和批号。 |
| ephrinB2 引物对 | N/A | PCR 产物 172 bp | 上游引物 CGGACAAGGCCTGGTACTAT；下游引物 ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT。 |
| 乙醇，无水及梯度浓度 95%、85%、75% | N/A | N/A | 苏木精-伊红染色过程中的梯度脱水与复水。 |
| 雌性 Sprague-Dawley 大鼠 | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | 原始文献未提供动物合格证及许可证号 | 无特定病原体级，6 月龄，健康未孕雌性。中文原文体重为 230 至 270 g；早期英文草稿为 220 至 250 g。提交前需确认最终体重范围。 |
| GAPDH 一抗 | Servicebio | N/A | 上样对照抗体。原始稀释比例：1:2000。JoVE 要求提供 RRID 和批号。 |
| GAPDH 引物对 | N/A | PCR 产物 253 bp | 上游引物 ACAGCAACAGGGTGGTGGAC；下游引物 TTTGAGGGTGCAGCGAACTT。 |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad Software | 版本 9.4.1；RRID:SCR_002798 | 统计分析与作图。输出文件中应保留正态性检验、方差齐性、ANOVA、Bonferroni 校正及效应量。 |
| 骨疏康颗粒 | 辽宁沃华康辰药业有限公司 | N/A | 中药阳性对照。原始剂量：1.8 g/kg/天 或 0.5 mL/100 g/天。 |
| 苏木精染色液 | 珠海贝索生物技术有限公司 | N/A | 组织学染色。原始操作使用 5 分钟苏木精染色。 |
| 高速微量离心机 | N/A | TG16W | 用于血清和核酸实验的离心。 |
| Hologic 双能 X 射线吸收仪 | Hologic | N/A | 骨密度分析。原始文献报告了股骨的体内和体外扫描。 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | RRID:SCR_003070 | Western blot 条带的密度定量分析。原始文献未提供版本号。 |
| 电磁炉 | 美的 | N/A | 列于中文原始仪器表中。 |
| 异氟烷 | N/A | N/A | 双侧卵巢切除术和 DXA 定位的麻醉剂。修订后的方案应明确诱导、维持、给药途径及麻醉深度标准。 |
| 异丙醇 | N/A | N/A | RNA 提取过程中的沉淀剂。 |
| 液氮 | N/A | N/A | 腰椎样本的速冻处理。 |
| 枸杞子，枸杞子 | 北京同仁堂 | N/A | 滋阴成分。原始完整处方剂量：12 g，比例 4。 |
| 酶标仪 | N/A | AMR-100 | ELISA 在 450 nm 处检测吸光度。 |
| 洗板机 | N/A | APW-200 | ELISA 板的洗涤步骤。 |
| MMLV 逆转录酶 | N/A | N/A | 逆转录酶。 |
| 中性封片胶 | 国药集团 | N/A | 苏木精-伊红染色切片的封片介质。 |
| 生理盐水 | N/A | N/A | 空白对照组、假手术组和模型组的灌胃溶媒。 |
| Oligo(dT)18 引物 | N/A | N/A | 用于逆转录。 |
| 青霉素 | N/A | N/A | 术后感染预防。原始剂量：20,000 U/kg 肌内注射，连续 3 天。 |
| 高压锅 | 新飞 | N/A | 列于中文原始仪器表中。 |
| 蛋白酶抑制剂 | N/A | N/A | 蛋白提取过程中添加。 |
| 蛋白裂解缓冲液 | N/A | N/A | 用于骨组织蛋白提取以进行 Western blot。 |
| PVDF 膜 | N/A | N/A | 经甲醇活化的 Western blot 转膜膜。 |
| qRT-PCR 仪 | N/A | N/A | 用于 EphB4、ephrinB2、RhoA、ALP 和 GAPDH 的定量逆转录 PCR。 |
| 大鼠 CTX-1 ELISA 试剂盒 | Jiyinmei | JYM0026Ra | 用于血清 I 型胶原 C 端肽的夹心 ELISA。检测波长 450 nm。 |
| 大鼠 P1NP ELISA 试剂盒 | Jiyinmei | JYM0030Ra | 用于血清 I 型前胶原 N 端前肽的夹心 ELISA。检测波长 450 nm。 |
| 熟地黄，熟地黄 | 北京同仁堂 | N/A | 滋阴成分。原始完整处方剂量：24 g，比例 8。 |
| RhoA 一抗 | Proteintech | N/A | Western blot 抗体。原始稀释比例：1:2000。JoVE 要求提供 RRID 和批号。 |
| RhoA 引物对 | N/A | PCR 产物 177 bp | 上游引物 GTTTATGTGCCCACGGTGTT；下游引物 ACTATCAGGGCTGTCGATGG。术语已从 RHoA 统一为 RhoA。 |
| RNase 抑制剂 | N/A | N/A | 包含在逆转录反应中。 |
| 无 RNase 水 | N/A | N/A | RNA 干燥后溶解用。 |
| 旋转式切片机 | Leica | 2245 | 组织学切片。 |
| Western blot 二抗 | N/A | N/A | 原始稀释比例：1:15000。JoVE 要求提供宿主反应性和 RRID。 |
| 5% 脱脂奶粉 | N/A | N/A | Western blot 封闭试剂，室温封闭 2 小时。 |
| 载玻片展片与烘片机 | 金华亿迪 | N/A | 组织学载玻片制备。 |
| 3% 戊巴比妥钠 | N/A | N/A | 中文原始文献中用于腹主动脉采血前的终末麻醉。最终安乐死程序及确认方法需核实。 |
| 标准品稀释液 | 随 ELISA 试剂盒提供，Jiyinmei | 试剂盒组分 | ELISA 实验中用于标准品的系列稀释。 |
| TBST 缓冲液 | N/A | N/A | Western blot 洗涤缓冲液。 |
| 恒温振荡培养箱 | 上海一恒科学仪器有限公司 | N/A | 实验室培养与振荡。 |
| TRIzol 试剂 | N/A | N/A | 从 100 mg 骨组织中提取 RNA。 |
| 正置显微镜 | Leica | DM1000 | 苏木精-伊红组织学图像采集，放大倍数 200x。 |
| 水套式恒温培养箱 | N/A | GNP-9080 | 实验步骤中的恒温培养。 |
| 水溶性伊红染色液 | 珠海贝索生物技术有限公司 | N/A | 组织学复染剂。原始操作使用 3 分钟伊红染色。 |
| Western blot 电泳系统 | N/A | N/A | 蛋白分离。原始电泳条件：初始 80 V，随后 120 V。 |
| Western blot 成像系统 | N/A | N/A | 化学发光膜成像。提交时需提供未裁剪的完整膜图像。 |
| Western blot 转膜系统 | N/A | N/A | 蛋白转移至 PVDF 膜。原始转膜条件：400 mA，90 分钟，冰浴。 |
| 二甲苯 | N/A | N/A | 组织学中的脱蜡与透明处理。 |
| 左归丸组方药材 | 北京同仁堂 | N/A | 八味药材配方：熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、中华鳖甲胶、川牛膝、南方菟丝子和马鹿角胶。 |
参考文献
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